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समुद्री नमूनों में कुल लिपिड और लिपिड कक्षाओं का निर्धारण

Published: December 11, 2021 doi: 10.3791/62315
Automatic Translation
1, 1
1Department of Ocean Sciences and CREAIT Network, Memorial University of Newfoundland

Summary

यह प्रोटोकॉल समुद्री जल और जैविक नमूनों में लिपिड के निर्धारण के लिए है। फिलट्रेट्स में लिपिड को क्लोरोफॉर्म या ठोस के मामले में क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल के मिश्रण के साथ निकाला जाता है। लिपिड कक्षाएं लौ आयनीकरण का पता लगाने के साथ रॉड पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा मापा जाता है और उनकी राशि कुल लिपिड सामग्री देता है ।

Abstract

लिपिड काफी हद तक कार्बन और हाइड्रोजन से बने होते हैं और इसलिए, समुद्र में अन्य कार्बनिक मैक्रोमॉलिक्यूल्स की तुलना में अधिक विशिष्ट ऊर्जा प्रदान करते हैं। कार्बन और हाइड्रोजन से भरपूर होने के नाते वे हाइड्रोफोबिक भी हैं और जैविक संदूषकों के लिए एक विलायक और अवशोषण वाहक के रूप में कार्य कर सकते हैं और इस प्रकार समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों में प्रदूषक जैव संचय के चालक हो सकते हैं। उनकी हाइड्रोफोबिक प्रकृति समुद्री जल या जैविक नमूनों से उनके अलगाव की सुविधा प्रदान करती है: समुद्री लिपिड विश्लेषण नमूने के साथ शुरू होता है और फिर गैर-ध्रुवीय कार्बनिक सॉल्वैंट्स में निष्कर्षण, एक जलीय मैट्रिक्स में अन्य पदार्थों से उनके अलगाव के लिए एक सुविधाजनक विधि प्रदान करता है।

यदि समुद्री जल का नमूना लिया गया है, तो पहला कदम आमतौर पर परिचालन रूप से परिभाषित 'भंग' और छानने के द्वारा 'कण' गुटों में अलगाव शामिल है। नमूने एकत्र किए जाते हैं और लिपिड आमतौर पर नमूने मैट्रिक्स से अलग होते हैं, जो वास्तव में भंग पदार्थ और कॉलॉइड के लिए क्लोरोफॉर्म के साथ होते हैं, और ठोस और जैविक नमूनों के लिए क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल के मिश्रण के साथ। इस तरह के अर्क में बायोजेनिक और मानवजनित स्रोतों से कई वर्ग हो सकते हैं। इस समय, कुल लिपिड और लिपिड कक्षाएं निर्धारित की जा सकती हैं। कुल लिपिड को व्यक्तिगत रूप से निर्धारित लिपिड वर्गों को संक्षेप में मापा जा सकता है जिन्हें प्रथागत रूप से अलग किया गया है। फ्लेम आयनीकरण डिटेक्शन (एफआईडी) के साथ पतली परत क्रोमेटोग्राफी (टीएलसी) का उपयोग नियमित रूप से समुद्री नमूनों से लिपिड के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जाता है। टीएलसी-एफआईडी सारांश लिपिड वर्ग की जानकारी प्रस्तुत करता है और, कक्षाओं को संक्षेप में, कुल लिपिड माप।

लिपिड वर्ग की जानकारी लिपिड अर्क से उनकी रिहाई के बाद व्यक्तिगत घटकों जैसे, फैटी एसिड और/या स्टेरोल के माप के साथ संयुक्त होने पर विशेष रूप से उपयोगी होती है । लिपिड संरचनाओं और कार्यों की विस्तृत विविधता का मतलब है कि वे मोटे तौर पर पारिस्थितिकी तंत्र स्वास्थ्य और मानवजनित प्रभावों द्वारा प्रभाव की डिग्री का आकलन पारिस्थितिकीय और बायोजियोकेमिकल अनुसंधान में उपयोग किया जाता है। उन्हें समुद्री जीवों (जैसे, एक्वाफीड और/या शिकार) के लिए आहार मूल्य के पदार्थों को मापने के लिए नियोजित किया गया है, और पानी की गुणवत्ता (जैसे, हाइड्रोकार्बन) के संकेतक के रूप में ।

Introduction

यहां वर्णित तरीकों से संबंधित पदार्थ हैं जिन्हें परिचालन रूप से समुद्री लिपिड के रूप में परिभाषित किया गया है। यह परिभाषा गैर-ध्रुवीय कार्बनिक सॉल्वैंट्स में तरल-तरल निष्कर्षण के लिए उनकी उत्तरदायीता पर आधारित है, और यह जलीय मैट्रिक्स में अन्य पदार्थों से उनके अलगाव के लिए एक सुविधाजनक विधि प्रदान करता है। उनकी हाइड्रोफोबिक प्रकृति समुद्री जल या जैविक नमूनों से उनके अलगाव के साथ-साथ उनके संवर्धन और लवण और प्रोटीन को हटाने की सुविधा प्रदान करती है।

लिपिड सामग्री का मापन और समुद्री जीवों में इसकी संरचना दशकों से खाद्य वेब पारिस्थितिकी, जलकृषि पोषण और खाद्य विज्ञान में काफी रुचि रही है। लिपिड जीवित जीवों में सार्वभौमिक घटक हैं, जो कोशिका झिल्ली में आवश्यक अणुओं के रूप में कार्य करते हैं, जैव उपलब्ध ऊर्जा के प्रमुख स्रोतों के रूप में, थर्मल इन्सुलेशन और उछाल प्रदान करते हैं, और संकेत अणुओं के रूप में कार्य करते हैं। हालांकि अन्य क्षेत्रों में लिपिड निर्धारण के लिए प्रक्रियाओं को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, समुद्री नमूनों के साथ उनके उपयोग को आमतौर पर क्षेत्र की स्थितियों के साथ-साथ नमूना प्रकार1के अनुकूल करने के लिए संशोधन की आवश्यकता होती है।

समुद्री जल के नमूनों के लिए, पहला कदम आमतौर पर परिचालन रूप से परिभाषित 'भंग' और 'कण' अंशों में अलगाव की आवश्यकता होती है, आम तौर पर निस्पंदन (प्रोटोकॉल चरण 1) द्वारा। कण अंश वह है जो फ़िल्टर द्वारा बनाए रखा जाता है, और छिद्रों का आकार कट-ऑफ2को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण है। अक्सर जब हम पार्टिकुलेट मैटर का नमूना लेते हैं, तो हम लिपिड सांद्रता को कुल जन सांद्रता से संबंधित करना चाहते हैं, जिस स्थिति में इस उद्देश्य के लिए एक अलग, छोटे, नमूना (जैसे, 10 एमएल) लिया जाना चाहिए (प्रोटोकॉल चरण 1, नोट)। एक सटीक सामूहिक दृढ़ संकल्प प्राप्त करने के लिए फिल्ट्रेशन के अंत में अमोनियम फोर्टमेट (35 ग्राम/एल) जोड़ना महत्वपूर्ण है।

बड़े नमूने से समुद्री जल फिल्ट्रेट नमूना प्रकार के आधार पर 250 एमएल और 1 एल के बीच होना चाहिए और एक विभाजक कीप (प्रोटोकॉल चरण 2) में तरल-तरल निष्कर्षण के अधीन है। लिपिड की हाइड्रोफोबिक प्रकृति का मतलब है कि उन्हें क्लोरोफॉर्म जैसे नॉनपोलर सॉल्वेंट में निष्कर्षण द्वारा अन्य यौगिकों से अलग किया जा सकता है। एक दो-परत प्रणाली बनाई जाती है जहां लिपिड कार्बनिक परत में विभाजित होते हैं जबकि पानी में घुलनशील घटक जलीय परत में रहते हैं।

एक फिल्टर पर कण नमूने, या जैविक नमूनों को एक संशोधित फोल्च एट अल निष्कर्षण 3 के साथ निकालाजाताहै, जिसमें क्लोरोफॉर्म (प्रोटोकॉल चरण 3) भी शामिल है। फिर, एक कार्बनिक/जलीय प्रणाली बनाई जाती है जिसमें लिपिड कार्बनिक चरण में विभाजित होते हैं, जबकि पानी में घुलनशील अणु जलीय चरण में रहते हैं, और प्रोटीन उपजी होती है । वास्तव में, ठोस के लिए, अधिकांश प्रयोगशालाएं क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल से जुड़ी फोल्च एट अल निष्कर्षण3 प्रक्रिया के कुछ भिन्नता का उपयोग करती हैं। फिल्टर के लिए, पहला कदम क्लोरोफॉर्म के 2 एमएल और मेथनॉल के 1 एमसीएल में समरूप होना है।

निष्कर्षण के दौरान, एस्टर बॉन्ड हाइड्रोलिसिस या कार्बन-कार्बन डबल बॉन्ड ऑक्सीकरण को कम करने के लिए बर्फ पर नमूने और सॉल्वैंट्स रखकर, रासायनिक या एंजाइमीय संशोधन से लिपिड की रक्षा करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। ऊतक और कोशिका लिपिड प्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंट और कंपार्टमेंटलाइजेशन द्वारा काफी अच्छी तरह से संरक्षित हैं4; हालांकि, नमूनों के समरूपता के बाद, सेल सामग्री को रासायनिक या एंजाइमेटिक रूप से परिवर्तन, अधिक निपटाने के लिए लिपिड को और अधिक निपटाया जाता है। कुछ लिपिड, जैसे कि अधिकांश स्टेरॉल, बहुत स्थिर होते हैं, जबकि अन्य, जैसे पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड वाले, रासायनिक ऑक्सीकरण के लिए अधिक संवेदनशील होते हैं। अन्य, जैसे कि संयुक्त दोहरे बांड वाले स्टेरोल, प्रकाश5द्वारा उत्प्रेरित ऑक्सीकरण से ग्रस्त होते हैं। निष्कर्षण के बाद, लिपिड रासायनिक ऑक्सीकरण के लिए बहुत अधिक संवेदनशील होते हैं, और नमूनों को नाइट्रोजन जैसी निष्क्रिय गैस के तहत संग्रहीत किया जाना चाहिए। नाइट्रोजन की एक कोमल धारा भी अर्क ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।

एकाग्रता के बाद, लिपिड तो आम तौर पर थोक में मात्रा निर्धारित किया जाएगा के रूप में वे समुद्री ऊर्जा की एक उच्च एकाग्रता प्रदान पारिस्थितिकी प्रणालियों का एक महत्वपूर्ण घटक हैं, दो बार से अधिक केजे/कार्बोहाइड्रेट और प्रोटीन के जी । निरपवाद रूप से वे अगले व्यक्तिगत घटकों के रूप में निर्धारित किया जाएगा: लिपिड के व्यापक विश्लेषण आम तौर पर सरल श्रेणियों में जुदाई शामिल है, उनके रासायनिक प्रकृति के अनुसार । इस प्रकार, एक पूर्ण विश्लेषण में कुल लिपिड, लिपिड कक्षाएं और व्यक्तिगत यौगिकों को मापना शामिल है।

कुल लिपिड का निर्धारण क्रोमेटोग्राफी6द्वारा अलग किए गए व्यक्तिगत रूप से मापा गया लिपिड कक्षाओं का योग लेकर किया जा सकता है । एक समुद्री लिपिड निकालने में बायोजेनिक और मानवजनित स्रोतों से एक दर्जन से अधिक वर्ग हो सकते हैं। लिपिड संरचनाओं की विस्तृत विविधता का मतलब है कि संरचनाओं के व्यक्तिगत समूहों का निर्धारण करके बहुत जानकारी प्राप्त की जा सकती है। लिपिड वर्गों को व्यक्तिगत रूप से, या कुछ समूहों में, कुछ प्रकार के जीवों की उपस्थिति के संकेत के साथ-साथ उनकी शारीरिक स्थिति और गतिविधि2का उपयोग किया गया है। वे भी कार्बनिक सामग्री की उत्पत्ति के एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया गया है, भंग कार्बनिक पदार्थ (डोम) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हाइड्रोफोबिक संदूषकों सहित ।

ट्राइसिलिग्लिसेरोल, फॉस्फोलिपिड और स्टेरोल अधिक महत्वपूर्ण बायोजेनिक लिपिड कक्षाओं में से हैं। पहले दो जैव रासायनिक रूप से संबंधित हैं क्योंकि उनके पास ग्लिसरोल बैकबोन है जिसके पास दो या तीन फैटी एसिड को एस्टरिफाइड किया गया है(चित्र 1)। ट्राइसिलेग्लिसॉल, मोम एस्टर के साथ मिलकर बहुत महत्वपूर्ण भंडारण पदार्थ होते हैं, जबकि अन्य फैटी एसिड युक्त लिपिड कक्षाएं जैसे डिसिलेग्लिसॉल, मुफ्त फैटी एसिड और मोनोसिल्ग्लिसेरोल आम तौर पर मामूली घटक होते हैं। जीवित जीवों में कम सांद्रता पर मुफ्त फैटी एसिड मौजूद होते हैं, क्योंकि असंतृप्त लोग जहरीले हो सकते हैं7। स्टेरोल (उनके मुफ्त और एस्टरिफाइड दोनों रूपों में) और फैटी अल्कोहल को भी कम ध्रुवीय लिपिड के बीच शामिल किया जाता है, जबकि ग्लाइकोलिपिड और फॉस्फोलिपिड ध्रुवीय लिपिड होते हैं। ध्रुवीय लिपिड में एक हाइड्रोफिलिक समूह होता है, जो कोशिका झिल्ली में पाए जाने वाले लिपिड बिलायर के गठन की अनुमति देता है। मुफ्त स्टेरोल भी झिल्ली संरचनात्मक घटक हैं, और जब अनुपात में ट्राइसिलालीसेरोल में लिया जाता है तो वे एक स्थिति या पोषण सूचकांक (टैग: एसटी) प्रदान करते हैं जिसका व्यापक रूप से उपयोग किया गया है8। जब फॉस्फोलिपिड्स (एसटी: पीएल) के अनुपात में लिया जाता है तो उनका उपयोग नमक के प्रति पौधों की संवेदनशीलता को इंगित करने के लिए किया जा सकता है: उच्च मूल्य संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखते हैं और झिल्ली पारगम्यता को कम करते हैं9। तापमान अनुकूलन10के दौरान बाइवाल्व ऊतकों में इस अनुपात (पीएल: एसटी) के विलोम का अध्ययन किया गया है।

समुद्री लिपिड कक्षाओं को सिलिका जेल कोटेड छड़ (प्रोटोकॉल चरण 4) पर पतली परत क्रोमेटोग्राफी (टीएलसी) द्वारा अलग किया जा सकता है और फिर स्वचालित एफआईडी स्कैनर में फ्लेम आयनाइजेशन डिटेक्शन (एफआईडी) द्वारा पता लगाया और मात्रा निर्धारित की जा सकती है। टीएलसी/एफआईडी नियमित रूप से समुद्री नमूनों के लिए इस्तेमाल किया गया है के रूप में यह तेजी से छोटे नमूनों से सारांश लिपिड वर्ग डेटा प्रस्तुत करता है, और सभी वर्गों का योग लेने के द्वारा, कुल लिपिड के लिए एक मूल्य । टीएलसी/एफआईआईडी को गुणवत्ता-आश्वासन (क्यूए) मूल्यांकन के अधीन किया गया है और इसे लगातार बाहरी अंशांकन, कम रिक्त स्थान, और सटीक दोहराने विश्लेषण11के लिए आवश्यक मानकों को पूरा करने के लिए पाया गया था । भिन्नता (सीवी) या सापेक्ष मानक विचलन के गुणांक लगभग 10% हैं, और एफआईडी स्कैनर कुल लिपिड डेटा सामान्य रूप से ग्रेविमेट्रिक और अन्य तरीकों द्वारा प्राप्त किए गए लगभग 90% हैं2। ग्रेविमेट्री उच्च कुल लिपिड की संभावना देता है क्योंकि एफआईडी स्कैनर केवल गैर-अस्थिर यौगिकों को मापता है, और ग्रेविमेट्रिक मापों में गैर-लिपिड सामग्री के संभावित समावेश के परिणामस्वरूप भी।

लिपिड वर्ग विश्लेषण द्वारा प्रदान की गई जानकारी विशेष रूप से उपयोगी है जब व्यक्तियों, या स्टेरॉल, या संयोजन में दो के रूप में फैटी एसिड के निर्धारण के साथ संयुक्त । इन विश्लेषणों की दिशा में पहला कदम लिपिड अर्क (प्रोटोकॉल चरण 5) में स्टेरॉल के साथ सभी घटक फैटी एसिड की रिहाई शामिल है। लिपिड संरचनाओं और कार्यों की विस्तृत विविधता का मतलब है कि उन्होंने पारिस्थितिकी तंत्र के स्वास्थ्य का आकलन करने वाले पारिस्थितिक और बायोजियोकेमिकल अध्ययनों में व्यापक उपयोग देखा है और मानवजनित और स्थलीय आदानों से वे किस हद तक प्रभावित हुए हैं। उनका उपयोग समुद्री जीवों के लिए आहार मूल्य के पदार्थों के जैव संश्लेषण को मापने के साथ-साथ पानी के नमूनों की गुणवत्ता को इंगित करने के लिए किया गया है । तलछट कोर नमूनों में लिपिड को मापने से भूमि-समुद्र मार्जिन के पास मानव भूमि उपयोग में परिवर्तन के लिए तलछट की संवेदनशीलता दिखाने में मदद मिलती है ।

व्यक्तिगत लिपिड यौगिकों की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए प्राथमिक उपकरण पारंपरिक रूप से एफआईडी के साथ गैस क्रोमेटोग्राफी (जीसी) रहा है। विश्लेषण से पहले हालांकि, इन यौगिकों को व्युत्पन्न करके अधिक अस्थिर बना दिया जाता है। फैटी एसिड एक अम्लीय उत्प्रेरक (एच2एसओ4)की उपस्थिति में एसील लिपिड कक्षाओं(चित्रा 1)से जारी किए जाते हैं। ऑर्गेनिक केमिस्ट्री में, एसीआईएल समूह (आर-सी = ओ) आमतौर पर कार्बोक्सिलिक एसिड (आर-सीओओएच) से लिया जाता है। वे तो फिर से फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (प्रसिद्धि) जो जीसी कॉलम (प्रोटोकॉल चरण 5) पर बेहतर जुदाई देता है के लिए esterified हैं ।

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Protocol

नोट: लिपिड विश्लेषण के लिए कांच के बर्तन, उपकरण और फिल्टर साफ करने के लिए, उन्हें मेथनॉल के साथ 3 बार धोएं और इसके बाद क्लोरोफॉर्म के साथ 3 वॉश करें, या उन्हें कम से कम 8 घंटे के लिए 450 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।

1. समुद्री जल भंग और कण लिपिड के लिए छानने का काम प्रक्रिया

नोट: ब्याज का विशेष अंश परिचालन रूप से निस्पंदन प्रक्रिया द्वारा परिभाषित किया गया है। इस मामले में ताकना का आकार 1.2 माइक्रोन है।

  1. एक फिल्टर के बिना छानने का काम कई गुना सेट करें और फ़िल्टर समुद्री जल के साथ सेटअप कुल्ला।
  2. स्वच्छ संदंश का उपयोग एक ४७ मिमी ग्लास फाइबर (GF/C) फिल्टर, कि धोया गया है, साफ छानने का काम प्रणाली में जगह है ।
  3. नमूना लें और संग्रह कंटेनर के तल पर बसे किसी भी सामग्री को फिर से खर्च करने के लिए धीरे-धीरे घूमता है। इस मामले में 1 एल, एक ज्ञात मात्रा को सटीक रूप से मापें, और इसे फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    नोट: मात्रा नमूने में कण सामग्री की मात्रा पर निर्भर करेगा: आमतौर पर मौसम और स्थान के आधार पर 250 एमएल और 5 एल के बीच।
  4. जब नमूना मापा गया है, धीरे फ़िल्टर समुद्री जल के साथ फिल्टर गीला । पूरे नमूने को धीरे-धीरे फिल्ट्रेशन सिस्टम में जोड़ें और फ़िल्टर किए गए समुद्री जल के साथ स्नातक सिलेंडर को कुल्ला करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी कणों को फ़िल्टर में जोड़ा जाए। सभी कणों को फिल्टर पर नीचे धोया जाता है सुनिश्चित करने के लिए पक्षों पर फ़िल्टर समुद्र के पानी के साथ सेटअप कुल्ला ।
    1. सभी समुद्री जल को फिल्टर के माध्यम से गुजरने की अनुमति दें लेकिन फ़िल्टर को पूरी तरह से सूखने की अनुमति न दें क्योंकि यह फ़िल्टर पर कोशिकाओं को बाधित कर सकता है; पानी के आखिरी गायब हो जाने के रूप में सक्शन तोड़ें।
  5. साफ संदंश और एक साफ पिपेट का उपयोग करना, फिल्टर को आधे में मोड़ें, फिर तिहाई में और फिर आधे लंबाई में फिल्टर को ट्यूब में रोल करने के लिए। इसे एक साफ, लेबल 10 एमएल ग्लास शीशी में रखें।
  6. फिल्टर को क्लोरोफॉर्म के 2 एमएल से कवर करें। पीएफई टेप के साथ नाइट्रोजन और सील के साथ सिर की जगह भरें। एक रैक में -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें। एक साल तक इस तापमान पर नमूने स्थिर रहेंगे।
    नोट: कुल जन सांद्रता के लिए लिपिड सांद्रता से संबंधित करने के लिए, एक शुष्क वजन माप की भी जरूरत है । इसमें एक सूखे वजन छानने का काम सेटअप में 24 मिमी पूर्व-तौला फिल्टर डालना, नमूना सरगर्मी और एक छोटा सा सबसैंपल लेना शामिल है जिसे छोटे फिल्टर पर फ़िल्टर किया जाता है। जब फिल्टर लगभग सूखा होता है, तो 3.5% अमोनियम फोरमेट के लगभग 10 एमएल को फ़िल्टर में जोड़ा जाता है। फिल्टर आधे में मुड़ा हुआ है, एक लेबल पेट्री डिश को वापस कर दिया और एक फ्रीजर में रखा ।

2. समुद्री जल या तरल नमूनों का तरल-तरल निष्कर्षण

  1. नमूना प्रीपिंग
    1. एक लिपिड साफ ग्लास स्नातक सिलेंडर में फिलट्रेट की एक ज्ञात मात्रा को मापें। इस नमूने को एक साफ 1 एल विभाजक कीप में रखें। फिर नमूने में क्लोरोफॉर्म के 20 एमएल जोड़ें और 2 मिनट के लिए हिलाएं, अक्सर निकालें।
  2. पहले निकालने और पहले जुदाई के बाद एसिड के अलावा को हटाने
    1. एल्यूमीनियम पन्नी में कीप लपेटें और जुदाई होने के लिए 5 से 10 मिनट रुको । दो परतों को देखने के लिए पन्नी के नीचे वापस छील। स्टॉपकॉक के माध्यम से नीचे, कार्बनिक परत को एक साफ गोल तली फ्लास्क में ले जाएं, सावधान रहें कि किसी भी शीर्ष परत को शामिल न करें। नाइट्रोजन के नीचे गोल तली फ्लास्क को कैप करें और फ्रीजर में रखें।
    2. प्रत्येक लीटर के नमूने के लिए केंद्रित एच 2 एसओ 4 का0.25 एमएल जोड़ें, सेपररी कीप में नमूने में और कीप को धीरे-धीरे हिलाएं।
    3. क्लोरोफॉर्म के 10 एमएल जोड़ें और बार-बार निकालते समय 2 मिनट के लिए सख्ती से हिलाएं। पृथक्करण को घटित होने दीजिए।
  3. दूसरा और तीसरा अलगाव
    1. जुदाई के लिए प्रतीक्षा करें और गोल तली फ्लास्क में नीचे की परत जोड़ें।
    2. क्लोरोफॉर्म का एक तिहाई 10 एमएल जोड़ें, और 2 मिनट के लिए हिलाएं, फिर से अक्सर निकालें। अलग होने के बाद, नीचे की परत को गोल तली फ्लास्क में जोड़ें।
    3. गोल तली फ्लास्क में निकालने को रोटरी वाष्पीकरण में स्थानांतरित करें, वाष्पीकरण करें और 2 एमएल शीशी में स्थानांतरित करें।

3. ठोस के लिए निष्कर्षण प्रोटोकॉल (संशोधित फोल्च एट अल3 निष्कर्षण)

  1. सेटअप
    नोट: निष्कर्षण सेटअप बर्फ से भरा एक अछूता कंटेनर की आवश्यकता है । सॉल्वैंट्स में मेथनॉल, क्लोरोफॉर्म निकाले गए पानी और 2:1 क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल शामिल हैं। सभी सॉल्वेंट को बर्फ पर रखा जाना चाहिए ताकि एक्सट्रैक्ट शुरू होने के समय तक वे ठंडे पड़ जाएं। सैंपल बर्फ पर भी जाते हैं, जिससे सब कुछ ठंडा रहता है।
    1. सभी ट्यूबों और PTFE लाइन में खड़ा टोपियां मेथनॉल के साथ 3 बार और फिर क्लोरोफॉर्म के साथ 3 बार कुल्ला । प्रत्येक निष्कर्षण के लिए एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और एक टोपी के साथ एक 15 एमएल शीशी की आवश्यकता होती है।
    2. नमूने को क्लोरोफॉर्म के 2 एमएल युक्त सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें। नमूने का आकार मौजूद लिपिड की मात्रा पर निर्भर करता है, लगभग 5 से 10 मिलीग्राम लिपिड पसंद किया जाता है।
  2. पीसने और निष्कर्षण
    1. बर्फ के लगभग 1 मिलीएल-ठंडे मेथनॉल जोड़ें और एक साफ समरूप या PTFE/धातु समाप्त रॉड के साथ जल्दी से एक लुगदी में नमूना पीस ।
    2. रॉड को लगभग 1 एमएल बर्फ-ठंडे 2:1 क्लोरोफॉर्म के साथ ट्यूब में वापस धोएं: मेथनॉल और फिर 1/2 मिलील बर्फ-ठंडे क्लोरोफॉर्म-निकाले गए पानी के साथ। यदि आवश्यक हो, तो धोने से पहले कणों को शीशी में वापस लाने के लिए संदंश के एक साफ सेट का उपयोग करें। ट्यूब को कैप करें और मिश्रण को अल्ट्रासोनिक बाथ (35 - 42 किलोहर्ट्ज) में 4 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
  3. डबल पिपटिंग: 1800 × ग्रामपर 2 मिनट के लिए नमूना सेंट्रलाइज करें। डबल पाइपटिंग तकनीक का उपयोग करके पूरे कार्बनिक परत (नीचे की परत) को इकट्ठा करें जिसमें बल्ब के साथ 5 3/4 "पिपेट को धीरे से दो परतों के माध्यम से धक्का दिया जाता है, जबकि बल्ब फैलाएंगे, जिससे बुलबुले बाहर आ जाते हैं।
    1. जब दूसरी परत के नीचे पहुंच जाता है, तो कार्बनिक परत को पिपेट में खींचे बिना बल्ब को हटाने के लिए अंगूठे का उपयोग करें। 5 3/4 "एक के अंदर एक 9"पिपेट रखें और 5 3/4 "पिपेट के माध्यम से नीचे की परत को हटा दें।
    2. अर्क को एक साफ शीशी में रखें। नीचे की परत को तब तक उतारते रहें जब तक कि यह सब हटा न जाए।
  4. वाशिंग पिपेट:9 "पिपेट को कार्बनिक परत में कुल्ला करें जिसमें 1.5 एमएल बर्फ-ठंडे क्लोरोफॉर्म का उपयोग करके पिपेट के बाहर और 1.5 एमएल को अंदर धोने के लिए नीचे धोने के लिए कार्बनिक परत का उपयोग किया जाता है। धोने के दौरान धीरे-धीरे उस पिपेट को चालू करें और सुनिश्चित करें कि सभी क्लोरोफॉर्म पिपेट को शीशी में चलाएं।
    1. उसी तरह जलीय परत युक्त ट्यूब में 5 3/4 "पिपेट कुल्ला।
  5. हर बार नए पिपेट का उपयोग करके, अलग होने पर नमूनों और डबल पिपेट को सोनिकेट और अपकेंद्रित्र करें। कम से कम तीन बार दोहराएं और सभी कार्बनिक परतों को पूल करें। तीसरी बार ऑर्गेनिक लेयर को हटाने के बाद दोनों पिपेट को ऑर्गेनिक लेयर वाली शीशी में धो लें।
  6. नाइट्रोजन की एक कोमल धारा का उपयोग करना, मात्रा के लिए नीचे ध्यान केंद्रित है, तो PTFE टेप के साथ सील और एक फ्रीजर में स्टोर ।

4. समुद्री लिपिड वर्गों के रॉड टीएलसी जुदाई के लिए सिस्टम और कदम विकसित करना

  1. टीएलसी के लिए छड़ प्रीपिंग
    1. तीन बार ऑटोमैटिक एफिड स्कैनर में छड़ को ब्लैंक स्कैन करें
    2. एक नमूना खोलना:मूल पर या उसके ठीक नीचे छड़ के लिए एक सिरिंज के साथ नमूने और मानकों को लागू करें। 0.5 माइक्रोन बांटें और छड़ी को ड्रॉप को छूएं। एक ही स्थान पर अगली बूंद रखने से पहले सूखने की अनुमति दें। छड़ पर एक लाइन में सभी नमूनों हाजिर।
    3. एसीटोन में ध्यान केंद्रित करना: एसीटोन के70 एमएल में दो बार (तीन बार यदि नमूने बहुत केंद्रित हैं) पर ध्यान केंद्रित करें। सॉल्वेंट फ्रंट देखें क्योंकि यह रॉड पर चढ़ता है जब तक कि स्पॉट के नीचे शीर्ष के साथ विलीन नहीं हो जाता। छड़ निकालें, उन्हें लगभग 5 एस के लिए सुखाएं, फिर रॉड के नीचे लिपिड सामग्री के एक संकीर्ण बैंड का उत्पादन करने की प्रक्रिया दोहराएं।
    4. सूखी और 5 मिनट के लिए एक निरंतर आर्द्रता कक्ष में छड़ की स्थिति। एक निरंतर आर्द्रता कक्ष प्लेट के नीचे कैल्शियम क्लोराइड के संतृप्त समाधान के साथ एक डिसिकेटर है।
  2. अनुक्रम पहले क्रोमाटोग्राम (हाइड्रोकार्बन से कीटोन) के लिए अग्रणी
    1. पहली विकास प्रणाली:पहली विकास प्रणाली हेक्साने: डाईथाइल ईथर: फोर्मिक एसिड, 98.95:1:0.05 है। फोर्मिक एसिड जोड़ने के लिए सिरिंज का इस्तेमाल करें लेकिन सबसे पहले सिरिंज को 3× को फोर्मिक एसिड से कुल्ला करें। क्लोरोफॉर्म के साथ तुरंत बाद सिरिंज से बाहर फॉर्मिक एसिड कुल्ला। कागज को गीला करने और टैंक को कुल्ला करने के लिए मिश्रण के 30 एमएल का उपयोग करें। कुल्ला समाधान त्यागें और शेष 70 एमएल को टैंक में जोड़ें।
      1. रैक लें और धीरे-धीरे उन्हें टैंक में कम करें। जब तक सॉल्वेंट फ्रंट सैंपल स्पॉट तक नहीं पहुंचता, तब तक देखें, फिर टाइमर शुरू करें। 25 मिनट के बाद, विकास कक्ष से छड़ निकालें, 5 मिनट के लिए निरंतर आर्द्रता कक्ष में सूखें, और एक और 20 मिनट के लिए एक ही समाधान में पुनर्विकास करें।
    2. स्वचालित एफिड स्कैनर में 5 मिनट के लिए छड़ सूखी और फिर 25 के पीपीएस स्कैन का उपयोग कर कीटोन चोटी के पीछे सबसे कम बिंदु पर स्कैन करें ।
  3. दूसरे क्रोमेटोग्राम (ट्राइसिल्ग्लाइसेरोल से डिसिल्लाइसरोल तक) के लिए अग्रणी अनुक्रम):
    1. लगातार आर्द्रता कक्ष में 5 मिनट के लिए छड़ की स्थिति।
    2. दूसरी विकास प्रणाली:दूसरी विकास प्रणाली हेक्साने: डाईथाइल ईथर: फोर्मिक एसिड, 79:20:1 है। कागज गीला और टैंक कुल्ला करने के लिए विकास टैंक में ~ 30 एमएल जोड़ें। फिर शेष 70 एमएल में 40 मिनट के लिए छड़ को त्यागें और विकसित करें। टैग (संतृप्त) और टैग (पॉलीअनसैचुरेटेड) चोटियों के बीच सबसे अच्छा अलगाव के लिए 79.9:20:0.1 के मिश्रण का उपयोग करें, लेकिन अनुसूचित जनजाति और डेग चोटियों के पृथक्करण के लिए 79:20:1 के मिश्रण का उपयोग करें ।
    3. एक दूसरे आंशिक स्कैन में एक पीपीएस स्कैन 11 का उपयोग कर में diacylglycerol चोटी के पीछे सबसे कम बिंदु पर सूखी और स्कैन ।
  4. तीसरे क्रोमेटोग्राम (एसीटोन-मोबाइल ध्रुवीय लिपिड और फॉस्फोलिपिड) के लिए अग्रणी अनुक्रम
    1. लगातार आर्द्रता कक्ष में 5 मिनट के लिए छड़ की स्थिति।
    2. एसीटोन के 70 एमएल में 15 मिनट के लिए छड़ को दो बार विकसित करें। विकास के बीच हवा के बारे में 30 सेकंड के लिए छड़ सूखी ।
    3. लगातार आर्द्रता कक्ष में 5 मिनट के लिए छड़ की स्थिति।
    4. तीसरी विकास प्रणाली:तीसरी विकास प्रणाली क्लोरोफॉर्म, मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म से निकाले गए पानी, 50:40:10 का मिश्रण है। मिश्रण के 70 एमएल में 10 मिनट के लिए छड़ को दो बार विकसित करें। विकास के बीच, हवा लगभग 30 सेकंड के लिए छड़ सूखी।
    5. छड़ की पूरी लंबाई सूखी और स्कैन करें।

5. मेओएच में एच2एसओ4 के साथ फेम व्युत्पन्न

  1. हिलखाई को अभिकर् ता बनाना
    1. मेथनॉल तैयार करना:एक साफ वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में मेओएच के 100 एमएल रखें और फिर धीरे-धीरे फ्लास्क के नीचे कवर होने तक निर्जलनासो 4 में छिड़कें। एक बार कवर, दो बार उलटा ताकि मेथनॉल में किसी भी पानी NaSO4द्वारा अवशोषित कर लिया है । उलटा और मिलाने के बाद, इसे कम से कम 5 मिनट तक बैठने दें।
    2. एसिड जोड़ना:धीरे-धीरे मेथनॉल को ग्लास जार में डिकंट करें (अब तकनासो 4 फ्लास्क के नीचे एक कठिन गांठ है) और एच2एसओ4 जोड़ा जाता है। धीरे-धीरे एक पिपेट का उपयोग करके मेथनॉल में 1.5 एमएल सल्फ्यूरिक एसिड जोड़ें। एक समय में कुछ बूंदें जोड़ें और एक बार सभी एसिड जोड़ा गया है, टोपी और धीरे मिश्रण करने के लिए हलचल । समाधान अब डेरिवेटिव के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है, लेकिन यह एक साप्ताहिक आधार पर बनाया जाना चाहिए ।
  2. डेरिवेटिव बनाना
    1. एक निकालने की शीशी से लिपिड के लगभग 200 माइक्रोग्राम स्थानांतरित करें जिसमें मात्रा एक ज्ञात राशि तक लाई गई है, एक स्वच्छ, 15 एमएल शीशी में और नाइट्रोजन के नीचे सूखापन के लिए वाष्पित हो जाता है। निकाली गई राशि का निर्धारण टीएलसी/एफआईआईडी से लिए गए नमूने की एकाग्रता से किया जाएगा। नमूना निकालने के लिए एक साफ पिपेट का उपयोग करें।
    2. जब नमूना सूख गया है, तो डाइक्लोरोमेथेन के 1.5 एमएल और नए बनाए गए हिल्डिच रिएजेंट के 3 एमएल जोड़ें।
    3. भंवर नमूना, और कांच की शीशी का पालन किया है कि लिपिड को हटाने के लिए 4 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में इसे sonicate । नाइट्रोजन, टोपी के साथ शीशी भरें, और 1 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर PTFE टेप और गर्मी के साथ इसे सील।
  3. प्रतिक्रिया को रोकना
    1. नमूनों को ओवन से हटाने के बाद 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान को पूरी तरह से ठंडा करने की अनुमति दें, फिर शीशियों को ध्यान से खोलें।
    2. धीरे-धीरे लगभग 0.5 एमएल सैचुरेटेड सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान (9 ग्राम/100 एमएल क्लोरोफॉर्म-निकाले गए पानी), फिर 1.5 एमएल हेक्सेन जोड़ें। शीशी को हिलाएं या भंवर करें, फिर खड़े होने दें ताकि यह 2 परतों में अलग हो जाए।
  4. प्रसिद्धि का संग्रह
    1. शीर्ष परत को हटाना:एक बार व्युत्पन्नीकरण रोक दिया गया है, और स्पष्ट पृथक्करण है, ऊपरी, कार्बनिक चरण को हटा दें और लिपिड क्लीन 2 एमएल शीशी में रखें।
    2. सूखापन के लिए 2 एमएल शीशी में सॉल्वेंट वाष्पित करें और इसे हेक्सेन के साथ लगभग 0.5 एमएल तक फिर से भरें।
    3. नाइट्रोजन, टोपी के साथ शीशी के सिर अंतरिक्ष भरें और PTFE टेप के साथ शीशी सील, फैटी एसिड को फिर से निलंबित करने के लिए एक और 4 मिनट के लिए sonicate, और फिर यह जीसी के लिए जाने के लिए तैयार है ।
      नोट: यदि फैटी एसिड सांद्रता की आवश्यकता होती है, तो जलीय परत को हेक्सेन के साथ तीन बार धोया जाना चाहिए और 2 एमएल शीशी में जमा सभी कार्बनिक परतों को धोया जाना चाहिए। इसमें हेक्सेन के 2 एमएल जोड़ना, नमूना को भंवर देना, अपकेंद्रित्र करना और कार्बनिक परत को हटाना शामिल है, सभी को 3 बार दोहराया गया है।

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Representative Results

सबसे तेजी से बढ़ते खाद्य उत्पादन क्षेत्र के रूप में, बदलती आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए तकनीकी नवाचारों और अनुकूलनों के मामले में जलकृषि विकसित हो रहा है । इनमें से एक जंगली स्रोत मछली भोजन और मछली के तेल पर निर्भरता को कम करना है, जो कई जलकृषि प्रजातियों के लिए फ़ीड सामग्री प्रदान करते हैं । स्थलीय पौधे के तेलों को एक्वाफीड में मछली के तेल के लिए टिकाऊ और किफायती प्रतिस्थापन के रूप में जांच की जा रही है, और यकृत विश्लेषण के लिए एक लक्ष्य ऊतक है क्योंकि यह लिपिड चयापचय12के लिए प्राथमिक साइट है । चित्रा 2 हमारे नौ घटक मानक से प्राप्त कच्चे टीएलसी-FID क्रोमेटोग्राम से पता चलता है, एक आहार हम 7% पर मछली के तेल के साथ तैयार की और 5% पर रेपसीड तेल, और एक अटलांटिक सामन से जिगर के ऊतकों कि आहार खिलाया । तालिका 1 विभिन्न मछलियों से आहार प्रतिकृति और नमूनों का विश्लेषण करने के बाद प्राप्त डेटा दिखाता है। ये डेटा पीक सिंपल सॉफ्टवेयर (संस्करण 4.54) का उपयोग करके अर्क में लिपिड वर्गों की मात्रा निर्धारित करने के लिए स्कैनर एफआईडी प्रतिक्रियाओं से मानक घटता का निर्माण करने के बाद प्राप्त किए गए थे। डेटा आहार और यकृत में ट्राइसिलाग्लिसॉल की व्यापकता और यकृत में झिल्ली फॉस्फोलिपिड का महत्व भी दिखाते हैं।

महाद्वीपीय मार्जिन आम तौर पर बहुत उच्च जैविक उत्पादकता की सुविधा है और वे कार्बन की साइकिल चालन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं । सतह प्राथमिक उत्पादकता समुद्रतल तक पहुंचता है और इसलिए shallower पानी में समुद्रतल अधिक है, और इसलिए मात्रा और बेतिक खाद्य वेब में ऊपरी मिश्रित परत से बसने कणों की गुणवत्ता को मापने के बहुत रुचि है । कार्बन में समृद्ध होने और बहुत अधिक ऊर्जा सामग्री होने के नाते, लिपिड महाद्वीपीय अलमारियों की उत्पादकता के महत्वपूर्ण घटक हैं। ऐतिहासिक रूप से, न्यूफाउंडलैंड और लैब्राडोर से सटे पानी ने लगभग पांच शताब्दियों तक दुनिया के महानतम मत्स्य पालन में से एक का समर्थन किया, और हम इस प्रणाली13में लिपिड के उत्पादन और हस्तांतरण का अध्ययन कर रहे हैं। चित्रा 3 हमारे मानक से प्राप्त टीएलसी-एफआईडी क्रोमोटोग्राम दिखाता है, न्यूफाउंडलैंड के तट से 220 मीटर की दूरी पर एकत्र कण पदार्थ को निपटाने में लिपिड, और एक छोटे से माइसाइड में लिपिड, एरिथ्रोप्स एरिथ्रोफेटलमा एक ही गहराई के पास एकत्र किया गया। इस बार क्रोमेटोग्राम को प्लॉटिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से संसाधित किया गया है और दो आंशिक स्कैन को अंतिम पूर्ण स्कैन के साथ जोड़ा गया है । तालिका 2 पार्टिकुलेट मैटर और माइसिड निपटाने के नमूनों को दोहराने का विश्लेषण करने के बाद प्राप्त आंकड़ों को दर्शाता है । 5 फिला से 19 टैक्सा में, छोटे माईसिड ने औसतन, उच्चतम लिपिड एकाग्रता (गीले वजन का 6%)13था।

Figure 1
चित्रा 1:बढ़ती ध्रुवता के अनुमानित क्रम में समुद्री नमूनों में प्रिंसिपल लिपिड कक्षाएं। प्रत्येक संरचना चित्रा के दाईं ओर इशारा करते हुए अणु के सबसे हाइड्रोफोबिक भाग के साथ तैयार की जाती है। लिपिड वर्गों के लिए प्रतिनिधि यौगिक हैं:- हाइड्रोकार्बन: नॉनडेकेन; मोम एस्टर: हेक्साडेसिल पालमिटेट; स्टीरल एस्टर: कोलेस्टेरिल पलमिटेट; मिथाइल एस्टर: मिथाइल पलमिटेट; कीटोन: 3-हेक्साकैनानोन; ट्राइसिल्गालिसेरोल: त्रिपालमिटिन; मुक्त फैटी एसिड: पामिटिक एसिड; शराब: फाइटोल; स्टेरोल: कोलेस्ट्रॉल; diacylglycerol: डिपलमिटिओल ग्लिसेरोल; मोनोसिल्गलीसेरोल: मोनोपलमिटोइल ग्लिसरोल; ग्लाइकोलिपिड: डिग्लेक्टोसाइल डिसिल्लिसेरोल; फॉस्फोलिपिड: डिमलमिटोइल फॉस्फेटिडिलकोलिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:एक जलकृषि आहार प्रयोग से लिपिड संरचना के टीएलसी-एफआईडी क्रोमेटोग्राम। सिलिका जेल-लेपित टीएलसी छड़ पर अर्क देखा गया और लिपिड कक्षाओं को अलग करने के लिए एक तीन चरण की विकास प्रणाली का उपयोग किया गया था । पहली और दूसरी विकास प्रणालियां हेक्साने थीं: डाईथाइल ईथर: फोर्मिक एसिड (98.95:1:0.05) और (79.9:20:0.1) क्रमशः ट्राइसिलेग्लिसेरोल, मुफ्त फैटी एसिड, और स्वचालित FID स्कैनर में स्कैनिंग के लिए स्टीरोल सहित तटस्थ लिपिड को अलग करने के लिए। तीसरे विकास प्रणालियों में क्लोरोफॉर्म से पहले 100% एसीटोन शामिल थे: मेथनॉल: पानी (5:4:1) एसीटोन-मोबाइल ध्रुवीय लिपिड और फॉस्फोलिपिड को अलग करने के लिए। मानक घटता (यानी, नॉनडेकेन, कोलेस्टेरिल पलमिटेट, 3-हेक्साकनोन, त्रिपालमिटिन, मैलिटिक एसिड, सेटिल अल्कोहल, कोलेस्ट्रॉल, मोनोपलमिटोयल ग्लाइसरोल, डिपालमिटोइल फॉस्फेटिलकोलिन) का उपयोग पीक सिंपल सॉफ्टवेयर (संस्करण 4.54) का उपयोग करके अर्क में लिपिड कक्षाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:तटीय न्यूफाउंडलैंड से निकट-नीचे के नमूनों की लिपिड संरचना के टीएलसी-एफआईडी क्रोमेटोग्राम। a) नौ घटक मानक, ख) 220 मीटर गर्भाधान खाड़ी, न्यूफाउंडलैंड, सी) लिपिड कक्षाओं से मेसिड, एरिथ्रोप्स एरिथ्रोफेटलमा में व्यवस्थित कक्षाएं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मछली का तेल/रेपसीज तेल आहार अटलांटिक सामन जिगर
हाइड्रोकार्बन 1.3±0.9 0.5±0.2
स्टीरिल एस्टर/वैक्स एस्टर 0.4±0.6 0.6±0.3
एथिल एस्टर्स 0 0
मिथाइल एस्टर्स 0 0
एथिल कीटोन्स 0 0.3±0.2
मिथाइल कीटोन्स 0 0
ग्लाइसरिल ईथर 0 0
ट्राइसिलिग्लिसेरोल्स 145.0±26.3 16.9±8.1
फ्री फैटी एसिड 21.9±2.2 1.2±0.9
शराब 0 1.4±0.4
स्टेरोल्स 6.8±2.1 2.6±0.2
Diacylglycerols 0 0
एसीटोन मोबाइल पोलर लिपिड्स 14.0±2.5 2.2±0.6
फॉस्फोलिपिड्स 12.5±4.0 22.0±2.0
कुल लिपिड 201.8±27.4 47.7±11.8

तालिका 1: एक जलकृषि खिला प्रयोग में लिपिड संरचना। डेटा (मतलब±मान्य विचलन) एक प्रयोगात्मक आहार के 6.80% मछली के तेल और 4.80% रेपसीड तेल युक्त, के रूप में खिलाया (मिलीग्राम जी-1 गीला वजन), और अटलांटिक सामन के यकृत (एमजी जी-1 गीला वजन) 12 सप्ताह के लिए इस आहार को खिलाने के बाद कर रहे हैं।

पार्टिकुलेट मैटर का निपटारा एरिथ्रोप्स एरिथ्रोफटल्मा
स्टीरिल एस्टर/वैक्स एस्टर (% कुल लिपिड) 10.2±8.28 8.85±1.67
ट्राइसिलिग्लिसेरोल (% कुल लिपिड) 19.7±5.35 58.5±9.19
फॉस्फोलिपिड्स (% कुल लिपिड) 16.2 ± 3.51 21.4±5.35
तटस्थ लिपिड (% कुल लिपिड) 12.5±4.0 73.4±5.46
लिपोलिसिस इंडेक्स (%) 18.1±5.20 2.77±2.78
कुल लिपिड 0.57±0.25 5.86±1.44
तटस्थ लिपिड: हाइड्रोकार्बन, मोम और स्टीरल एस्टर, कीटोन्स, ट्राइसिलेग्लिसॉल, मुफ्त फैटी एसिड; (FFA), अल्कोहल (एएलसी), स्टेरोल, diacylglycerols; LI: लिपोलिसिस इंडेक्स [(FFA + ALC) (एसील लिपिड + एएलसी)-1]; कुल लिपिड (टीएलसी/एफआईडी निर्धारित लिपिड कक्षाओं की राशि) कण पदार्थ-% शुष्क वजन, Mysid-% गीला वजन

तालिका 2: तटीय न्यूफाउंडलैंड से निकट-नीचे नमूनों की लिपिड संरचना। डेटा (मतलब±मानवण) गर्भाधान खाड़ी ंयूफाउंडलैंड से कण पदार्थ निपटाने, और mysid, Erythrops erythrophtalma के हैं ।

फुटनोट: बेअसर लिपिड: हाइड्रोकार्बन, मोम और स्टीरल एस्टर, कीटोन्स, ट्राइसिलेग्लिसॉल, मुफ्त फैटी एसिड; (FFA), अल्कोहल (एएलसी), स्टेरोल, diacylglycerols; LI: लिपोलिसिस इंडेक्स [(FFA+ ALC) (एसील लिपिड + एएलसी)-1]; कुल लिपिड (एफआईडी निर्धारित लिपिड कक्षाओं की राशि) कण पदार्थ -% शुष्क वजन, Mysid - % गीला वजन।

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Discussion

जिस गति से टीएलसी-एफआईडी प्रणाली छोटे नमूनों से सारांश लिपिड वर्ग की जानकारी प्रदान करती है, वह टीएलसी-एफआईडी को अधिक शामिल विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं को शुरू करने से पहले समुद्री नमूनों की स्क्रीनिंग के लिए एक सक्षम उपकरण बनाती है । इस तरह के विश्लेषणों में आमतौर पर गैस क्रोमेटोग्राफी के मामले में अस्थिरता बढ़ाने के लिए लिपिड अर्क और व्युत्पन्नता से घटक यौगिकों को जारी करने की आवश्यकता होती है। जीसी-एफआईआईडी के साथ संयुक्त टीएलसी-एफआईआईडी को समुद्री भोजन और अन्य खाद्य पदार्थों14के अर्क के लिए एक शक्तिशाली संयोजन पाया गया है । सफल समुद्री लिपिड विश्लेषण के लिए यह महत्वपूर्ण है कि नमूनों में गिरावट और संदूषण के खिलाफ संरक्षित कर रहे है और है कि बड़ी देखभाल रॉड के लिए नमूना के आवेदन के साथ लिया जाता है । एक दृष्टिकोण यह है कि माइक्रोकैपिलरी पाइपटटर15का उपयोग करके पूरे समुद्री नमूने को रॉड पर लागू किया जाए और समुद्री नमूना प्रकारों में एक नवाचार समुद्री सतह के माइक्रोलेयर और एयरोसोल नमूनों को समुद्री जल नमूनों में जोड़ना है16.

स्वचालित स्कैनर में एफिड प्रणाली व्युत्पन्न या सफाई के बिना तेजी से माइक्रोग्राम क्वांटिटेशन प्रदान करती है; हालांकि, यह गैस क्रोमेग्राफ में पाए जाने वाले संवेदनशील, सटीक या रैखिक के रूप में नहीं है। इसका मतलब यह है कि अंशांकन घटता का निर्माण किया जाना है, और है कि कभी कभार यह दो अलग भार पर नमूनों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हो सकता है ताकि अंशांकन पर्वतमाला के भीतर दोनों छोटे और बड़े लिपिड वर्ग चोटियों रखने के लिए ।

एफआईडी स्कैनर में आंशिक स्कैन सुविधा का उपयोग करके, लिपिड की कई कक्षाओं को एक ही नमूना आवेदन से रॉड में अलग करना संभव है। हालांकि, सिलीसिक एसिड पर क्रोमेटोग्राफी मोम एस्टर (हम) और स्टीरल एस्टर (एसई) को हल करने में विफल रहता है, और कुछ वर्गों को "एसीटोन-मोबाइल ध्रुवीय लिपिड" (AMPL) पीक17में शामिल किया जा सकता है। हम-एसई बोनफिश oocytes में प्रमुख लिपिड वर्ग था और यह सुझाव दिया है कि वे उछाल और/या ऊर्जा भंडारण18का समर्थन करने के लिए उपयोग किया जाता है ।

फोटोसिंथेटिक जीवों से एएमपीएल में, ग्लाइकोलिसोरोलिपिड अक्सर एसीटोन में मोनोसिलाइक्रोल और पिगमेंट के साथ एक साथ घुलते हैं। यह क्लोरोफिल ए और ग्लाइकोक्लिपिड्स मोनोग्लैक्टोसिल डिसिलेग्लाइस्रोल (एमजीडीजी) और डिग्नाक्टोसाइल डायसिल्गलीसेरॉल (डीजीडीजी) के रूप में क्वांटिटेशन चिंता पेश कर सकता है, स्कैनर में विभिन्न FID प्रतिक्रियाएं हैं; हालांकि, हम उपयोग करते हैं, 1-मोनोपालमिटोइल ग्लिसरोल को एम्प्ल क्लास के लिए मानक के रूप में, और इसमें17के बीच एक प्रतिक्रिया मध्यवर्ती है।

जबकि कुछ FID स्कैनर चोटियों में एक से अधिक लिपिड वर्ग शामिल हो सकते हैं, यह कभी-कभी अलग लिपिड वर्गों को कार्यात्मक रूप से फिर से समूहीकृत करने के लिए उपयोगी होता है। उदाहरण के लिए, एएमपीएल और पीएल को ध्रुवीय लिपिड में और फिर स्टेरोल19के अलावा संरचनात्मक लिपिड में बांटा गया है। अकशेरुकी19में विकास के दौरान लिपिड उपयोग के लिए महत्वपूर्ण अवधियों का अध्ययन करने के लिए ऐसे समूहों का उपयोग किया जाता था । मुक्त फैटी एसिड और अल्कोहल से जुड़े अन्य समूहों का उपयोग लिकोलिसिस इंडेक्स(टेबल 2)या हाइड्रोलिसिस इंडेक्स 1 जैसे क्षरण संकेतकों के रूप में किया जासकताहै। ली सभी एसील लिपिड का लिपलिसिस इंडेक्स है जबकि एचआई नॉन-पोलर एसील लिपिड का हाइड्रोलिसिस इंडेक्स है । ली मान हमेशा किसी भी नमूने के लिए HI के लिए उन लोगों की तुलना में कम कर रहे हैं क्योंकि सभी acyl लिपिड शामिल हैं।

कभी-कभी चोटी का विभाजन पॉलीअनसैचुरेटेड प्रजातियों के उच्च स्तर की उपस्थिति के कारण समुद्री नमूनों के अर्क के रॉड अलगाव में होता है जो पहचान को मुश्किल बना सकता है। यह मोम एस्टर(चित्रा 3),ट्राइसिलग्लाइसरोल और मुफ्त फैटी एसिड20, 21केसाथदेखागया है, और प्रामाणिक मानकों और/या अन्य क्रोमेग्राफिक तकनीकों के साथ पुष्टि के साथ सह-खोलना आवश्यक है । इसी प्रकार , ध्रुवीय लिपिड क्षेत्र(चित्र 2 और चित्रा 3)में शिखर विभाजन हो सकता है और घटक ग्लाइकोलिपिड और पिगमेंट17,22 और फॉस्फोलिपिड वर्ग22,23को अलग करने के लिए आगे की घटनाओं को अंजाम दिया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं ।

Acknowledgments

इस शोध को प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद ऑफ कनाडा (एनएसईआरसी) अनुदान संख्या 105379 सी.C पैरिश द्वारा वित्त पोषित किया गया था । मेमोरियल यूनिवर्सिटी के कोर रिसर्च इक्विपमेंट एंड इंस्ट्रूमेंट ट्रेनिंग (सीआरईआईटी) नेटवर्क ने इस प्रकाशन को फंड करने में मदद की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml vials VWR 66009-560
1-hexadecanol Sigma 258741-1G
1-Monopalmitoyl-rac-glycerol Sigma M1640-1g
2 ml vials VWR 46610-722
25 mm glass fibre filters Fisher 09 874 32A
2ml pipet bulbs VWR 82024-554
47 mm glass fibre filters Fisher 09 874 32
5 3/4" pipets Fisher 1367820A
9" pipets Fisher 1367820C
Acetone VWR CAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890 Agilent
Calcium Chloride ANHS 500gm VWR CACX0160-1
Caps for 2 ml vials VWR 46610-712
chloroform VWR CACX1054-1
Cholesteryl palmitate Sigma C6072-1G
Chromarod S5 Shell USA 3252
Dichloromethane VWR CADX0831-1
DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl Sigma P5911-1g
Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L VWR CAEX0190-4
Glyceryl tripalmitate Sigma T5888-100MG
Hamilton Syringe 702SNR 25µl Sigma 58381
Helium Air Liquide A0492781
Hexane VWR CAHX0296-1
Hydrogen regulator VWR 55850-484
Iatroscan MK6 Shell USA
Kimwipes Fisher 066662
Medical Air Air Liquide A0464563
Medium nitrile gloves Fisher 191301597C
Nitrile gloves L VWR CA82013-782
Nitrogen Air Liquide A0464775
Nitrogen Regulator VWR 55850-474
Nonadecane Sigma 74158-1G
Palmitic acid Sigma P0500-10G
Repeating dispenser Sigma 20943
Sodium Bicarbonate 1kg VWR CA97062-460
Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr VWR CA71008-804
Sulfuric acid VWR CASX1244-5
Teflon tape Fisher 14610120
tissue master 125 115V w/7mm homogenator OMNI International TM125-115
TLC development tank Shell USA 3201
UHP hydrogen Air Liquide A0492788
VWR solvent repippetter VWR 82017-766
VWR timer Flashing LED 2 channel VWR 89140-196
Zebron ZB-Wax GC column Phenomenex 7HM-G013-11

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 178
समुद्री नमूनों में कुल लिपिड और लिपिड कक्षाओं का निर्धारण
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Parrish, C. C., Wells, J. S.… More

Parrish, C. C., Wells, J. S. Determination of Total Lipid and Lipid Classes in Marine Samples. J. Vis. Exp. (178), e62315, doi:10.3791/62315 (2021).

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