Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Bestemmelse av totale lipid- og lipidklasser i marine prøver

Published: December 11, 2021 doi: 10.3791/62315
Automatic Translation
1, 1
1Department of Ocean Sciences and CREAIT Network, Memorial University of Newfoundland

Summary

Denne protokollen er for bestemmelse av lipider i sjøvann og biologiske prøver. Lipider i filtrater ekstraheres med kloroform eller blandinger av kloroform og metanol i tilfelle av faste stoffer. Lipidklasser måles ved stang tynnlagskromatografi med flammeioniseringsdeteksjon, og summen gir det totale lipidinnholdet.

Abstract

Lipider består i stor grad av karbon og hydrogen og gir derfor en større spesifikk energi enn andre organiske makromolekyler i havet. Å være karbon- og hydrogenrik de er også hydrofobe og kan fungere som et løsningsmiddel og absorpsjonsbærer for organiske forurensninger og kan dermed være drivere av forurensende bioakkumulering i marine økosystemer. Deres hydrofobe natur letter isolasjonen fra sjøvann eller biologiske prøver: marin lipidanalyse begynner med prøvetaking og deretter ekstraksjon i ikke-polare organiske løsningsmidler, noe som gir en praktisk metode for separasjon fra andre stoffer i en akvatisk matrise.

Hvis sjøvann er prøvet, innebærer det første trinnet vanligvis separasjon i operasjonelt definerte "oppløste" og "partikkelfraksjoner" ved filtrering. Prøver samles inn og lipider isoleres fra prøvematrisen vanligvis med kloroform for virkelig oppløst materiale og kolloider, og med blandinger av kloroform og metanol for faste stoffer og biologiske prøver. Slike ekstrakter kan inneholde flere klasser fra biogene og menneskeskapte kilder. På dette tidspunktet kan totale lipider og lipidklasser bestemmes. Total lipid kan måles ved å summere individuelt bestemte lipidklasser som vanligvis har blitt kromatografisk separert. Tynnlagskromatografi (TLC) med flammeioniseringsdeteksjon (FID) brukes regelmessig til kvantitativ analyse av lipider fra marine prøver. TLC-FID gir synoptisk lipidklasseinformasjon og, ved å summere klasser, en total lipidmåling.

Lipidklasseinformasjon er spesielt nyttig når den kombineres med målinger av individuelle komponenter, for eksempel fettsyrer og/eller steroler, etter at de er frigjort fra lipidekstrakter. Det store utvalget av lipidstrukturer og -funksjoner betyr at de brukes bredt i økologisk og biogeokjemisk forskning som vurderer økosystemhelsen og graden av påvirkning av menneskeskapte påvirkninger. De har blitt brukt til å måle stoffer av kostholdsverdi til marin fauna (f.eks. aquafeeds og/eller byttedyr), og som en indikator på vannkvalitet (f.eks. hydrokarboner).

Introduction

Metodene beskrevet her gjelder stoffer som er definert operasjonelt som marine lipider. Denne definisjonen er basert på deres egnethet til væske-væske ekstraksjon i ikke-polare organiske løsningsmidler, og det gir en praktisk metode for deres separasjon fra andre stoffer i en akvatisk matrise. Deres hydrofobe natur letter isolasjonen fra sjøvann eller biologiske prøver, samt deres berikelse, og fjerning av salter og proteiner.

Målingen av lipidinnhold og dens sammensetning i marine organismer har vært av stor interesse for matnettøkologi, akvakulturernæring og matvitenskap i flere tiår. Lipider er universelle komponenter i levende organismer, som fungerer som essensielle molekyler i cellemembraner, som store kilder til biotilgjengelig energi, gir termisk isolasjon og oppdrift, og fungerer som signalmolekyler. Selv om prosedyrer for lipidbestemmelse på andre felt er beskrevet godt, krever deres bruk med marine prøver vanligvis modifikasjon for å tilpasse seg feltforhold samt prøvetype1.

For sjøvannsprøver krever det første trinnet vanligvis separasjon i de operasjonelt definerte "oppløste" og "partikkelfraksjonene", normalt ved filtrering (protokolltrinn 1). Partikkelfraksjonen er det som beholdes av filteret, og størrelsen på porene er viktig for å definere avskjæringen2. Ofte når vi tar prøver av svevestøv, vil vi gjerne relatere lipidkonsentrasjoner til totale massekonsentrasjoner, i så fall må en separat, mindre prøve (f.eks. 10 ml) tas for dette formålet (Protokoll trinn 1, merk). For å få en nøyaktig massebestemmelse er det viktig å legge til ammoniumformat (35 g / L) på slutten av filtreringen.

Sjøvannsfiltratet fra den større prøven skal utgjøre mellom 250 ml og 1 l avhengig av prøvetype og utsettes for væskevæskeutvinning i en separatortrakt (protokolltrinn 2). Lipidenes hydrofobe natur betyr at de kan skilles fra andre forbindelser ved ekstraksjon i et ikkepolært løsningsmiddel som kloroform. Et tolagssystem opprettes der lipider partisjonerer seg inn i det organiske laget mens vannløselige komponenter forblir i det vandige laget.

Partikkelprøver på et filter, eller biologiske prøver ekstraheres med en modifisert Folch et al. ekstraksjon3, som også involverer kloroform (protokolltrinn 3). Igjen opprettes et organisk / vandig system der lipider partisjonerer seg inn i den organiske fasen, mens vannløselige molekyler forblir i den vandige fasen, og proteiner utfelles. Faktisk, for faste stoffer, bruker de fleste laboratorier en viss variasjon av Folch et al. ekstraksjon3-prosedyren som involverer kloroform og metanol. For filtre er det første trinnet å homogenisere i 2 ml kloroform og 1 ml metanol.

Under utvinning bør det tas hensyn til å beskytte lipider mot kjemisk eller enzymatisk modifikasjon, ved å holde prøver og løsningsmidler på is for å redusere esterbinding hydrolyse eller karbonkarbon dobbel binding oksidasjon. Vev og cellelipider er ganske godt beskyttet av naturlige antioksidanter og ved oppdeling4; Etter homogeniseringen av prøver kombineres imidlertid celleinnhold som gjør lipider mer avhendet til endring, kjemisk eller enzymatisk. Noen lipider, som de fleste steroler, er svært stabile, mens andre, som de som inneholder flerumettede fettsyrer, er mer utsatt for kjemisk oksidasjon. Andre, som steroler med konjugerte doble bindinger, er utsatt for oksidasjon katalysert av lys5. Etter ekstraksjoner er lipider mye mer utsatt for kjemisk oksidasjon, og prøver bør lagres under en inert gass som nitrogen. En mild strøm av nitrogen vil også bli brukt til å konsentrere ekstrakter.

Etter konsentrasjonen vil lipider normalt kvantifiseres i bulk, da de er en viktig komponent i marine økosystemer som gir en høy konsentrasjon av energi, mer enn dobbelt så mye kJ /g karbohydrater og proteiner. Alltid ville de neste bli kvantifisert som individuelle komponenter: Den omfattende analysen av lipider innebærer generelt separasjon i enklere kategorier, i henhold til deres kjemiske natur. Dermed innebærer en full analyse å måle totale lipider, lipidklasser og individuelle forbindelser.

Total lipid kan bestemmes ved å ta summen av individuelt målte lipidklasser atskilt med kromatografi6. Et marint lipidekstrakt kan inneholde mer enn et dusin klasser fra biogene og menneskeskapte kilder. Det brede utvalget av lipidstrukturer betyr at mye informasjon kan oppnås ved å bestemme individuelle grupperinger av strukturer. Lipidklasser individuelt, eller i visse grupper, har blitt brukt til å signalisere tilstedeværelse av visse typer organismer, samt deres fysiologiske status og aktivitet2. De har også blitt brukt som en indikator på opprinnelsen til organisk materiale, inkludert oppløst organisk materiale (DOM) samt hydrofobe forurensninger.

Triacylglyseroler, fosfolipider og steroler er blant de viktigste biogene lipidklassene. De to første er biokjemisk relatert da de har en glyserol ryggrad som to eller tre fettsyrer er esterifisert (Figur 1). Triacylglyseroler, sammen med voksester, er svært viktige lagringsstoffer, mens andre fettsyreholdige lipidklasser som diacylglyseroler, frie fettsyrer og monoacylglyseroler generelt er mindre bestanddeler. Frie fettsyrer er tilstede ved lavere konsentrasjoner i levende organismer, da de umettede kan være giftige7. Steroler (både i frie og esterifiserte former) og fettalkoholer er også inkludert blant de mindre polare lipidene, mens glykolipider og fosfolipider er polare lipider. Polar lipider har en hydrofil gruppe, noe som gjør det mulig å danne lipidbilayere som finnes i cellemembraner. Frie steroler er også membranstrukturelle komponenter, og når de tas i forhold til triacylglyseroler, gir de en tilstand eller ernæringsmessig indeks (TAG : ST) som har blitt mye brukt8. Når de tas i forhold til fosfolipider (ST : PL), kan de brukes til å indikere plantefølsomhet for salt: høyere verdier opprettholder strukturell integritet og reduserer membrangjennomtrengelighet9. Det motsatte av dette forholdet (PL : ST) har blitt studert i bivalve vev under temperaturtilpasning10.

Marine lipidklasser kan separeres av tynnlagskromatografi (TLC) på silikagelbelagte stenger (protokolltrinn 4) og deretter oppdages og kvantifiseres ved flammeioniseringsdeteksjon (FID) i en automatisk FID-skanner. TLC/FID har rutinemessig blitt brukt til marine prøver, da det raskt gir synoptiske lipidklassedata fra små prøver, og ved å ta summen av alle klasser, en verdi for totale lipider. TLC/FID har blitt utsatt for en kvalitetssikringsvurdering (QA) og ble funnet å oppfylle standarder som kreves for konsistent ekstern kalibrering, lave emner og presis replikeringsanalyse11. Variasjonskoeffisienter (CV) eller relative standardavvik er rundt 10 %, og de totale LIPID-dataene for FID-skanneren er normalt rundt 90 % av dem som oppnås ved gravimetrisk og andre metoder2. Gravimetry gir høyere totale lipider sannsynligvis fordi FID-skanneren bare måler ikke-flyktige forbindelser, og også som et resultat av mulig inkludering av ikke-lipidmateriale i gravimetriske målinger.

Informasjonen fra lipidklasseanalyse er spesielt nyttig når den kombineres med bestemmelse av fettsyrer som individer, eller steroler, eller de to i kombinasjon. Det første skrittet mot disse analysene innebærer frigjøring av alle komponentfettsyrer sammen med steroler i lipidekstraktene (protokolltrinn 5). Det store utvalget av lipidstrukturer og -funksjoner betyr at de har sett bred bruk i økologiske og biogeokjemiske studier som vurderer økosystemhelsen og i hvilken grad de har blitt påvirket av menneskeskapte og terrestriske tilførsler. De har blitt brukt til å måle biosyntese av stoffer av kostholdsverdi til marin fauna, samt for å indikere kvaliteten på vannprøver. Måling av lipider i sedimentkjerneprøver bidrar til å vise sedimentenes følsomhet for endringer i menneskelig arealbruk nær landbunnsmarginen.

Det primære verktøyet for å identifisere og kvantifisere individuelle lipidforbindelser har tradisjonelt vært gasskromatografi (GC) med FID. Før analyse blir imidlertid disse forbindelsene gjort mer flyktige ved avledning. Fettsyrer frigjøres i nærvær av en sur katalysator(H2SO4) fra acyl lipidklasser (figur 1). I organisk kjemi er akrylgruppen (R-C = O) vanligvis avledet fra en karboksylsyre (R-COOH). De blir deretter re-esterified til fettsyre metyl estere (FAME) som gir bedre separasjoner på GC kolonner (Protocol trinn 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: For å rengjøre glass, instrumenter og filtre for lipidanalyser, vask dem 3 ganger med metanol etterfulgt av 3 vasker med kloroform, eller varm dem opp til 450 °C i minst 8 timer.

1. Filtreringsprosedyre for sjøvann oppløst og partikkellipider

MERK: Den spesielle brøkdelen av interessen er operasjonelt definert av filtreringsprosedyren. I dette tilfellet er porestørrelsen 1,2 μm.

  1. Sett opp filtreringsmanifolden uten filter og skyll oppsettet med filtrert sjøvann.
  2. Bruk rene tang plasserer et 47 mm glassfiberfilter (GF/C), som er vasket, inn i det rene filtreringssystemet.
  3. Ta prøven og virvle forsiktig for å resuspendere materiale som kan ha lagt seg på bunnen av oppsamlingsbeholderen. Mål nøyaktig ut et kjent volum, i dette tilfellet 1 L, og filtrer dette gjennom filteret.
    MERK: Volumet vil avhenge av mengden svevestøvmateriale i prøven: vanligvis mellom 250 ml og 5 l avhengig av sesong og plassering.
  4. Når prøven er målt ut, fukt filteret forsiktig med filtrert sjøvann. Tilsett hele prøven langsomt i filtreringssystemet og skyll den graderte sylinderen med filtrert sjøvann for å sikre at alle partikler legges til filteret. Skyll oppsettet med filtrert sjøvann på sidene for å sikre at alle partikler skylles ned på filteret.
    1. La alt sjøvannet passere gjennom filteret, men ikke la filteret tørke helt ut, da det kan forstyrre cellene på filteret; bryte sug som den siste av vannet forsvinner.
  5. Bruk rene tang og en ren pipette, brett filteret i halvparten, deretter i tredjedeler og deretter i halv lengde for å rulle filteret inn i et rør. Legg det i et rent, merket 10 ml hetteglass.
  6. Dekk filteret med 2 ml kloroform. Fyll hoderommet med nitrogen og tetning med PTFE tape. Plasser i et stativ i en -20 °C fryser. Prøvene vil være stabile ved denne temperaturen opptil et år.
    MERK: For å relatere lipidkonsentrasjoner til totale massekonsentrasjoner, er det også nødvendig med en tørrvektmåling. Dette innebærer å sette et 24 mm forhåndsveid filter i et tørrvektsfiltreringsoppsett, røre prøven og ta en liten subsample som filtreres på det lille filteret. Når filteret er nesten tørt, tilsettes ca. 10 ml 3,5% ammoniumformat til filteret. Filteret er brettet i halvparten, returnert til en merket Petri-tallerken og plassert i en fryser.

2. Væske-væske utvinning av sjøvann eller flytende prøver

  1. Klargjøre eksemplet
    1. Mål et kjent volum filtrat i en lipid rent glass gradert sylinder. Plasser denne prøven i en ren 1 L separatory trakt. Tilsett deretter 20 ml kloroform i prøven og rist i 2 min, venting ofte.
  2. Fjerning av første ekstrakt og tilsetning av syre etter første separasjon
    1. Pakk trakten i aluminiumsfolie og vent i 5 til 10 minutter for separasjon. Skrell tilbake bunnen av folien for å se de to lagene. Samle det nederste, organiske laget gjennom stoppekranen i en ren rundbunnet kolbe, vær forsiktig så du ikke inkluderer noe av topplaget. Hette den runde bunnede kolben under nitrogen og plasser den i fryseren.
    2. Tilsett 0,25 ml konsentrert H2SO4 for hver liter prøve, til prøven i separatortrakten og rist trakten forsiktig.
    3. Tilsett 10 ml kloroform og rist kraftig i 2 minutter mens du ventilerer ofte. La separasjonen finne sted.
  3. Andre og tredje separasjoner
    1. Vent på separasjonen og legg det nederste laget i den runde bunnede kolben.
    2. Tilsett en tredje 10 ml kloroform, og rist i 2 minutter, igjen ventilasjon ofte. Etter separasjon legger du det nederste laget til den runde bunnede kolben.
    3. Overfør ekstraktet i den runde bunnede kolben til en roterende fordamper, fordampe og overfør til et 2 ml hetteglass.

3. Ekstraksjonsprotokoll for faste stoffer (modifisert Folch et al.3 ekstraksjon)

  1. Installasjonsprogrammet
    MERK: Avtrekksoppsettet krever en isolert beholder fylt med is. Løsemidler inkluderer metanol, kloroform ekstrahert vann og 2:1 kloroform:metanol. Alle løsemidler skal plasseres på is slik at de er kalde når ekstraksjonene startes. Prøvene går også på is, slik at alt forblir kaldt.
    1. Skyll alle rør og PTFE fôrede hetter 3 ganger med metanol og deretter 3 ganger med kloroform. Ett sentrifugerør og ett 15 ml hetteglass med hette er nødvendig for hver ekstraksjon.
    2. Plasser prøven i et sentrifugerør som inneholder 2 ml kloroform. Størrelsen på prøven avhenger av mengden lipid tilstede, ca 5 til 10 mg lipid foretrukket.
  2. Sliping og ekstraksjon
    1. Tilsett ca. 1 ml iskald metanol og slip prøven raskt i en masse med en ren homogenisator eller PTFE/metallsteng.
    2. Vask stangen tilbake i røret med ca. 1 ml iskald 2:1 kloroform: metanol og deretter med 1/2 ml iskaldt kloroformekstraktert vann. Bruk eventuelt et rent sett med tang for å tvinge partikler tilbake i hetteglasset før vask. Cap røret og soniker blandingen i 4 minutter i et ultralydbad (35 - 42 kHz).
  3. Dobbel pipettering: Sentrifuger prøven i 2 min ved 1800 × g. Samle hele det organiske laget (bunnlaget) ved hjelp av den doble pipetteringsteknikken der en 5 3/4" pipette med pæren på løst skyves forsiktig gjennom de to lagene, mens du klemmer pæren, noe som får bobler til å komme ut.
    1. Når bunnen av det andre laget er nådd, bruk tommelen til å fjerne pæren uten å tegne det organiske laget inn i pipetten. Plasser en 9" pipette inne i den 5 3/4" og fjern bunnlaget gjennom den 5 3/4" pipetten.
    2. Legg avtrekket i et rent hetteglass. Fortsett å ta av det nederste laget til alt er fjernet.
  4. Vask pipetter: Skyll den 9" pipetten inn i hetteglasset som inneholder det organiske laget ved hjelp av 1,5 ml iskald kloroform for å vaske ned utsiden av pipetten og 1,5 ml for å vaske ned innsiden. Vri pipetten forsiktig mens du vasker, og sørg for at all kloroformen renner ned pipetten til hetteglass.
    1. Skyll den 5 3/4" pipetten inn i røret som inneholder det vandige laget på samme måte.
  5. Soniker og sentrifuger prøvene og dobbel pipette når de separeres, ved hjelp av nye pipetter hver gang. Gjenta minst tre ganger og samle alle organiske lag. Etter å ha fjernet det organiske laget for tredje gang, vask begge pipettene i hetteglasset som inneholder det organiske laget.
  6. Bruk en skånsom strøm av nitrogen, konsentrer deg ned til volum, forsegle deretter med PTFE tape og lagre i en fryser.

4. Utvikling av systemer og trinn for stang TLC separasjon av marine lipid klasser

  1. Klargjøre stengene for TLC
    1. Blank skann stengene i den automatiske FID-skanneren tre ganger
    2. Oppdage en prøve: Påfør prøver og standarder med en sprøyte på stengene på eller like under opprinnelsen. Dispenser 0,5 μL og berør dråpen til stangen. La tørke før du plasserer neste dråpe på samme sted. Se alle prøver i en linje på stenger.
    3. Fokusering i aceton: Fokusprøver to ganger (tre ganger hvis prøvene er svært konsentrerte) i 70 ml aceton. Se løsningsmidlet foran når det klatrer stangen til bunnen av stedet smelter sammen med toppen. Fjern stengene, tørk dem i rundt 5 s, og gjenta deretter prosedyren for å produsere et smalt bånd av lipidmateriale nær bunnen av stangen.
    4. Tørk og kondisjoner stengene i et konstant fuktighetskammer i 5 min. Et konstant fuktighetskammer er en desiccator med en mettet løsning av kalsiumklorid under platen.
  2. Sekvens som fører til det første kromatogrammet (hydrokarbon til keton)
    1. Første utviklingssystem: Det første utviklingssystemet er heksan: dietyl eter: maursyre, 98.95:1:0.05. Bruk en sprøyte til å tilsette maursyren, men skyll først sprøyten 3× med maursyre. Skyll maursyren ut av sprøyten umiddelbart etterpå med kloroform. Bruk 30 ml av blandingen til å fukte papiret og skyll tanken. Kast skylleløsningen og tilsett de resterende 70 ml til tanken.
      1. Ta stativene og senk dem forsiktig ned i tanken. Se til løsningsmidlet foran når prøvepunktene, og start deretter timeren. Etter 25 min, fjern stengene fra utviklingskammeret, tørk i det konstante fuktighetskammeret i 5 min, og ombygg i samme løsning i ytterligere 20 minutter.
    2. Tørk stengene i 5 minutter i den automatiske FID-skanneren og skann deretter til det laveste punktet bak ketontoppen ved hjelp av en PPS-skanning på 25.
  3. Sekvens som fører til det andre kromatogrammet (triacylglyserol til diacylglyserol):
    1. Kondisjoner stengene i 5 min i det konstante fuktighetskammeret.
    2. Andre utviklingssystem: Det andre utviklingssystemet er heksan: dietyl eter: maursyre, 79:20:1. Tilsett ~30 ml i utviklingstanken for å fukte papiret og skyll tanken. Kast deretter og utvikle stengene i 40 min i de resterende 70 ml. For best mulig separasjon mellom TAG (mettet) og TAG (flerumettede) topper, bruk en blanding av 79.9:20:0.1, men for separasjon av ST- og DAG-toppene bruker du en blanding av 79:20:1.
    3. Tørk og skann til laveste punkt bak diacylglycerol-toppen i en annen delvis skanning ved hjelp av en PPS-skanning 11.
  4. Sekvens som fører til det tredje kromatogrammet (acetonmobil polar lipid og fosfolipid)
    1. Kondisjoner stengene i 5 minutter i det konstante fuktighetskammeret.
    2. Utvikle stengene to ganger i 15 minutter i 70 ml aceton. Mellom utviklingen lufttørker stengene i ca 30 sekunder.
    3. Kondisjoner stengene i 5 minutter i det konstante fuktighetskammeret.
    4. Tredje utviklingssystem: Det tredje utviklingssystemet er en blanding av kloroform, metanol og kloroform-ekstrahert vann, 50:40:10. Utvikle stengene to ganger i 10 minutter i 70 ml av blandingen. Mellom utviklingen tørker luften stengene i ca 30 sekunder.
    5. Tørk og skann hele lengden på stengene.

5. FAME avledning med H2SO4 i MeOH

  1. Gjør Hilditch reagens
    1. Klargjøring av metanol: Plasser 100 ml MeOH i en ren volumetrisk kolbe og dryss deretter forsiktig i vannfri NaSO4 til bunnen av kolben er dekket. Når det er dekket, inverter to ganger slik at noe vann i metanol absorberes av NaSO4. Etter invertering og risting, la den sitte i minst 5 min.
    2. Tilsett syre: Dekanter metanolen langsomt i en glassburk (nå er NaSO4 en hard klump i bunnen av kolben) og H2SO4 tilsettes. Tilsett langsomt 1,5 ml svovelsyre til metanol ved hjelp av en pipette. Tilsett noen dråper om gangen, og når all syren er tilsatt, hette og rør forsiktig for å blande. Løsningen er nå klar til bruk for derivater, men den må gjøres opp på ukentlig basis.
  2. Å lage derivater
    1. Overfør ca. 200 μg lipider fra et hetteglass med ekstrakt som har fått volumet brakt opp til en kjent mengde, til et rent, 15 ml hetteglass og fordampe under nitrogen til tørrhet. Mengden som fjernes, bestemmes av konsentrasjonen av prøven fra TLC/FID. Bruk en ren pipette for å fjerne prøven.
    2. Når prøven har tørket, tilsett 1,5 ml dichlorometan og 3 ml av det nyopprettede Hilditch-reagenset.
    3. Virvel prøven, og soniker den i et ultralydbad i 4 min for å fjerne lipider som har festet seg til hetteglasset i glass. Fyll hetteglasset med nitrogen, hette og forsegle det med PTFE tape og varme ved 100 °C i 1 time.
  3. Stoppe reaksjonen
    1. La prøvene avkjøles helt til romtemperatur i 10 minutter etter fjerning fra ovnen, og åpne deretter hetteglassene forsiktig.
    2. Tilsett langsomt ca. 0,5 ml mettet natriumbikarbonatoppløsning (9 g/100 ml kloroformekstraktert vann), deretter 1,5 ml heksan. Rist eller virvel hetteglasset, og la det stå slik at det separeres i 2 lag.
  4. Innsamling av FAME's
    1. Fjerne topplaget: Når avledningen er stoppet, og det er klar separasjon, fjern den øvre, organiske fasen og plasser i et lipid rent 2 ml hetteglass.
    2. Fordamp oppløsningsvæsken i 2 ml hetteglasset til tørrhet og fyll det på med heksan til ca. 0,5 ml.
    3. Fyll hetteglassets hodeplass med nitrogen, hette og forsegle hetteglasset med PTFE-tape, soniker i ytterligere 4 minutter for å suspendere fettsyrene igjen, og så er det klart til å gå til GC.
      MERK: Hvis fettsyrekonsentrasjoner er nødvendig, må det vandige laget vaskes tre ganger med heksan og alle organiske lag samlet i 2 ml hetteglasset. Dette innebærer å legge til 2 ml heksan, virvelere prøven, sentrifugere og fjerne det organiske laget, alle gjentatt 3 ganger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som den raskest voksende matproduksjonssektoren utvikler havbruk seg når det gjelder teknologiske innovasjoner og tilpasninger for å møte endrede krav. En av disse er å redusere avhengigheten av villkornet fiskemel og fiskeolje, som gir fôringredienser til mange akvakulturarter. Jordbaserte planteoljer undersøkes som bærekraftige og økonomiske erstatninger for fiskeolje i aquafeeds, og leveren er et målvev for analyse fordi det er det primære stedet for lipidmetabolisme12. Figur 2 viser de rå TLC-FID-kromatogrammene hentet fra vår ni-komponent standard, en diett vi formulerte med fiskeolje på 7% og rapsolje på 5%, og levervev fra en atlantisk laks matet den dietten. Tabell 1 viser dataene som er innhentet etter analyse av kostholdsrepliskeringer og prøver fra ulike fisk. Disse dataene ble innhentet etter å ha konstruert standardkurver fra skanner-FID-svar for å kvantifisere lipidklassene i ekstraktene ved hjelp av Peak Simple-programvare (versjon 4.54). Dataene viser utbredelsen av triacylglyseroler i dietter og lever og også betydningen av membranfolipider i leveren.

Kontinentale marginer har generelt svært høy biologisk produktivitet, og de er spesielt viktige i sykling av karbon. Overflate primærproduktivitet når havbunnen mer i grunnere vann, og derfor er måling av mengde og kvalitet på partikler som bosetter seg fra det øvre blandede laget inn i bunnmatnettet av stor interesse. Å være rik på karbon og ha et svært høyt energiinnhold, lipider er viktige komponenter i produktiviteten til kontinentalsokkelen. Historisk støttet farvann ved siden av Newfoundland og Labrador et av de største fiskeriene i verden i omtrent fem århundrer, og vi har studert produksjon og overføring av lipider i dette systemet13. Figur 3 viser TLC-FID-kromatogrammer hentet fra vår standard, lipider i sedimentering av svevestøv samlet på 220 m utenfor kysten av Newfoundland, og lipider i en liten mysid, Erythrops erythrophtalma samlet nær samme dybde. Denne gangen har kromatogrammene blitt behandlet gjennom plotting programvare og de to delvise skanningene er kombinert med den endelige komplette skanningen. Tabell 2 viser dataene som er innhentet etter å ha analysert replikeringsprøver av sedimentering av svevestøv og mysid. Blant 19 taxa fra 5 phyla hadde den lille mysiden i gjennomsnitt den høyeste lipidkonsentrasjonen (6% av våtvekten)13.

Figure 1
Figur 1: Hovedlelidklasser i marine prøver i en omtrentlig rekkefølge av økende polaritet. Hver struktur er tegnet med den mest hydrofobe delen av molekylet som peker mot høyre for figuren. Representative forbindelser for lipidklasser er:- hydrokarbon: nonadecane; voks ester: heksadecyl palmitate; steryl ester: kolesteryl palmitate; metyl ester: metyl palmitate; keton: 3-heksdekanon; triacylglyserol: tripalmitin; fri fettsyre: palmittsyre; alkohol: phytol; sterol: kolesterol; diacylglyserol: dipalmitoyl glyserol; monoacylglyserol: monopalmitoyl glyserol; glykolipid: digalactosyl diacylglycerol; fosfolipid: dipalmitoylfosfatidylkolin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: TLC-FID-kromatogrammer av lipidsammensetning fra et akvakulturfôringseksperiment. Ekstrakter ble oppdaget på silikagelbelagte TLC-stenger, og et tretrinns utviklingssystem ble brukt til å skille lipidklasser. Det første og andre utviklingssystemet var henholdsvis heksan:dietyleter:maursyre (98.95:1:0.05) og (79.9:20:0.1) for å skille nøytrale lipider, inkludert triacylglycerol, fri fettsyre og sterol for skanning i den automatiske FID-skanneren. De tredje utviklingssystemene besto av 100% aceton før kloroform:metanol:vann (5:4:1) for å skille acetonmobile polarlipider og fosfolipider. Standardkurver (dvs. ikke-adekan, cholesteryl palmitate, 3-heksdekanon, tripalmitin, palmitinsyre, cetylalkohol, kolesterol, monopalmitoylglyserol, dipalmitoylfosfatidylolin) ble brukt til å kvantifisere lipidklassene i ekstraktene ved hjelp av Peak Simple-programvare (versjon 4.54). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: TLC-FID-kromatogrammer av lipidsammensetning av nærbunnsprøver fra kysten av Newfoundland. a) ni komponentstandard, b) 220 m sedimentering av svevestøv fra Conception Bay, Newfoundland, c) lipidklasser i mysid, Erythrops erythrophtalma. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Fiskeolje/rapsolje diett Atlantisk lakselever
Hydrokarboner 1.3±0.9 0.5±0.2
Steryl estere / voks estere 0.4±0.6 0.6±0.3
Etyl estere 0 0
Metyl estere 0 0
Etyl ketoner 0 0.3±0.2
Metyl ketoner 0 0
Glyseryl Ethers 0 0
Triacylglyseroler 145.0±26.3 16.9±8.1
Frie fettsyrer 21.9±2.2 1.2±0.9
Alkoholer 0 1.4±0.4
Steroler 6.8±2.1 2.6±0.2
Diacylglyseroler 0 0
Aceton Mobile Polar Lipider 14.0±2.5 2.2±0.6
Fosfolipider 12.5±4.0 22.0±2.0
Totalt antall lipider 201.8±27.4 47.7±11.8

Tabell 1: Lipidsammensetning i et akvakulturfôringseksperiment. Data er (gjennomsnittlig±standardavvik) av et eksperimentelt kosthold som inneholder 6,80% fiskeolje og 4,80% rapsolje, som matet (mg g-1 våtvekt), og av lever av atlantisk laks (mg g-1 våtvekt) etter fôring av denne dietten i 12 uker.

Avgjøre svevestøv Erythrops erythrophtalma
Steryl Esters/Wax Esters (% total lipid) 10.2±8.28 8.85±1.67
Triacylglyseroler (% total lipid) 19.7±5.35 58.5±9.19
Fosfolipider (% total lipid) 16.2 ± 3.51 21.4±5.35
Nøytrale lipider (% total lipid) 12.5±4.0 73.4±5.46
Lipolyseindeks (%) 18.1±5.20 2.77±2.78
Totalt antall lipider 0.57±0.25 5.86±1.44
Nøytrale lipider: hydrokarboner, voks- og sterylsterere, ketoner, triacylglyseroler, frie fettsyrer; (FFA), alkoholer (ALC), steroler, diacylglyseroler; LI: lipolyseindeks [(FFA + ALC) (acyl lipider + ALC)–1]; Totalt lipid (summen av TLC/FID-bestemte lipidklasser) svevestøv - % tørrvekt, Mysid - % våtvekt

Tabell 2: Lipidsammensetning av nærbunnsprøver fra kysten av Newfoundland. Data er (gjennomsnittlig±standardavvik) på 220 m sedimentering av svevestøv fra Conception Bay Newfoundland, og av mysid, Erythrops erythrophtalma.

Fotnote: Nøytrale lipider: hydrokarboner, voks- og sterylsterere, ketoner, triacylglyseroler, frie fettsyrer; (FFA), alkoholer (ALC), steroler, diacylglyseroler; LI: lipolyseindeks [(FFA+ ALC) (acyl lipider + ALC)-1]; Totalt lipid (summen av FID-bestemte lipidklasser) svevestøv - % tørrvekt, Mysid - % våtvekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hastigheten som TLC-FID-systemet gir synoptisk lipidklasseinformasjon fra små prøver, gjør TLC-FID til et dyktig verktøy for screening av marine prøver før det foretas mer involverte analytiske prosedyrer. Slike analyser krever vanligvis frigjøring av komponentforbindelser fra lipidekstrakter og avledning for å øke volatiliteten ved gasskromatografi. TLC-FID kombinert med GC-FID har vist seg å være en kraftig kombinasjon for ekstrakter av sjømat og andre matvarer14. For vellykkede marine lipidanalyser er det avgjørende at prøver er beskyttet mot nedbrytning og forurensning gjennomgående, og at det tas stor forsiktighet med anvendelsen av prøven til stangen. En tilnærming er å bruke hele den marine prøven på stangen ved hjelp av en mikrokapillær pipettor15, og en innovasjon i marine prøvetyper er å legge til mikrolag på havoverflaten og aerosolprøver til sjøvannsprøver16.

FID-systemet i den automatiske skanneren gir rask mikrogrammengde uten avledning eller opprydding; Det er imidlertid ikke så følsomt, presist eller lineært som det finnes i gasskromatografier. Dette betyr at kalibreringskurver må konstrueres, og at det av og til kan være nødvendig å analysere prøver ved to forskjellige belastninger for å holde både mindre og større lipidklassetopper innenfor kalibreringsområder.

Ved å bruke funksjonen for delvis skanning i FID-skanneren, er det mulig å skille flere klasser lipider fra ett enkelt prøveprogram til en stang. Kromatografi på silikasyre klarer imidlertid ikke å løse voksestere (WE) og sterylstere (SE), og noen få klasser kan inkluderes i den "aceton-mobile polar lipid" (AMPL) topp17. WE-SE var den viktigste lipidklassen i bonefish oocytter, og det foreslås at de brukes til å støtte oppdrift og / eller energilagring18.

I AMPL fra fotosyntetiske organismer eluterer glykolyserolipidene ofte sammen med monoacylglyseroler og pigmenter i aceton. Dette kan presentere en kvantitet bekymring som klorofyll a og glykolipider monogalactosyl diacylglycerol (MGDG) og digalactosyl diacylglycerol (DGDG) har forskjellige FID-responser i skanneren; Vi bruker imidlertid 1-monopalmitoyl glyserol som standard for AMPL-klassen, og dette har et svar mellomliggende blant dem17.

Mens noen FID-skannertopper kan inneholde mer enn én lipidklasse, er det noen ganger nyttig å gruppere separerte lipidklasser funksjonelt. For eksempel har AMPL og PL blitt gruppert i polare lipider og deretter i strukturelle lipider med tilsetning av sterol19. Slike grupperinger ble brukt til å studere kritiske perioder for lipidbruk under utvikling i hvirvelløse dyr19. Andre grupperinger som involverer frie fettsyrer og alkoholer kan brukes som nedbrytningsindikatorer som lipolyseindeksen (tabell 2) eller hydrolyseindeksen1. LI er lipolyseindeksen til alle acyllipider mens HI er hydrolyseindeksen til ikke-polare akryllipider. LI-verdier er alltid lavere enn for HI for alle prøver fordi alle acyllipider er inkludert.

Av og til oppstår toppsplitting i stangseparasjoner av ekstrakter av marine prøver på grunn av tilstedeværelsen av høye nivåer av flerumettede arter som kan gjøre identifikasjon vanskelig. Dette har blitt observert med voksestere (figur 3), triacylglyseroler og frie fettsyrer20,21, og nødvendiggjør samspotting med autentiske standarder og / eller bekreftelse med andre kromatografiske teknikker. På samme måte kan toppsplitting forekomme i polarlipidområdet (figur 2 og figur 3), og videre utvikling kan gjennomføres for å skille ut komponentglykolipider og pigmenter17,22 og fosfolipidklasser22,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) tilskuddsnummer 105379 til C.C. Parrish. Memorial University's Core Research Equipment &Instrument Training (CREAIT) Network bidro til å finansiere denne publikasjonen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml vials VWR 66009-560
1-hexadecanol Sigma 258741-1G
1-Monopalmitoyl-rac-glycerol Sigma M1640-1g
2 ml vials VWR 46610-722
25 mm glass fibre filters Fisher 09 874 32A
2ml pipet bulbs VWR 82024-554
47 mm glass fibre filters Fisher 09 874 32
5 3/4" pipets Fisher 1367820A
9" pipets Fisher 1367820C
Acetone VWR CAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890 Agilent
Calcium Chloride ANHS 500gm VWR CACX0160-1
Caps for 2 ml vials VWR 46610-712
chloroform VWR CACX1054-1
Cholesteryl palmitate Sigma C6072-1G
Chromarod S5 Shell USA 3252
Dichloromethane VWR CADX0831-1
DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl Sigma P5911-1g
Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L VWR CAEX0190-4
Glyceryl tripalmitate Sigma T5888-100MG
Hamilton Syringe 702SNR 25µl Sigma 58381
Helium Air Liquide A0492781
Hexane VWR CAHX0296-1
Hydrogen regulator VWR 55850-484
Iatroscan MK6 Shell USA
Kimwipes Fisher 066662
Medical Air Air Liquide A0464563
Medium nitrile gloves Fisher 191301597C
Nitrile gloves L VWR CA82013-782
Nitrogen Air Liquide A0464775
Nitrogen Regulator VWR 55850-474
Nonadecane Sigma 74158-1G
Palmitic acid Sigma P0500-10G
Repeating dispenser Sigma 20943
Sodium Bicarbonate 1kg VWR CA97062-460
Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr VWR CA71008-804
Sulfuric acid VWR CASX1244-5
Teflon tape Fisher 14610120
tissue master 125 115V w/7mm homogenator OMNI International TM125-115
TLC development tank Shell USA 3201
UHP hydrogen Air Liquide A0492788
VWR solvent repippetter VWR 82017-766
VWR timer Flashing LED 2 channel VWR 89140-196
Zebron ZB-Wax GC column Phenomenex 7HM-G013-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
  2. Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045 (2013).
  3. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  4. Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
  5. Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
  6. Parrish, C. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. Arts, M. T., ainman, B. C. , Springer-Verlag. New York. 4-20 (1999).
  7. Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
  8. Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
  9. Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
  10. Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
  11. Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
  12. Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
  13. Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
  14. Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
  15. Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
  16. Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
  17. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
  18. Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
  19. Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
  20. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
  21. Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
  22. Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
  23. Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).

Tags

Miljøvitenskap utgave 178
Bestemmelse av totale lipid- og lipidklasser i marine prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parrish, C. C., Wells, J. S.… More

Parrish, C. C., Wells, J. S. Determination of Total Lipid and Lipid Classes in Marine Samples. J. Vis. Exp. (178), e62315, doi:10.3791/62315 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter