Summary
このプロトコルは、海水および生物学的標本中の脂質の決定のためのものです。濾液中の脂質は、固形物の場合にはクロロホルムまたはクロロホルムとメタノールの混合物で抽出される。脂質クラスは、炎イオン化検出を用いたロッド薄層クロマトグラフィーで測定され、その合計が総脂質含有量を示します。
Abstract
脂質は主に炭素と水素で構成されており、海の他の有機高分子よりも大きな特定のエネルギーを提供します。炭素と水素が豊富であることも疎水性であり、有機汚染物質の溶媒および吸収キャリアとして機能し、海洋生態系における汚染物質の生物蓄積の原動力となり得る。その疎水性は海水または生物学的標本からの隔離を促進する:海洋脂質分析は、非極性有機溶媒のサンプリングと抽出から始まり、水生マトリックス内の他の物質から分離するための便利な方法を提供する。
海水がサンプリングされた場合、最初のステップは通常、濾過によって操作的に定義された「溶解」および「粒子状」の派閥への分離を含む。サンプルを収集し、サンプルマトリックスから分離された脂質は、通常、真に溶解した物質とコロイドのためのクロロホルムで、固体および生物学的標本のためのクロロホルムとメタノールの混合物で分離される。このような抽出物は、バイオジェニックおよび人為的な情報源からのいくつかのクラスを含んでいてもよい。このとき、総脂質及び脂質クラスが決定され得る。全脂質は、慣習的にクロマトグラメン的に分離された個別に決定された脂質クラスを合計することによって測定することができる。薄層クロマトグラフィー (TLC) と火イオン化検出 (FID) は、海洋試料からの脂質の定量分析に定期的に使用されています。TLC-FIDは、シノプティック脂質クラス情報を提供し、合計クラスにより、総脂質測定を行います。
脂質クラス情報は、脂質抽出物からの放出後に、個々の成分、例えば脂肪酸および/またはステロールの測定値と組み合わせる場合に特に有用である。脂質の構造と機能の多種多様は、生態系の健康と人類起源の影響による影響度を評価する生態学的および生物地球化学的研究で広く使用されていることを意味します。これらは、海洋動物相(例えば、水飼料および/または獲物)に対する食事価値の物質を測定し、水質(例えば炭化水素)の指標として使用されてきた。
Introduction
ここで説明する方法は、海洋脂質として運用上定義される物質に関するものです。この定義は、非極性有機溶媒中の液体-液体抽出に対する無邪気さに基づいており、水生マトリックス内の他の物質から分離するための便利な方法を提供します。その疎水性は海水や生物学的標本からの隔離、濃縮、塩やタンパク質の除去を促進します。
海洋生物における脂質含有量の測定と構成は、食品ウェブ生態学、養殖栄養学、食品科学に何十年も関心を集めてきました。脂質は、生体内の普遍的な構成要素であり、細胞膜に不可欠な分子として作用し、生体利用エネルギーの主要な供給源として、断熱性および浮力を提供し、シグナル伝達分子として機能する。他の分野における脂質決定の手順はよく説明されているが、海洋サンプルでのそれらの使用は、一般に、試料タイプ1だけでなく、フィールド条件に適応するための修飾を必要とする。
海水サンプルの場合、最初のステップは通常、通常、濾過によって、操作的に定義された「溶解」および「微粒子」分数に分離する必要があります(プロトコルステップ1)。粒子状分率は、フィルターによって保持されるものであり、そして、細孔のサイズは、カットオフ2を定義する上で重要である。多くの場合、粒子状物質をサンプリングする際には、脂質濃度を総質量濃度に関連付けたいが、その場合は別の小さなサンプル(例えば、10mL)をこの目的のために採取しなければならない(プロトコルステップ1、注)。正確な質量決定を得るためには、濾過の終わりにアンモニウムのギマ質(35 g/L)を加えることを重要である。
大きいサンプルからの海水の濾液は、サンプルの種類に応じて250mLと1Lの間に量り、セパレート漏斗で液体液体抽出を行う必要があります(プロトコルステップ2)。脂質の疎水性の性質は、クロロホルムなどの非極性溶媒で抽出することによって他の化合物から分離できることを意味する。2層システムは、水溶性成分が水層に留まる間、脂質が有機層に分け込む場所に作成されます。
フィルター上の粒子状サンプル、または生物学的標本は、クロロホルムを含む改変Folchら抽出3で抽出される(プロトコルステップ3)。再び、脂質が有機相に分かれ、水溶性分子が水相に残り、タンパク質が沈殿する有機/水系が作られます。実際、固体の場合、ほとんどの実験室は、クロロホルムおよびメタノールを含むFolchら抽出3 手順のいくつかのバリエーションを使用する。フィルターの場合、最初のステップは、2 mLのクロロホルムと1 mLのメタノールで均質化することです。
抽出中は、エステル結合加水分解や炭素炭素二重結合酸化を減らすために氷上にサンプルや溶媒を保持することによって、化学的または酵素的修飾から脂質を保護するために注意する必要があります。組織および細胞脂質は、天然の抗酸化物質によって、そして区画化4によってかなりよく保護されている。しかし、サンプルの均質化に続いて、細胞内容物は、化学的または酵素的に、より変化するために配置された脂質をレンダリングして結合される。ほとんどのステロールのようないくつかの脂質は非常に安定であり、多価不飽和脂肪酸を含むものは化学的酸化の影響を受けやすいものもある。他の他の,二重結合を伴うステロールのような,光5によって触媒される酸化を起こしやすい。抽出後、脂質は化学酸化の影響を受けやすく、サンプルは窒素などの不活性ガスの下に保管する必要があります。窒素の穏やかな流れはまた、抽出物を濃縮するために使用されます。
濃度の後、脂質は通常、炭水化物やタンパク質のkJ/gの2倍以上の高濃度エネルギーを提供する海洋生態系の重要な構成要素であるため、一括で定量化されます。脂質の包括的な分析は、一般的に、その化学的性質に応じて、より単純なカテゴリに分離することを含む:彼らは常に個々の成分として定量化されます。したがって、完全な分析は、総脂質、脂質クラスおよび個々の化合物を測定することを含む。
全脂質は、クロマトグラフィー6で分離された個別に測定された脂質クラスの合計を取ることによって決定することができる。海洋脂質抽出物は、生物起源および人為的な情報源から12以上のクラスを含んでいてもよい。脂質構造の多種多様は、構造の個々のグループを決定することによって多くの情報を得ることができることを意味します。脂質クラスは、個々に、または特定のグループにおいて、特定の種類の生物の存在を知らせるために使用されてきただけでなく、それらの生理学的状態および活性2。また、溶存有機物(DOM)や疎水性汚染物質を含む有機材料の起源の指標としても使用されています。
トリアシルグリセロール、リン脂質およびステロールは、より重要なバイオジェニック脂質クラスの一つです。最初の2つは、2~3種類の脂肪酸がエステル化されるグリセロール骨格を有するので生化学的に関連している(図1)。トリアシルグリセロールは、ワックスエステルとともに非常に重要な貯蔵物質であり、ジアシルグリセロール、遊離脂肪酸、モノアシルグリセロールなどの他の脂肪酸含有脂質クラスは、一般的にマイナーな成分である。遊離脂肪酸は生物の低濃度で存在し、不飽和脂肪酸は毒性7であり得る。ステロール(自由およびエステル化された形態の両方)および脂肪アルコールは、より少ない極性脂質の中に含まれ、糖脂質およびリン脂質は極性脂質である。極性脂質は、細胞膜に見られる脂質二重層の形成を可能にする親水性基を有する。遊離ステロールは膜構造成分も、トリアシルグリセロールに対する比率で取られた場合、それらは、広く使用されている条件または栄養指数(TAG:ST)8を提供する。リン脂質に対する比率(ST:PL)を摂取すると、塩に対する植物感受性を示すために使用され得る:より高い値は構造的完全性を維持し、膜透過性を低下させる9。この比の逆(PL:ST)は、温度適合10の間に二枚貝組織で研究されている。
海洋脂質クラスは、シリカゲルコーティングロッド上の薄層クロマトグラフィー(TLC)で分離することができ(プロトコルステップ4)、自動FIDスキャナで炎イオン検出(FID)によって検出および定量化されます。TLC/FIDは、小さなサンプルからシノプティック脂質クラスデータを迅速に提供し、全クラスの合計を取ることによって、総脂質の値を取得する海洋サンプルに日常的に使用されるようになってきた。TLC/FIDは品質保証(QA)評価を受けており、一貫した外部キャリブレーション、低ブランク、および正確な複製分析11に必要な基準を満たすことが判明した。変動係数(CV)または相対標準偏差は約10%であり、FIDスキャナ総脂質データは、通常、重量測定および他の方法2で得られたデータの約90%である。重量測定は、FIDスキャナが非揮発性化合物のみを測定し、また重量測定に非脂質物質を含む可能性のある結果として、より高い総脂質を与える可能性が高い。
脂質クラス分析によって提供される情報は、脂肪酸を個体として、ステロール、または2つを組み合わせて組み合わせた場合に特に有用である。これらの分析に向けた最初のステップは、脂質抽出物中のステロールと一緒にすべての成分脂肪酸の放出を含む(プロトコルステップ5)。脂質の構造と機能の多種多様は、生態系の健康とそれらが人類起源および地上の入力によってどの程度影響を受けているかを評価する生態学的および生物地球化学的研究で広く使用されていることを意味します。これらは、海洋動物相に対する食事価値の物質の生合成を測定し、水のサンプルの品質を示すために使用されています。堆積物コアサンプルの脂質を測定することは、陸海の近くの人間の土地利用の変化に対する堆積物の感受性を示すのに役立ちます。
個々の脂質化合物を同定・定量するための主要なツールは、従来、FIDを有するガスクロマトグラフィー(GC)であった。しかし、分析の前に、これらの化合物は誘導体化によってより揮発性に作られる。脂肪酸は、アシル脂質クラスから酸性触媒(H2SO4)の存在下で放出される(図1)。有機化学では、アシル基(R-C=O)は、通常カルボン酸(R-COOH)に由来する。その後、GCカラム上でより良い分離を与える脂肪酸メチルエステル(FAME)に再エステル化されます(プロトコルステップ5)。
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Protocol
注:脂質分析用のガラス製品、器具、フィルターを洗浄するには、メタノールで3回洗浄し、クロロホルムで3回洗浄するか、少なくとも8時間450°Cに加熱します。
1. 海水溶解・粒子状脂質の濾過手順
注: 関心のある特定の部分は、操作上、ろ過手順によって定義されます。この場合、細孔のサイズは1.2 μmです。
- ろ過マニホールドをフィルターなしで設定し、ろ過された海水でセットアップをすすいします。
- クリーンな鉗子を使用して、洗浄された47mmガラス繊維(GF/C)フィルターをクリーン濾過システムに配置します。
- サンプルを取り、回収容器の底に落ち着いた可能性のある材料を再中断するためにそっと旋回します。既知のボリューム(この場合は1 L)を正確に測定し、これをフィルタでフィルタリングします。
注:体積はサンプル中の粒子状物質の量に依存します:通常、季節や場所に応じて250 mLと5 Lの間です。 - サンプルを測定したら、ろ過された海水でフィルターを静かに濡らします。サンプル全体をろ過システムにゆっくりと加え、水浸しの海水で段階的なシリンダーをすすいで、すべての粒子がフィルターに追加されるようにします。側面にろ過された海水でセットアップをすすいで、すべての粒子がフィルターの上にすすい込まれるようにします。
- すべての海水がフィルターを通過することを許可しますが、フィルターのセルを破壊する可能性がありますので、フィルターを完全に乾燥させないでください。水の最後が消えると吸引を破る。
- きれいな鉗子およびきれいなピペットを使用して、フィルターを半分に折り、次に3分の1で、そして半分の縦に縦にフィルターをチューブに転がす。10 mLガラスのバイアルとラベル付けされた清潔な場所に入れます。
- フィルターに2 mLのクロロホルムを覆います。ヘッドスペースに窒素を充填し、PTFEテープでシールします。ラックに入れるのは-20°Cの冷凍庫です。サンプルは、この温度で1年まで安定します。
注:脂質濃度を総質量濃度に関連付けるには、乾燥重量測定も必要です。これは、乾燥重量のろ過セットアップに24ミリメートルの事前計量フィルターを入れて、サンプルをかき混ぜ、小さなフィルターにろ過される小さなサブサンプルを取ることを含みます。フィルターがほぼ乾燥すると、約10mLの3.5%アンモニウム・フォーマットがフィルターに加えます。フィルターは半分に折り畳まれ、ラベル付きのペトリ皿に戻され、冷凍庫に入れられます。
2. 海水または液体サンプルの液体-液体抽出
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サンプルの準備
- 脂質クリーンガラスの段階的なシリンダーに濾過の既知の体積を測定します。このサンプルをクリーンな 1 L セパネルに入れ、その後、サンプルにクロロホルムの20 mLを加え、2分間振り、頻繁に通気します。
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最初の抽出物の除去と、最初の分離後の酸の添加
- アルミホイルで漏斗を包み、分離が起こるまで5〜10分待ちます。ホイルの底を剥がして2つの層を見ます。底部の有機層をストップコックを通してきれいな丸底フラスコに集め、最上層を含めないように注意してください。丸底のフラスコを窒素の下にかぶせ、冷凍庫に入れる。
- サンプルの1リットルごとに0.25mLの濃縮H2SO4 を加え、セパレート漏斗のサンプルに加え、漏斗を穏やかに振ります。
- クロロホルムを10mL加え、頻繁に通出しながら2分間激しく振ります。分離を行います。
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第2および第3の分離
- 分離を待ち、底の層を丸底フラスコに加えます。
- クロロホルムの3番目の10 mLを加え、2分間振り、再び頻繁に通気します。分離後、底面の丸いフラスコに底の層を加えます。
- 丸底フラスコの抽出物をロータリーエバポレーターに移し、蒸発させて2mLバイアルに移します。
3. 固体抽出プロトコル(修正されたFolchら3 抽出)
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セットアップ
注: 抽出のセットアップには、氷で満たされた絶縁された容器が必要です。溶媒としては、メタノール、クロロホルム抽出水、2:1クロロホルム:メタノールが含まれる。抽出が開始されるまでに冷たくなるように、すべての溶媒を氷の上に置く必要があります。サンプルも氷の上に行くので、すべてが冷たいままです。- すべてのチューブとPTFEの裏地キャップをメタノールで3回、クロロホルムで3回リンスします。1つの抽出には、1つの遠心管とキャップ付きの15 mLバイアルが必要です。
- 2 mLのクロロホルムを含む遠心管にサンプルを入れる。試料の大きさは、存在する脂質の量に依存し、脂質の約5〜10mgが好ましい。
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研削および抽出
- 約1mLの氷冷メタノールを加え、きれいなホモジナイザーまたはPTFE/金属エンドロッドでサンプルを素早くパルプに粉砕します。
- 約1mLの氷冷2:1クロロホルムでロッドをチューブに洗い戻し、メタノールを使用し、氷冷クロロホルム抽出水1/2mLで洗浄します。必要に応じて、洗浄する前に、きれいな鉗子を使用して、粒子をバイアルに強制的に戻します。チューブをキャップし、超音波浴(35 - 42 kHz)で4分間混合物を超音波処理します。
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二重ピペット:1800× gで2分間サンプルを遠心分離します。電球を緩く押し込んだ5 3/4インチピペットが2層を軽く押し抜き、球根を圧迫し、泡が出る二重ピペット技術を使用して、有機層全体(底層)を収集します。
- 2 番目のレイヤーの底に達したら、親指を使用して、有機層をピペットに描画せずに電球を取り除きます。5 3/4インチの内側に9"ピペットを置き、5 3/4"ピペットを通して底層を取り除きます。
- きれいなバイアルに抽出物を置きます。一番下のレイヤーがすべて削除されるまで引き続き取り外します。
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洗浄ピペット:9インチピペットを、1.5mLの氷冷クロロホルムを使用してピペットの外側を洗い流し、1.5mLで内部を洗い流す有機層を含むバイアルにリンスします。洗濯中にそのピペットをそっと回し、すべてのクロロホルムがピペットをバイアルに流すことを確認します。
- 5 3/4インチピペットを水性層を含むチューブに同じようにリンスします。
- ソニックエートと遠心分離すると、毎回新しいピペットを使用して、分離時にサンプルと二重ピペット。少なくとも 3 回繰り返し、すべての有機層をプールします。有機層を3回目に除去した後、両方のピペットを有機層を含むバイアルに洗浄する。
- 窒素の穏やかな流れを使用して、ボリュームに集中し、PTFEテープで密封し、冷凍庫に保管します。
4. 海洋脂質クラスのロッドTLC分離のためのシステムとステップの開発
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TLC用ロッドの準備
- 自動FIDスキャナのロッドを3回スキャンするブランク
- サンプルを見つける: サンプルと標準を注射器で、原点のすぐ下のロッドに適用します。0.5 μL を分配し、ロッドにドロップをタッチします。次のドロップを同じ場所に置く前に乾燥させます。ロッド上のラインですべてのサンプルを見つけます。
- アセトンに焦点を合わせる: 70 mLのアセトンで2回(サンプルが非常に濃縮されている場合は3回)焦点を合わせる。スポットの底が上部に合流するまでロッドを登る際に、溶媒の前線を見てください。ロッドを取り外し、5 s前後で乾燥させてから、ロッドの底部近くに狭い脂質材料のバンドを作り出す手順を繰り返します。
- 乾燥し、5分間一定の湿度チャンバーでロッドを調整します。一定の湿度チャンバは、プレートの下に塩化カルシウムの飽和溶液を有するデシケータである。
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第1クロマトグラムに導く配列(ケトンに炭化水素)
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最初の開発システム: 最初の開発システムはヘキサン:ジエチルエーテル:ギ酸、98.95:1:0.05です。シリンジを使用してギ酸を加えますが、最初にギリンジ3×をギ酸ですすいます。その直後にクロロホルムでシリンジからギ酸をリンスします。30 mLの混合物を使用して紙を濡らし、タンクをすすきます。すすべ液を捨て、残りの70mLをタンクに加えます。
- ラックを取り、タンクにそっと下げます。溶媒の前部がサンプルのスポットに達するまで見て、タイマーを開始します。25分後、現像チャンバーからロッドを取り出し、一定湿度チャンバーで5分間乾燥し、同じ溶液で20分間再開発します。
- 自動FIDスキャナでロッドを5分間乾燥させ、PPSスキャン25を使用してケトンピークの後ろの最低点までスキャンします。
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最初の開発システム: 最初の開発システムはヘキサン:ジエチルエーテル:ギ酸、98.95:1:0.05です。シリンジを使用してギ酸を加えますが、最初にギリンジ3×をギ酸ですすいます。その直後にクロロホルムでシリンジからギ酸をリンスします。30 mLの混合物を使用して紙を濡らし、タンクをすすきます。すすべ液を捨て、残りの70mLをタンクに加えます。
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第2のクロマトグラムにつながる配列(チアシルグリセロールからジアシルグリセロールへ):
- 一定湿度チャンバで5分間ロッドを調整します。
- 第二の開発システム: 第二の開発システムはヘキサン:ジエチルエーテル:ギ酸、79:20:1です。開発タンクに約30mLを加えて、紙を濡らし、タンクをすすきます。その後、残りの70 mLで40分間ロッドを廃棄し、開発します。TAG(飽和)とTAG(多価不飽和)の間の最良の分離のために、79.9:20:0.1の混合物を使用しますが、STとDAGのピークの分離には79:20:1の混合物を使用します。
- 乾燥し、PPSスキャン11を用いて第2の部分スキャンでジアシルグリセロールピークの後ろの最低点までスキャンする。
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第3クロマトグラム(アセトン移動性極性脂質およびリン脂質)に至る配列
- 一定の湿度チャンバで5分間ロッドを調整します。
- アセトンの70 mLで15分間ロッドを2回現像します。開発の間に約30秒間ロッドを乾燥させます。
- 一定の湿度チャンバで5分間ロッドを調整します。
- 第3の開発システム:第3の開発システムは、クロロホルム、メタノール、クロロホルム抽出水の混合物である50:40:10。混合物の70 mLで10分間ロッドを2回開発します。開発の間に、空気は約30秒間ロッドを乾燥させます。
- ロッドの全長を乾燥してスキャンします。
5. MeOH で H2SO4 を使用した FAME 誘導体化
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ヒルディッチ試薬を作る
- メタノールの準備:清い容積フラスコにMeOHの100 mLを置き、フラスコの底部が覆われるまで無水NaSO4 にそっと振りかけます。一度覆われた後、メタノール中の水がNaSO4によって吸収されるように2回反転する。反転して振った後、少なくとも5分間座らせます。
- 酸の添加: ゆっくりとガラス瓶にメタノールをデカントし(現在ではNaSO4はフラスコの底に硬い塊)、H2SO4が追加されます。ピペットを使用してメタノールに1.5mLの硫酸をゆっくりと加えます。一度に数滴を加え、すべての酸を加えたらキャップし、軽くかき混ぜて混ぜます。このソリューションはデリバティブに使用する準備が整いましたが、週単位で作成する必要があります。
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デリバティブの作成
- 約200μgの脂質を、体積が既知の量まで持ち上げた抽出バイアルから、清潔な15mLバイアルに移し、窒素下で蒸発して乾燥します。除去される量は、TLC/FIDからのサンプルの濃度によって決定されます。きれいなピペットを使用してサンプルを取り外します。
- 試料が乾燥したら、1.5mLのジクロロメタンと3mLの新作のヒルディッチ試薬を加えます。
- 試料を渦液にし、4分間超音波浴で超音波処理し、ガラスバイアルに付着した脂質を除去します。バイアルに窒素、キャップを入れ、PTFEテープで密封し、100°Cで1時間加熱します。
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反応を停止する
- オーブンから取り出した後、サンプルを室温まで10分間完全に冷却し、バイアルを慎重に開けます。
- 約0.5mLの飽和炭酸水素ナトリウム溶液(9 g/100 mLクロロホルム抽出水)をゆっくりと加え、1.5 mLヘキサンを加えます。バイアルを振るか渦を振り、2つの層に分けることができるように立たせます。
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名声の収集
- 最上層の除去:誘導体化が停止し、明確な分離が発生したら、上部、有機相を除去し、脂質クリーン2mLバイアルに入れます。
- 2 mL バイアルの溶媒を蒸発させて乾燥させ、ヘキサンを約 0.5 mL にリフィルします。
- バイアルのヘッドスペースに窒素を充填し、PTFEテープでバイアルをキャップしてシールし、さらに4分間超音波処理して脂肪酸を再中断し、GCに行く準備が整います。
注:脂肪酸濃度が必要な場合、水層はヘキサンで3回洗浄し、すべての有機層を2mLバイアルにプールする必要があります。これは、2 mLのヘキサンを添加し、試料をボルテックスし、遠心分離し、有機層を除去し、すべて3回繰り返す。
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Representative Results
最も急成長している食品生産部門として、養殖は技術革新と適応の面で進化し、変化する要件を満たしています。その一つは、多くの養殖種に飼料成分を提供する野生産魚粉や魚油への依存を減らすことです。陸上植物油は、水飼料中の魚油の持続可能で経済的な代替品として調査されており、肝臓は脂質代謝の主要部位であるため分析の標的組織である。 図2 は、私たちの9成分標準から得られた生のTLC-FIDクロマトグラム、魚油を7%、菜種油を5%で配合した食事、そして大西洋サケから肝臓組織がその食事を与えた。 表1 は、異なる魚類からの食事複製およびサンプルを分析した後に得られたデータを示す。これらのデータは、ピークシンプルソフトウェア(バージョン4.54)を使用して抽出物中の脂質クラスを定量化するためにスキャナFID応答から標準曲線を構築した後に得られた。データは、食事と肝臓におけるトリアシルグリセロールの有病率と肝臓における膜リン脂質の重要性を示しています。
大陸のマージンは一般的に非常に高い生物学的生産性を備えており、炭素のサイクリングにおいて特に重要です。表面の一次生産性は浅い水の中で海底に到達するので、上部混合層から底質食品ウェブに沈降する粒子の量と質を測定することは大きな関心事です。炭素が豊富で、エネルギー含有量が非常に高いため、脂質は大陸棚の生産性の重要な構成要素です。歴史的にニューファンドランドとラブラドールに隣接する海域は、約5世紀にわたって世界で最も偉大な漁業の一つを支え、我々はこのシステム13で脂質の生産と移動を研究してきた。 図3 は、当社の標準から得られたTLC-FIDクロマトグラム、ニューファンドランド沖220mで採取した粒子状物質を沈降させる脂質、小さなマイシドの脂質、 エリスロップス・エリスロフタルが 同じ深度付近で採取した脂質を示しています。今回クロマトグラムはプロットソフトを通じて処理され、2つの部分スキャンが最終スキャンと組み合わされた。 表2 は沈降粒子状物質とmysidの複製サンプルを分析した後に得られたデータを示す。5系統から19系の中で、小さいマイシドは、平均して、最も高い脂質濃度(湿重量の6%)13を有していた。
図1:極性を高めるおおよその順序で海洋サンプル中の主な脂質クラス。 各構造は、図の右側を指す分子の最も疎水性の部分で描かれています。脂質クラスの代表的な化合物は:-炭化水素:ノナデカン;ワックスエステル: ヘキサデシルパルミテート;ステリルエステル:コレステリルパルミテット;メチルエステル: メチルパルミテート;ケトン: 3-ヘックスデカロン;トリアシルグリセロール: トリパルミチン;遊離脂肪酸:パルミチ酸;アルコール: 植物;ステロール: コレステロール;ジアシルグリセロール: ジパルミトイルグリセロール;モノアシルグリセロール: モノパルミトイルグリセロール;糖脂質: ジガラクシルジアシルグリセロール;リン脂質: ジパルミトイルホスファチジルコリン. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:養殖給餌実験による脂質組成物のTLC-FIDクロマトグラム 抽出物はシリカゲルコーティングされたTLCロッドに見られ、3段階の開発システムを使用して脂質クラスを分離した。第1および第2の開発システムは、オートマチックFIDスキャナーで走査するトリアシルグリセロール、遊離脂肪酸、ステロールなどの中性脂質を分離するために、ヘキサン:ジエチルエーテル:フォルミック酸(98.95:1:0.05)と(79.9:20:0.1)でした。第3の開発システムは、アセトン移動性極性脂質とリン脂質を分離するために、クロロホルム:メタノール:水(5:4:1)の前に100%アセトンで構成されていました。標準的な曲線(すなわち、ノナデカン、コレステリルパルミチン、3-ヘックスデカノン、トリパルミチン、パルミチン酸、セチルアルコール、コレステロール、モノパルミトイルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン)を用いて、ピークシンプルソフトウェア(version.4.54)を用いて抽出物中の脂質クラスを定量化した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:沿岸ニューファンドランドからの近底サンプルの脂質組成のTLC-FIDクロマトグラム a) 9成分標準, b) 220 m ミセプション湾、ニューファンドランド、c) マイシドの脂質クラスから粒子状物質を沈降,エリスロップサルマ.
| 魚油/菜種油ダイエット | 大西洋サーモン肝臓 | |
| 炭化 水素 | 1.3±0.9 | 0.5±0.2 |
| ステリルエステル/ワックスエステル | 0.4±0.6 | 0.6±0.3 |
| エチルエステル | 0 | 0 |
| メチルエステル | 0 | 0 |
| エチルケトン | 0 | 0.3±0.2 |
| メチルケトン | 0 | 0 |
| グリセリル・エーサーズ | 0 | 0 |
| トリアシルグリセロール | 145.0±26.3 | 16.9±8.1 |
| 遊離脂肪酸 | 21.9±2.2 | 1.2±0.9 |
| アルコール | 0 | 1.4±0.4 |
| ステロール | 6.8±2.1 | 2.6±0.2 |
| ジアシルグリセロール | 0 | 0 |
| アセトン移動極性脂質 | 14.0±2.5 | 2.2±0.6 |
| リン脂質 | 12.5±4.0 | 22.0±2.0 |
| 総脂質 | 201.8±27.4 | 47.7±11.8 |
表1:養殖給餌実験における脂質組成。 データは、6.80%の魚油と4.80%の菜種油を含む実験的食事(平均±標準偏差)であり、12週間この食事を与えた後の大西洋サケの肝臓(mgg -1ウェットウェイト)です。
| 粒子状物質の沈降 | エリスロップス・エリスロフタルマ | |
| ステリルエステル/ワックスエステル(総脂質% | 10.2±8.28 | 8.85±1.67 |
| トリアシルグリセロール(総脂質% ) | 19.7±5.35 | 58.5±9.19 |
| リン脂質 (総脂質% ) | 16.2 ± 3.51 | 21.4±5.35 |
| 中性脂質(総脂質% ) | 12.5±4.0 | 73.4±5.46 |
| リポリシス指数(%) | 18.1±5.20 | 2.77±2.78 |
| 総脂質 | 0.57±0.25 | 5.86±1.44 |
| 中性脂質: 炭化水素, ワックスとステリルエステル, ケトン, トリアシルグリセロール, 遊離脂肪酸;(FFA)、アルコール類(ALC)、ステロール類、ジアシルグリセロール類LI: 脂肪分解指数 [(FFA + ALC) (アシル脂質 + ALC)–1];総脂質(TLC/FID決定脂質クラスの合計)粒子状物質 - 乾燥重量%、マイシド -% ウェット重量 | ||
表2:沿岸ニューファンドランドからのボトム付近のサンプルの脂質組成 データは、受胎湾ニューファンドランドからの220mの沈降粒子状物質の(平均±標準偏差)であり、マイシドの エリスロップエリスロフタルマである。
脚注: 中性脂質: 炭化水素, ワックスとステリルエステル, ケトン, トリアシルグリセロール, 遊離脂肪酸;(FFA)、アルコール類(ALC)、ステロール類、ジアシルグリセロール類LI: 脂肪分解指数 [(FFA+ ALC) (アシル脂質 + ALC)-1];総脂質(FID決定脂質クラスの合計)粒子状物質 - %乾燥重量、マイシド-湿潤重量。
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Discussion
TLC-FIDシステムが小さいサンプルからのシノプティック脂質クラス情報を提供する速度は、TLC-FIDを海洋サンプルをスクリーニングするためのより複雑な分析手順を行う前に可能なツールにする。このような分析は、通常、ガスクロマトグラフィーの場合の揮発性を高めるために脂質抽出物および誘導体化からの成分化合物の放出を必要とする。GC-FIDと組み合わせたTLC-FIDは、魚介類および他の食品の抽出物のための強力な組み合わせであることが判明した14.海洋脂質分析を成功させるためには、サンプルが全体の劣化や汚染から保護され、ロッドへのサンプルの適用に細心の注意が払われていることが重要です。1つのアプローチは、マイクロキャピラリーピペット15を用いて海洋試料全体をロッドに適用するものであり、海洋試料タイプの革新は、海水サンプル16に海面マイクロ層およびエアロゾルサンプルを添加する。
自動スキャナのFIDシステムは、誘導体化やクリーンアップなしで迅速なマイクログラム定量を提供します。しかし、ガスクロマトグラフに見られるほど、敏感、精密、または線形ではありません。これは、較正曲線を構築する必要があり、時にはキャリブレーション範囲内で、より小さいと大きな脂質クラスのピークを維持するために、2つの異なる負荷でサンプルを分析する必要があることを意味します。
FIDスキャナで部分スキャン機能を使用することにより、複数のクラスの脂質を1つのサンプルアプリケーションからロッドに分離することができます。しかし、ケイ酸のクロマトグラフィーは、ワックスエステル(WE)およびステリルエステル(SE)を解決できず、また「アセトン移動性極性脂質」(AMPL)ピーク17に含まれるクラスがいくつかある。WE-SEは、骨魚卵母細胞の主要な脂質クラスであり、浮力および/またはエネルギー貯蔵をサポートするために使用される示唆されている18.
光合成生物からのAMPLでは、グリコグリセロリピッドは、しばしばアセトンのモノアシルグリセロールおよび顔料と一緒に溶出する。これは、クロロフィル a および糖脂質モノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG)とジガラクトシルジアシルグリセロール(DGDG)がスキャナ内で異なるFID応答を有するように定量的な懸念を提示することができる。しかし、AMPLクラスの標準として1-モノパルミトイルグリセロールを使用しており、これは17の中で中間応答を有する。
一部のFIDスキャナピークは複数の脂質クラスを含むことができますが、分離された脂質クラスを機能的に再グループ化すると便利な場合があります。例えば、AMPLおよびPLは、極性脂質にグループ化され、ステロール19を添加して構造脂質に分類されている。このようなグループ化は、無脊椎動物19の開発中に脂質使用のための重要な期間を研究するために使用された。遊離脂肪酸およびアルコールを含む他のグループ化は、脂肪分解指数(表2)または加水分解指数1のような分解指標として使用することができる。LIは全アシル脂質の脂肪分解指数であり、HIは非極性アシル脂質の加水分解指数である。LI値は、すべてのアシル脂質が含まれているため、任意のサンプルのHIの値よりも常に低いです。
時折ピーク分割は、同定を困難にすることができる多価不飽和種の高レベルの存在のために海洋サンプルの抽出物のロッド分離で発生します。これは、ワックスエステル(図3)、トリアシルグリセロールおよび遊離脂肪酸20、21で観察されており、本物の基準との共発見および/または他のクロマトグラフィー技術との確認を必要としている。同様に、極性脂質領域(図2および図3)においてピーク分裂が起こり得るが、さらに、成分糖脂質及び顔料17、22およびリン脂質クラス22、23を分離するさらなる開発が行われ得る。
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Disclosures
著者は競合する財政的利益を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)がC.Cパリッシュに105379助成金を提供しました。メモリアル大学のコア研究機器&インストゥルメントトレーニング(CREAIT)ネットワークは、この出版物に資金を提供しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
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