Summary
Questo protocollo è per la determinazione dei lipidi in acqua di mare e campioni biologici. I lipidi nei filtrati vengono estratti con cloroformio o miscele di cloroformio e metanolo nel caso di solidi. Le classi lipidiche sono misurate mediante cromatografia a strato sottile con rilevamento della ionizzazione a fiamma e la loro somma fornisce il contenuto lipidico totale.
Abstract
I lipidi sono in gran parte composti da carbonio e idrogeno e, quindi, forniscono una maggiore energia specifica rispetto ad altre macromolecole organiche nel mare. Essendo ricchi di carbonio e idrogeno sono anche idrofobici e possono agire come solvente e vettore di assorbimento per contaminanti organici e quindi possono essere driver di bioaccumulo inquinante negli ecosistemi marini. La loro natura idrofobica facilita il loro isolamento dall'acqua di mare o da campioni biologici: l'analisi lipidica marina inizia con il campionamento e poi l'estrazione in solventi organici non polari, fornendo un metodo conveniente per la loro separazione da altre sostanze in una matrice acquatica.
Se l'acqua di mare è stata campionata, il primo passo di solito comporta la separazione in fazioni "disciolte" e "particolato" definite operativamente mediante filtrazione. I campioni vengono raccolti e i lipidi isolati dalla matrice del campione tipicamente con cloroformio per materia veramente disciolta e colloidi, e con miscele di cloroformio e metanolo per solidi e campioni biologici. Tali estratti possono contenere diverse classi da fonti biogeniche e antropogeniche. In questo momento, i lipidi totali e le classi lipidiche possono essere determinati. Il lipide totale può essere misurato sommando le classi lipidiche determinate individualmente che di solito sono state separate cromatograficamente. La cromatografia a strato sottile (TLC) con rilevamento della ionizzazione di fiamma (FID) viene regolarmente utilizzata per l'analisi quantitativa dei lipidi da campioni marini. TLC-FID fornisce informazioni sulla classe lipidica sinottica e, sommando le classi, una misurazione lipidica totale.
Le informazioni sulla classe lipidica sono particolarmente utili se combinate con misurazioni di singoli componenti, ad esempio acidi grassi e / o steroli, dopo il loro rilascio da estratti lipidici. L'ampia varietà di strutture e funzioni lipidiche significa che sono ampiamente utilizzate nella ricerca ecologica e biogeochimica che valuta la salute dell'ecosistema e il grado di influenza degli impatti antropogenici. Sono stati impiegati per misurare sostanze di valore dietetico per la fauna marina (ad esempio, acquafeed e / o prede) e come indicatore della qualità dell'acqua (ad esempio, idrocarburi).
Introduction
I metodi qui descritti riguardano sostanze che sono definite operativamente come lipidi marini. Questa definizione si basa sulla loro suscettibilità all'estrazione liquido-liquido in solventi organici non polari e fornisce un metodo conveniente per la loro separazione da altre sostanze in una matrice acquatica. La loro natura idrofoba facilita il loro isolamento dall'acqua di mare o dai campioni biologici, così come il loro arricchimento e la rimozione di sali e proteine.
La misurazione del contenuto lipidico e della sua composizione negli organismi marini è stata di grande interesse per l'ecologia della rete alimentare, la nutrizione dell'acquacoltura e la scienza dell'alimentazione per decenni. I lipidi sono componenti universali negli organismi viventi, che agiscono come molecole essenziali nelle membrane cellulari, come principali fonti di energia biodisponibile, fornendo isolamento termico e galleggiabilità e fungendo da molecole di segnalazione. Sebbene le procedure per la determinazione dei lipidi in altri campi siano state descritte bene, il loro uso con campioni marini richiede comunemente modifiche per adattarsi alle condizioni del campo e al tipo di campione1.
Per i campioni di acqua di mare, la prima fase di solito richiede la separazione nelle frazioni "disciolte" e "particolato" definite operativamente, normalmente mediante filtrazione (fase 1 del protocollo). La frazione di particolato è ciò che viene trattenuto dal filtro e la dimensione dei pori è importante nella definizione del cut-off2. Spesso, quando campioniamo il particolato, vorremmo mettere in relazione le concentrazioni lipidiche con le concentrazioni di massa totale, nel qual caso un campione separato, più piccolo, (ad esempio, 10 ml) deve essere preso per questo scopo (protocollo passo 1, nota). Per ottenere una determinazione accurata della massa è importante aggiungere il formate di ammonio (35 g/L) alla fine della filtrazione.
Il filtrato di acqua di mare dal campione più grande deve ammontare tra 250 ml e 1 L a seconda del tipo di campione ed è sottoposto all'estrazione liquido-liquido in un imbuto separatore (fase 2 del protocollo). La natura idrofobica dei lipidi significa che possono essere separati da altri composti mediante estrazione in un solvente non polare come il cloroformio. Viene creato un sistema a due strati in cui i lipidi si dividono nello strato organico mentre i componenti solubili in acqua rimangono nello strato acquoso.
Campioni di particolato su un filtro, o campioni biologici vengono estratti con un'estrazione modificata di Folch et al.3, che coinvolge anche il cloroformio (fase del protocollo 3). Ancora una volta, viene creato un sistema organico / acquoso in cui i lipidi si dividono nella fase organica, mentre le molecole solubili in acqua rimangono nella fase acquosa e le proteine vengono precipitate. Infatti, per i solidi, la maggior parte dei laboratori utilizza alcune variazioni della procedura di estrazione Folch et al.3 che coinvolge cloroformio e metanolo. Per i filtri, il primo passo è omogeneizzare in 2 ml di cloroformio e 1 ml di metanolo.
Durante l'estrazione, è necessario prestare attenzione per proteggere i lipidi da modifiche chimiche o enzimatiche, mantenendo campioni e solventi sul ghiaccio per ridurre l'idrolisi del legame estere o l'ossidazione a doppio legame carbonio-carbonio. I tessuti e i lipidi cellulari sono abbastanza ben protetti dagli antiossidanti naturali e dalla compartimentazione4; tuttavia, a seguito dell'omogeneizzazione dei campioni, il contenuto cellulare viene combinato rendendo i lipidi più disposti all'alterazione, chimicamente o enzimaticamente. Alcuni lipidi, come la maggior parte degli steroli, sono molto stabili, mentre altri, come quelli contenenti acidi grassi polinsaturi, sono più suscettibili all'ossidazione chimica. Altri, come gli steroli con doppi legami coniugati, sono inclini all'ossidazione catalizzato dalla luce5. Dopo le estrazioni, i lipidi sono molto più suscettibili all'ossidazione chimica e i campioni devono essere conservati sotto un gas inerte come l'azoto. Un flusso delicato di azoto verrebbe anche usato per concentrare gli estratti.
Dopo la concentrazione, i lipidi sarebbero normalmente quantificati alla rinfusa in quanto sono una componente importante degli ecosistemi marini che forniscono un'alta concentrazione di energia, più del doppio del kJ / g di carboidrati e proteine. Invariabilmente verrebbero poi quantificati come singoli componenti: l'analisi completa dei lipidi comporta generalmente la separazione in categorie più semplici, in base alla loro natura chimica. Pertanto, un'analisi completa comporta la misurazione dei lipidi totali, delle classi lipidiche e dei singoli composti.
Il lipide totale può essere determinato prendendo la somma delle classi lipidiche misurate individualmente separate dalla cromatografia6. Un estratto lipidico marino può contenere più di una dozzina di classi da fonti biogeniche e antropogeniche. L'ampia varietà di strutture lipidiche significa che molte informazioni possono essere ottenute determinando singoli raggruppamenti di strutture. Le classi lipidiche individualmente, o in alcuni gruppi, sono state utilizzate per segnalare la presenza di alcuni tipi di organismi, nonché il loro stato fisiologico e l'attività2. Sono stati anche utilizzati come indicatore delle origini del materiale organico, compresa la materia organica disciolta (DOM) e i contaminanti idrofobici.
Triacilgliceroli, fosfolipidi e steroli sono tra le più importanti classi lipidiche biogeniche. I primi due sono biochimicamente correlati in quanto possiedono una spina dorsale di glicerolo a cui sono esterificati due o tre acidi grassi (Figura 1). I triacilgliceroli, insieme agli esteri di cera, sono sostanze di stoccaggio molto importanti, mentre altre classi lipidiche contenenti acidi grassi come diacilgliceroli, acidi grassi liberi e monoacilgliceroli sono generalmente costituenti minori. Gli acidi grassi liberi sono presenti a concentrazioni più basse negli organismi viventi, in quanto quelli insaturi possono essere tossici7. Anche gli steroli (sia nelle loro forme libere che esterificate) e gli alcoli grassi sono inclusi tra i lipidi meno polari, mentre i glicolipidi e i fosfolipidi sono lipidi polari. I lipidi polari hanno un gruppo idrofilo, che consente la formazione di doppi strati lipidici presenti nelle membrane cellulari. Gli steroli liberi sono anche componenti strutturali della membrana e, se assunti in rapporto ai triacilgliceroli, forniscono una condizione o un indice nutrizionale (TAG: ST) che è stato ampiamente utilizzato8. Se presi in rapporto ai fosfolipidi (ST: PL) possono essere utilizzati per indicare la sensibilità delle piante al sale: valori più alti mantengono l'integrità strutturale e diminuiscono la permeabilità della membrana9. L'inverso di questo rapporto (PL: ST) è stato studiato nei tessuti bivalvi durante l'adattamento della temperatura10.
Le classi lipidiche marine possono essere separate mediante cromatografia a strato sottile (TLC) su barre rivestite in gel di silice (fase 4 del protocollo) e quindi rilevate e quantificate mediante rilevamento della ionizzazione di fiamma (FID) in uno scanner FID automatico. TLC / FID è diventato abitualmente utilizzato per i campioni marini in quanto fornisce rapidamente dati di classe lipidica sinottica da piccoli campioni e, prendendo la somma di tutte le classi, un valore per i lipidi totali. TLC/FID è stato sottoposto a una valutazione di garanzia della qualità (QA) ed è risultato che soddisfa gli standard richiesti per una calibrazione esterna coerente, spazi vuoti bassi e analisi di replica precisa11. I coefficienti di variazione (CV) o le deviazioni standard relative sono intorno al 10% e i dati lipidici totali dello scanner FID sono normalmente circa il 90% di quelli ottenuti con metodi gravimetrici e altri metodi2. La gravimetria dà lipidi totali più elevati probabilmente perché lo scanner FID misura solo composti non volatili e anche come risultato della possibile inclusione di materiale non lipidico nelle misurazioni gravimetriche.
Le informazioni fornite dall'analisi della classe lipidica sono particolarmente utili se combinate con le determinazioni degli acidi grassi come individui, o steroli, o i due in combinazione. Il primo passo verso queste analisi prevede il rilascio di tutti gli acidi grassi componenti insieme agli steroli negli estratti lipidici (fase 5 del protocollo). L'ampia varietà di strutture e funzioni lipidiche significa che hanno visto un ampio uso in studi ecologici e biogeochimici che valutano la salute dell'ecosistema e la misura in cui sono stati influenzati da input antropogenici e terrestri. Sono stati utilizzati per misurare la biosintesi di sostanze di valore dietetico per la fauna marina e per indicare la qualità dei campioni di acqua. La misurazione dei lipidi nei campioni di carote di sedimenti aiuta a mostrare la sensibilità dei sedimenti ai cambiamenti nell'uso del suolo umano vicino al margine terra-mare.
Lo strumento principale per identificare e quantificare i singoli composti lipidici è stato tradizionalmente la gascromatografia (GC) con FID. Prima dell'analisi, tuttavia, questi composti sono resi più volatili dalla derivatizzazione. Gli acidi grassi vengono rilasciati in presenza di un catalizzatore acido (H2SO4) dalle classi lipidiche acilice (Figura 1). In chimica organica, il gruppo acilico (R-C = O) è solitamente derivato da un acido carbossilico (R-COOH). Vengono quindi riesterificati in esteri metilici degli acidi grassi (FAME) che danno migliori separazioni sulle colonne GC (fase del protocollo 5).
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Protocol
NOTA: Per pulire bicchieri, strumenti e filtri per analisi lipidiche, lavarli 3 volte con metanolo seguito da 3 lavaggi con cloroformio o riscaldarli a 450°C per almeno 8 ore.
1. Procedura di filtrazione per i lipidi disciolti e particolati dell'acqua di mare
NOTA: La particolare frazione di interesse è definita operativamente dalla procedura di filtrazione. In questo caso la dimensione dei pori è di 1,2 μm.
- Impostare il collettore di filtrazione senza filtro e risciacquare la configurazione con acqua di mare filtrata.
- Utilizzando una pinca pulita, inserire un filtro in fibra di vetro (GF/C) da 47 mm, che è stato lavato, nel sistema di filtrazione pulito.
- Prendi il campione e ruota delicatamente per risospendare qualsiasi materiale che potrebbe essersi depositato sul fondo del contenitore di raccolta. Misurare con precisione un volume noto, in questo caso 1 L, e filtrarlo attraverso il filtro.
NOTA: il volume dipenderà dalla quantità di particolato nel campione: di solito tra 250 ml e 5 L a seconda della stagione e della posizione. - Quando il campione è stato misurato, bagnare delicatamente il filtro con acqua di mare filtrata. Aggiungere lentamente l'intero campione al sistema di filtrazione e risciacquare il cilindro graduato con acqua di mare filtrata per assicurarsi che tutte le particelle vengano aggiunte al filtro. Risciacquare la configurazione con acqua di mare filtrata sui lati per assicurarsi che tutte le particelle vengano risciacquate sul filtro.
- Lasciare che tutta l'acqua di mare passi attraverso il filtro ma non lasciare asciugare completamente il filtro in quanto può interrompere le celle sul filtro; rompere l'aspirazione quando l'ultima dell'acqua scompare.
- Usando una pinna pulita e una pipetta pulita, piegare il filtro a metà, poi in terzi e poi a metà longitudinalmente per arrotolare il filtro in un tubo. Metterlo in un flaconcino di vetro pulito ed etichettato da 10 ml.
- Coprire il filtro con 2 ml di cloroformio. Riempire lo spazio della testa con azoto e sigillare con nastro in PTFE. Mettere in una griglia in un congelatore a -20 °C. I campioni saranno stabili a questa temperatura fino a un anno.
NOTA: per correlare le concentrazioni lipidiche alle concentrazioni di massa totale, è necessaria anche una misurazione del peso secco. Ciò comporta l'inserimento di un filtro pre-pesato da 24 mm in una configurazione di filtrazione a peso secco, mescolando il campione e prendendo un piccolo sottocampione che viene filtrato sul piccolo filtro. Quando il filtro è quasi asciutto, circa 10 ml di formate di ammonio al 3,5% vengono aggiunti al filtro. Il filtro viene piegato a metà, restituito a una capsula di Petri etichettata e posto in un congelatore.
2. Estrazione liquido-liquida di acqua di mare o campioni liquidi
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Preparazione del campione
- Misurare un volume noto di filtrato in un cilindro graduato di vetro lipidico pulito. Posizionare questo campione in un imbuto separatore pulito da 1 L. Quindi aggiungere 20 ml di cloroformio al campione e agitare per 2 minuti, sfogando frequentemente.
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Rimozione del primo estratto e aggiunta di acido dopo la prima separazione
- Avvolgere l'imbuto in un foglio di alluminio e attendere da 5 a 10 minuti per la separazione. Staccare il fondo della lamina per vedere i due strati. Raccogliere lo strato organico inferiore attraverso il rubinetto in un pallone rotondo pulito, facendo attenzione a non includere nessuno degli strati superiori. Tappare il matraccio a fondo tondo sotto azoto e metterlo nel congelatore.
- Aggiungere 0,25 ml di H2SO4 concentrato per ogni litro di campione, al campione nell'imbuto separatore e agitare delicatamente l'imbuto.
- Aggiungere 10 ml di cloroformio e agitare vigorosamente per 2 minuti mentre si sfiata frequentemente. Lascia che la separazione avvenga.
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Seconda e terza separazione
- Attendere la separazione e aggiungere lo strato inferiore nel pallone a fondo tondo.
- Aggiungere un terzo 10 ml di cloroformio e agitare per 2 minuti, di nuovo sfogando frequentemente. Dopo la separazione, aggiungere lo strato inferiore al pallone a fondo tondo.
- Trasferire l'estratto nel matraccio a fondo tondo in un evaporatore rotante, evaporare e trasferirlo in un flaconcino da 2 ml.
3. Protocollo di estrazione per solidi (estrazione folch et al.3 modificata)
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Apparecchio
NOTA: la configurazione di estrazione richiede un contenitore isolato pieno di ghiaccio. I solventi includono metanolo, acqua estratta dal cloroformio e cloroformio 2:1:metanolo. Tutti i solventi devono essere posti sul ghiaccio in modo che siano freddi al momento dell'inizio delle estrazioni. I campioni vanno anche sul ghiaccio, in modo che tutto rimanga freddo.- Risciacquare tutti i tubi e i tappi rivestiti in PTFE 3 volte con metanolo e poi 3 volte con cloroformio. Per ogni estrazione sono necessari un tubo centrifuga e un flaconcino da 15 ml con tappo.
- Posizionare il campione in una provetta di centrifuga contenente 2 ml di cloroformio. La dimensione del campione dipende dalla quantità di lipidi presenti, circa 5-10 mg di lipidi preferiti.
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Rettifica ed estrazione
- Aggiungere circa 1 mL di metanolo ghiacciato e macinare rapidamente il campione in una polpa con un omogeneizzatore pulito o un'asta in PTFE/metallo.
- Lavare di nuovo l'asta nel tubo con circa 1 mL di cloroformio 2:1 ghiacciato: metanolo e poi con 1/2 ml di acqua estratta dal cloroformio ghiacciato. Se necessario, utilizzare un set pulito di pinne di forza per forzare le particelle nel flaconcino prima del lavaggio. Tappare il tubo e sonicare la miscela per 4 minuti in un bagno ad ultrasuoni (35 - 42 kHz).
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Doppio pipettaggio: Centrifugare il campione per 2 minuti a 1800 × g. Raccogliere l'intero strato organico (strato inferiore) utilizzando la tecnica del doppio pipettaggio in cui una pipetta da 5 3/4 "con il bulbo liberamente acceso viene delicatamente spinta attraverso i due strati, mentre si spreme il bulbo, causando l'uscita di bolle.
- Quando viene raggiunto il fondo del secondo strato, utilizzare il pollice per rimuovere la lampadina senza disegnare lo strato organico nella pipetta. Posizionare una pipetta da 9" all'interno di quella da 5 3/4" e rimuovere lo strato inferiore attraverso la pipetta da 5 3/4".
- Mettere l'estratto in un flaconcino pulito. Continua a togliere lo strato inferiore fino a quando non viene rimosso tutto.
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Pipette di lavaggio: Risciacquare la pipetta da 9" nel flaconcino contenente lo strato organico utilizzando 1,5 mL di cloroformio ghiacciato per lavare l'esterno della pipetta e 1,5 ml per lavare l'interno. Ruotare delicatamente la pipetta durante il lavaggio e assicurarsi che tutto il cloroformio scega lungo la pipetta in flaconcino.
- Risciacquare la pipetta da 5 3/4" nel tubo contenente lo strato acquoso nello stesso modo.
- Sonicare e centrifugare i campioni e doppia pipetta quando separati, utilizzando ogni volta nuove pipette. Ripeti almeno tre volte e raggruppati tutti gli strati organici. Dopo aver rimosso lo strato organico per la terza volta, lavare entrambe le pipette nel flaconcino contenente lo strato organico.
- Utilizzando un delicato flusso di azoto, concentrare fino al volume, quindi sigillare con nastro in PTFE e conservare in un congelatore.
4. Sviluppo di sistemi e passaggi per la separazione TLC delle barre delle classi lipidiche marine
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Preparazione delle aste per TLC
- Scansione a vuoto delle aste nello scanner FID automatico tre volte
- Individuazione di un campione: Applicare campioni e standard con una siringa alle aste in posizione pari o appena al di sotto dell'origine. Erogare 0,5 μL e toccare la goccia sull'asta. Lasciare asciugare prima di posizionare la goccia successiva nello stesso punto. Individua tutti i campioni in una linea su aste.
- Messa a fuoco in acetone: Mettere a fuoco i campioni due volte (tre volte se i campioni sono molto concentrati) in 70 ml di acetone. Guarda il fronte del solvente mentre si arrampica sull'asta fino a quando il fondo del punto si fonde con la parte superiore. Rimuovere le aste, asciugarle per circa 5 s, quindi ripetere la procedura per produrre una stretta fascia di materiale lipidico vicino al fondo dell'asta.
- Asciugare e condizionare le aste in una camera di umidità costante per 5 minuti. Una camera di umidità costante è un essiccatore con una soluzione satura di cloruro di calcio sotto la piastra.
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Sequenza che porta al primo cromatogramma (da idrocarburi a chetoni)
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Primo sistema di sviluppo: Il primo sistema di sviluppo è l'acido esano:etere etilico:formico, 98.95:1:0.05. Utilizzare una siringa per aggiungere l'acido formico, ma prima risciacquare la siringa 3× con acido formico. Risciacquare l'acido formico dalla siringa subito dopo con cloroformio. Utilizzare 30 ml della miscela per bagnare la carta e risciacquare il serbatoio. Scartare la soluzione di risciacquo e aggiungere i restanti 70 ml al serbatoio.
- Prendi i rack e abbassali delicatamente nel serbatoio. Guardare fino a quando il fronte del solvente raggiunge i punti del campione, quindi avviare il timer. Dopo 25 minuti, rimuovere le aste dalla camera di sviluppo, asciugare nella camera di umidità costante per 5 minuti e riqualificare nella stessa soluzione per altri 20 minuti.
- Asciugare le aste per 5 minuti nello scanner FID automatico e quindi eseguire la scansione fino al punto più basso dietro il picco chetonico utilizzando una scansione PPS di 25.
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Primo sistema di sviluppo: Il primo sistema di sviluppo è l'acido esano:etere etilico:formico, 98.95:1:0.05. Utilizzare una siringa per aggiungere l'acido formico, ma prima risciacquare la siringa 3× con acido formico. Risciacquare l'acido formico dalla siringa subito dopo con cloroformio. Utilizzare 30 ml della miscela per bagnare la carta e risciacquare il serbatoio. Scartare la soluzione di risciacquo e aggiungere i restanti 70 ml al serbatoio.
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Sequenza che porta al secondo cromatogramma (da triacilglicerolo a diacilglicerolo):
- Condizionare le aste per 5 minuti nella camera di umidità costante.
- Secondo sistema di sviluppo: Il secondo sistema di sviluppo è l'acido esano:etere etilico:formico, 79:20:1. Aggiungere ~ 30 ml al serbatoio di sviluppo per bagnare la carta e risciacquare il serbatoio. Quindi scartare e sviluppare le aste per 40 minuti nei restanti 70 ml. Per la migliore separazione tra i picchi TAG (saturi) e TAG (polinsaturi) utilizzare una miscela di 79.9:20:0.1, ma per la separazione dei picchi ST e DAG utilizzare una miscela di 79:20:1.
- Asciugare e scansionare fino al punto più basso dietro il picco di diacilglicerolo in una seconda scansione parziale utilizzando una scansione PPS 11.
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Sequenza che porta al terzo cromatogramma (lipide polare acetone-mobile e fosfolipide)
- Condizionare le aste per 5 minuti nella camera di umidità costante.
- Sviluppare le aste due volte per 15 minuti in 70 ml di acetone. Tra uno sviluppo e l'altro asciugare all'aria le aste per circa 30 secondi.
- Condizionare le aste per 5 minuti nella camera di umidità costante.
- Terzo sistema di sviluppo: Il terzo sistema di sviluppo è una miscela di cloroformio, metanolo e acqua estratta dal cloroformio, 50:40:10. Sviluppare le aste due volte per 10 minuti in 70 ml della miscela. Tra uno sviluppo e l'altro, asciugare all'aria le aste per circa 30 secondi.
- Asciugare e scansionare l'intera lunghezza delle aste.
5. Derivatizzazione FAME con H2SO4 in MeOH
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Produzione del reagente Hilditch
- Preparazione del metanolo: Mettere 100 ml di MeOH in un matraccio volumetrico pulito e quindi cospargere delicatamente di NaSO4 anidro fino a coprire il fondo del matraccio. Una volta coperto, invertire due volte in modo che l'acqua nel metanolo venga assorbita dal NaSO4. Dopo aver invertito e agitato, lasciare riposare per almeno 5 minuti.
- Aggiunta dell'acido: Decantare lentamente il metanolo in un barattolo di vetro (ormai il NaSO4 è un nodulo duro sul fondo del pallone) e viene aggiunto l'H2SO4. Aggiungere lentamente 1,5 ml di acido solforico al metanolo usando una pipetta. Aggiungere qualche goccia alla volta e una volta aggiunto tutto l'acido, tappare e mescolare delicatamente per mescolare. La soluzione è ora pronta per essere utilizzata per i derivati, ma deve essere costituita su base settimanale.
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Fare i derivati
- Trasferire circa 200 μg di lipidi da una fiala di estratto che ha portato il volume a una quantità nota, in un flaconcino pulito da 15 ml ed evaporare sotto azoto a secco. La quantità rimossa sarà determinata dalla concentrazione del campione da TLC/FID. Utilizzare una pipetta pulita per rimuovere il campione.
- Quando il campione si è asciugato, aggiungere 1,5 mL di diclorometano e 3 mL del reagente Hilditch appena prodotto.
- Vortice del campione e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni per 4 minuti per rimuovere i lipidi che hanno aderito alla fiala di vetro. Riempire il flaconcino con azoto, tappo e sigillarlo con nastro in PTFE e riscaldare a 100°C per 1 ora.
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Fermare la reazione
- Lasciare raffreddare completamente i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti dopo la rimozione dal forno, quindi aprire accuratamente i flaconcini.
- Aggiungere lentamente circa 0,5 mL di soluzione satura di bicarbonato di sodio (9 g/100 mL di acqua estratta dal cloroformio), quindi 1,5 mL di esano. Agitare o vorticosamente la fiala, quindi lasciare riposare in modo che si separi in 2 strati.
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Collezionare i FAME
- Rimozione dello strato superiore: Una volta che la derivatizzazione è stata interrotta e vi è una chiara separazione, rimuovere la fase organica superiore e porre in un flaconcino lipidico pulito da 2 ml.
- Evaporare il solvente nel flaconcino da 2 mL a secco e riempirlo con esano a circa 0,5 mL.
- Riempire lo spazio della testa della fiala con azoto, tappare e sigillare la fiala con nastro in PTFE, sonicare per altri 4 minuti per sospendere di ripiendere gli acidi grassi, quindi è pronto per andare al GC.
NOTA: Se sono necessarie concentrazioni di acidi grassi, lo strato acquoso deve essere lavato tre volte con esano e tutti gli strati organici raggruppati nel flaconcino da 2 ml. Ciò comporta l'aggiunta di 2 ml di esano, la vorticosità del campione, la centrifugazione e la rimozione dello strato organico, il tutto ripetuto 3 volte.
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Representative Results
Essendo il settore della produzione alimentare in più rapida crescita, l'acquacoltura si sta evolvendo in termini di innovazioni tecnologiche e adattamenti per soddisfare le mutevoli esigenze. Uno di questi è ridurre la dipendenza dalla farina di pesce e dall'olio di pesce di origine selvatica, che forniscono ingredienti per mangimi per molte specie di acquacoltura. Gli oli vegetali terrestri sono stati studiati come sostituti sostenibili ed economici dell'olio di pesce negli aquafeed e il fegato è un tessuto bersaglio per l'analisi perché è il sito primario per il metabolismo lipidico12. La Figura 2 mostra i cromatogrammi TLC-FID grezzi ottenuti dal nostro standard a nove componenti, una dieta che abbiamo formulato con olio di pesce al 7% e olio di colza al 5% e tessuto epatico da un salmone atlantico alimentato con quella dieta. La Tabella 1 mostra i dati ottenuti dopo l'analisi delle repliche dietetiche e dei campioni di diversi pesci. Questi dati sono stati ottenuti dopo aver costruito curve standard dalle risposte FID dello scanner per quantificare le classi lipidiche negli estratti utilizzando il software Peak Simple (versione 4.54). I dati mostrano la prevalenza dei triacilgliceroli nelle diete e nel fegato e anche l'importanza dei fosfolipidi di membrana nel fegato.
I margini continentali presentano generalmente una produttività biologica molto elevata e sono particolarmente importanti nel ciclo del carbonio. La produttività primaria superficiale raggiunge il fondo marino in modo maggiore in acque meno profonde, e quindi è di grande interesse misurare la quantità e la qualità delle particelle che si depositano dallo strato misto superiore nella rete alimentare bentonica. Essendo ricchi di carbonio e avendo un contenuto energetico molto elevato, i lipidi sono componenti importanti della produttività delle piattaforme continentali. Storicamente, le acque adiacenti a Terranova e Labrador hanno sostenuto una delle più grandi attività di pesca del mondo per circa cinque secoli, e abbiamo studiato la produzione e il trasferimento di lipidi in questo sistema13. La Figura 3 mostra i cromatogrammi TLC-FID ottenuti dal nostro standard, i lipidi nel particolato di sedimentazione raccolti a 220 m al largo della costa di Terranova e i lipidi in un piccolo miside, Erythrops erythrophtalma raccolto vicino alla stessa profondità. Questa volta i cromatogrammi sono stati elaborati tramite software di plottaggio e le due scansioni parziali sono state combinate con la scansione completa finale. La tabella 2 mostra i dati ottenuti dopo l'analisi di campioni replicati di particolato sedimentante e il misid. Tra i 19 taxa da 5 phyla, il piccolo mysid aveva, in media, la più alta concentrazione lipidica (6% del pesoumido) 13.
Figura 1: Principali classi lipidiche in campioni marini in ordine approssimativo di polarità crescente. Ogni struttura è disegnata con la parte più idrofoba della molecola che punta verso destra della Figura. I composti rappresentativi per le classi lipidiche sono:- idrocarburi: non adacani; estere di cera: esadecile palmitato; estere sterilico: colesteril palmitato; estere metilico: palmitato di metile; chetone: 3-esadecanone; triacilglicerolo: tripalmitina; acido grasso libero: acido palmitico; alcool: fitolo; sterolo: colesterolo; diacilglicerolo: glicerolo dipalmitoile; monoacilglicerolo: glicerolo monopalmitoile; glicolipide: digalactosil diacilglicerolo; fosfolipide: dipalmitoil fosfatidilcolina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cromatogrammi TLC-FID della composizione lipidica da un esperimento di alimentazione in acquacoltura. Gli estratti sono stati individuati su barre TLC rivestite in gel di silice e un sistema di sviluppo a tre stadi è stato utilizzato per separare le classi lipidiche. Il primo e il secondo sistema di sviluppo erano rispettivamente l'esano:etere etilico:acido formico (98,95:1:0,05) e (79,9:20:0,1) al fine di separare i lipidi neutri tra cui il triacilglicerolo, l'acido grasso libero e lo sterolo per la scansione nello scanner FID automatico. Il terzo sistema di sviluppo consisteva nel 100% di acetone prima del cloroformio:metanolo:acqua (5:4:1) al fine di separare i lipidi polari acetone-mobili e i fosfolipidi. Le curve standard (cioè nonadecano, colesteril palmitato, 3-edecanone, tripalmitina, acido palmitico, alcool cetilico, colesterolo, monopalmitoil glicerolo, dipalmitoil fosfatidilcolina) sono state utilizzate per quantificare le classi lipidiche negli estratti utilizzando il software Peak Simple (versione 4.54). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Cromatogrammi TLC-FID della composizione lipidica di campioni vicino al fondo della costa di Terranova. a) standard a nove componenti, b) 220 m di sedimentazione del particolato da Conception Bay, Terranova, c) classi lipidiche nel misid, eritroftalma Erythrops. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Dieta a base di olio di pesce/ olio di colza | Fegato di salmone atlantico | |
| Idrocarburi | 1.3±0,9 | 0,5±0,2 |
| Esteri di sterile/Esteri di cera | 0.4±0.6 | 0,6±0,3 |
| Esteri etilici | 0 | 0 |
| Esteri metilici | 0 | 0 |
| Chetoni etilici | 0 | 0.3±0.2 |
| Metil chetoni | 0 | 0 |
| Gliceril Eteri | 0 | 0 |
| Triacilgliceroli | 145,0±26,3 | 16.9±8.1 |
| Acidi grassi liberi | 21.9±2.2 | 1.2±0.9 |
| Alcoli | 0 | 1.4±0.4 |
| Steroli | 6.8±2.1 | 2.6±0.2 |
| Diacilgliceroli | 0 | 0 |
| Acetone Mobile Polar Lipidi | 14.0±2.5 | 2.2±0.6 |
| Fosfolipidi | 12.5±4.0 | 22,0±2,0 |
| Lipidi totali | 201,8±27,4 | 47,7±11,8 |
Tabella 1: Composizione lipidica in un esperimento di alimentazione in acquacoltura. I dati sono (media±sezione standard) di una dieta sperimentale contenente il 6,80% di olio di pesce e il 4,80% di olio di colza, come alimentato (mg g-1 peso umido), e di fegati di salmone atlantico (mg g-1 peso umido) dopo aver alimentato questa dieta per 12 settimane.
| Decantazione del particolato | Eritroftalma | |
| Esteri di sterile/Esteri di cera (% lipidi totali) | 10.2±8.28 | 8.85±1.67 |
| Triacilgliceroli (% lipidi totali) | 19.7±5.35 | 58.5±9.19 |
| Fosfolipidi (% lipidi totali) | 16,2 ± 3,51 | 21.4±5.35 |
| Lipidi neutri (% lipidi totali) | 12.5±4.0 | 73.4±5.46 |
| Indice di lipolisi (%) | 18.1±5.20 | 2.77±2.78 |
| Lipidi totali | 0.57±0.25 | 5.86±1.44 |
| Lipidi neutri: idrocarburi, esteri di cera e steril, chetoni, triacilgliceroli, acidi grassi liberi; (FFA), alcoli (ALC), steroli, diacilgliceroli; LI: indice di lipolisi [(FFA + ALC) (lipidi acilici + ALC)–1]; Lipidi totali (somma delle classi lipidiche determinate TLC/FID) particolato - % peso secco, Mysid - % peso umido | ||
Tabella 2: Composizione lipidica di campioni vicino al fondo della costa di Terranova. I dati sono (media±scorrizione standard) di 220 m di sedimentazione del particolato da Conception Bay Terranova, e del misid, Erythrops erythrophtalma.
Nota a piè di pagina: Lipidi neutri: idrocarburi, cera ed esteri sterilici, chetoni, triacilgliceroli, acidi grassi liberi; (FFA), alcoli (ALC), steroli, diacilgliceroli; LI: indice di lipolisi [(FFA+ ALC) (lipidi acilici + ALC)-1]; Lipidi totali (somma delle classi lipidiche determinate dal FID) particolato - % peso secco, Mysid - % peso umido.
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Discussion
La velocità con cui il sistema TLC-FID fornisce informazioni sulla classe lipidica sinottica da piccoli campioni rende TLC-FID uno strumento in grado di selezionare campioni marini prima di intraprendere procedure analitiche più coinvolte. Tali analisi di solito richiedono il rilascio di composti componenti da estratti lipidici e la derivatizzazione per aumentare la volatilità nel caso della gascromatografia. TLC-FID combinato con GC-FID è stato trovato per essere una potente combinazione per estratti di frutti di mare e altri alimenti14. Per il successo delle analisi lipidiche marine è fondamentale che i campioni siano protetti contro la degradazione e la contaminazione in tutto e che si presta molta attenzione all'applicazione del campione all'asta. Un approccio consiste nell'applicare l'intero campione marino all'asta utilizzando un pipettor microcapillare15e un'innovazione nei tipi di campioni marini consiste nell'aggiungere microstrato di superficie marina e campioni di aerosol ai campioni di acqua di mare16.
Il sistema FID nello scanner automatico fornisce una rapida quantificazione dei microgrammi senza derivatizzazione o pulizia; tuttavia, non è così sensibile, preciso o lineare come si trova nei gascromatografi. Ciò significa che le curve di calibrazione devono essere costruite e che occasionalmente può essere necessario analizzare campioni a due carichi diversi per mantenere picchi di classe lipidica sia più piccoli che più grandi all'interno di intervalli di calibrazione.
Utilizzando la funzione di scansione parziale nello scanner FID, è possibile separare più classi di lipidi da una singola applicazione campione a un'asta. Tuttavia, la cromatografia sull'acido silicico non riesce a risolvere gli esteri di cera (WE) e gli esteri sterilici (SE), e alcune classi possono essere incluse nel picco "acetone-lipide polare mobile" (AMPL)17. WE-SE era la principale classe lipidica negli ovociti bonefish e si suggerisce che siano usati per supportare la galleggiabilità e / o l'accumulo di energia18.
Nell'AMPL da organismi fotosintetici, i glicocolicerolipidi spesso eluiscono insieme a monoacilgliceroli e pigmenti in acetone. Ciò può presentare un problema di quantificazione in quanto la clorofilla a e i glicolipidi monogalactosil diacilglicerolo (MGDG) e digalactosil diacilglicerolo (DGDG) hanno risposte FID diverse nello scanner; tuttavia, usiamo, 1-monopalmitoil glicerolo come standard per la classe AMPL, e questo ha una risposta intermedia tra loro17.
Mentre alcuni picchi di scanner FID possono contenere più di una classe lipidica, a volte è utile raggruppare funzionalmente classi lipidiche separate. Ad esempio, AMPL e PL sono stati raggruppati in lipidi polari e quindi in lipidi strutturali con l'aggiunta di sterolo19. Tali raggruppamenti sono stati utilizzati per studiare i periodi critici per l'uso dei lipidi durante lo sviluppo negli invertebrati19. Altri raggruppamenti che coinvolgono acidi grassi liberi e alcoli possono essere utilizzati come indicatori di degradazione come l'indice di lipolisi (Tabella 2) o l'indice di idrolisi1. LI è l'indice di lipolisi di tutti i lipidi acilici mentre HI è l'indice di idrolisi dei lipidi acilici non polari. I valori di LI sono sempre inferiori a quelli di HI per qualsiasi campione perché sono inclusi tutti i lipidi acilici.
Occasionalmente la scissione dei picchi si verifica nelle separazioni delle barre di estratti di campioni marini a causa della presenza di alti livelli di specie polinsature che possono rendere difficile l'identificazione. Questo è stato osservato con esteri di cera (Figura 3), triacilgliceroli e acidi grassi liberi20,21, e richiede la co-individuazione con standard autentici e / o la conferma con altre tecniche cromatografiche. Allo stesso modo, la scissione del picco può verificarsi nella regione lipidica polare (Figura 2 e Figura 3), e ulteriori sviluppi possono essere intrapresi per separare i glicolipidi componenti e i pigmenti17,22 e le classi di fosfolipidi22,23.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) numero di sovvenzioni 105379 a C.C. Parrish. La rete Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) della Memorial University ha contribuito a finanziare questa pubblicazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
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