Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.
Abstract
אי ספיקת כבד היא אחד הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם, והתמותה ממחלת כבד כרונית עולה בחדות בארצות הברית. כבדים בריאים מסוגלים להתחדש מנזק רעיל, אך במחלת כבד מתקדמת, היכולת הטבעית של הכבד להתחדש נפגעת. דגי זברה התגלו כמערכת ניסיונית רבת עוצמה לחקר ההתחדשות. הם מודל אידיאלי לחקר התחדשות הכבד מהפטקטומיה החלקית, הליך עם רלוונטיות קלינית ישירה שבה חלק מהכבד מוסר בניתוח, ומשאיר את השאר ללא פגע. אין פרוטוקול סטנדרטי לכריתת הפטי חלקית; מחקרים קודמים המשתמשים במודל זה השתמשו בפרוטוקולים שונים במקצת ודיווחו על תוצאות שונות. מתואר כאן פרוטוקול יעיל, לשחזור לביצוע כריתת hepatectomy חלקית בדגי זברה בוגרים. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להדגים כי דגי זברה מסוגלים להתחדשות אפימורפית של האונה הנתבת. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור עוד יותר את המנגנונים הנדרשים להתחדשות הכבד בדגי זברה.
Introduction
בין האיברים המוצקים בבני אדם, הכבד הוא האיבר היחיד המסוגל התחדשות1. זה קריטי, כמו הכבד הוא איבר חיוני, אחראי על פונקציות מטבוליות מפתח, אחסון אנרגיה, ניקוי רעלים בדם, הפרשת חלבוני פלזמה, וייצור מרה2. Hepatocytes שאבדו עקב נזק רעיל או דלקתי מוחלפים בעיקר באמצעות חלוקה של הפטוציטים הנותרים1. מודל ניסיוני קלאסי אחד לחקר התחדשות הכבד הוא כריתת כבד חלקית, שבה אונות בודדות של הכבד מוסרות, ומשאירות את האונות הנותרות שלמות3. הליך זה פותח בתחילה בחולדות, שבהן כשני שלישים ממסת הכבד מוסרים. לאחר כריתת הפטקטומיה חלקית ביונקים, התחדשות מפצה מתרחשת באונות הנותרות עד שהכבד משחזר את המסה הראשונית שלו. ראוי לציין כי כבד היונקים אינו מחליף את האונות החסרות.
דג זברה(דניו ריו)מייצג מודל מתיחה לחקר התחדשות איברים למבוגרים4. כבד דג הזברה, בעודו שונה מבנית מהכבד היונקים, מורכב מאותם סוגי תאים ומשרת את אותה פונקציה כמו ביונקים2. הוא מורכב משלוש אונות, עם שתי אונות הגב ואונה גחונית אחת המשטחות לאורך המעי. כריתת הפטקטומיה חלקית בוצעה בעבר בדגי זברה, עם תיאורים סותרים לגבי מצב ההתחדשות המדויק. בדרך כלל, שליש כריתת hepatectomy חלקית מבוצעת על ידי הסרת האונה הגחוני כולו. דיווחים ראשוניים הצביעו על כך שלאחר הסרת האונה הגחונית, הוא התחדש במלואו בתוך שבוע5,6,7, מה שמצביע על כך שבניגוד לכבד היונקים, כבד דג הזברה מסוגל להתחדשות אפימורפית. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי הסרת האונה הגחונית הביאה להתחדשות מפצה באונות החזיר, ולא להתחדשות האונה הגחונית החסרה, ובסופו של דבר להתאוששות של מסת הכבד בתוך שבוע8,9. פרופיל תמלול של האונות הגעשיות בעקבות כריתה של האונה הגחונית חשף שינויים משמעותיים הקשוריםהתחדשות מפצה 10. בהתחשב בכך שמצב התחדשות הכבד יכול להשתנות עם היקף הפציעה8, שיערנו כי הפערים בתוצאות עשויים להיות עקב שונות טכנית בפרוטוקול כריתת ההפטיקטומיה החלקית בין קבוצות מחקר.
פרוטוקול זה מתאר הליך לביצוע כריתת הפטיקטומיה חלקית שליש על דגי זברה בוגרים על ידי הסרת האונה הגחונית. טכניקה זו תהיה בעלת ערך להערכת מנגנונים של התחדשות הכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגי זברה גדלו וגדלו על פי הנהלים הרגילים. הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים בריגהם ונשים (2016N000405). דגי זברה בוגרים צמו במשך 24 שעות לפני תחילת הפרוטוקול. מי מערכת מתייחסים למים במיכלי דיור דגי זברה במתקן הימי.
1. הכנה ומרדים
- הכן 0.016% פתרון Tricaine במי מערכת.
זהירות: טריקאין הוא מגרה אם הוא בא במגע עם העיניים, העור או דרכי הנשימה. - הכן ספוג להחזיק דג זברה מרדים במהלך פרוטוקול הניתוח. חותכים ספוג מלא לרבעים. באמצעות סכין גילוח, להסיר טריז דק של ספוג שפועל במקביל לציר הארוך של רובע הספוג.
- החריץ צריך להיות ארוך מספיק כדי להכיל דג בוגר (זה ישתנה בין גדלים שונים של דגים). לדוגמה, עבור דג מבוגר 35 מ"מ אורך, אורך החריץ צריך להיות 20 מ"מ. הראש והגוף מוחזקים בספוג, אבל הזנב עובר את קצה הספוג(איור 1B).
- השרו את הספוג בתמיסת טריקאין 0.016%.
- יש למקם דגי זברה בוגרים (זכר או נקבה) ב-625 מ"ל של פתרון טריקאין 0.016%.
- דגירה במשך 6 דקות או עד שהדגים לא מגיבים למגע.
- בעזרת מלקחיים, הסירו בזהירות את הדגים ממיכל ה-Tricaine והניחו את צד גחון הדגים למעלה בחריץ הספוג (איור 1A - B).
- מניחים את הספוג מתחת למיקרוסקופ ניתוח עם תאורה מלמעלה למטה.
2. ניתוח
- בעזרת מלקחיים עדינים, צבוטו את העור וקשקשו בממצע, רק אחוריים ללב(איור 1B).
- באמצעות מספריים קפיץ טעון, לעשות לחתוך מתחת למלקחיים כדי ליצור חור בחלל הגוף(איור 1C - D). יש להקפיד לא לפגוע בלב או בכלי דם גדול, שכן הדבר יגרום לתמותה מוגברת.
- באמצעות מספריים קפיץ טעון, לבצע 3-4 מ"מ הפחתת לאורך הבטן, עיבוד אחורי עד ההסתעפות מגיע סנפירי האגן(איור 1D - E). בשלב זה, האונה הגחונה של הכבד עשויה להיות גלויה דרך ההסתה.
- לסחוט את הצדדים של הספוג ביד אחת כדי לכפות את האיברים הקרביים מתוך חלל הגוף. האונה הגחונה של הכבד תהיה גלויה על גבי המעי(איורים 1F,2A-B). הכבד יופיע כמבנה ורוד או כתום הפרוס על פני המעי החום-זהוב. בעלי חיים המוגדרים כבקרה מזויפת נמצאים בשלב זה.
- סוחטים את המלקחיים העדינות כך ששני הפחיות נוגעות ללב. תוך שמירה על לחץ על הספוג, החלק את הפחיות של המלקחיים העדינות בין הכבד למעי(איור 1G). יש להקפיד לא לנקב את המעי, שכן זה יגרום לתמותה מוגברת.
- לאט לאט הלחץ על המלקחיים, כך שהקישוטים מתרחקים זה מזה(איור 1H). פעולת הזזה זו מנתקת את ההחזקות הרבות של וריד הפורטל בין האונה הגחונית למעי (איור 2B), ויש צורך להסיר את האונה הגחונית. חזור על תהליך זה עד שכל קשרי הפורטל בין הכבד למעי נותקו.
- לקלף את האונה הגחונית מהמעי באמצעות מלקחיים עדינים לחתוך את האונה הגחונית חופשי משאר הכבד(איור 1I).
- הליך זה גורם לכריתת הפטיקטומיה חלקית שליש (איור 1J).
3. התאוששות
- בזהירות להסיר את הדג מן הספוג ומניחים אותו במיכל של מים מערכת.
- מערכת פיפטה מים מעל הזימים במשך כמה דקות עד שהדגים שוחים בכוחות עצמם(איור 1K).
- יש לנטר דגים במשך 2-4 שעות לפני שתחזיר אותם למערכת. אין להאכיל את הדגים במשך 24 שעות מלאות לאחר הניתוח.
- נטר דגים מדי יום למשך הניסוי.
- עם הזמן, ההסתה בקיר הגוף תחלים באופן טבעי ללא צורך בתפרים(איור 1L,2C).
4. ניתוח אורך האונה הגחונית למעי
- המתת חסד כל בעלי החיים המיועדים לניתוח במי קרח במשך 10 דקות עד שכל התנועות האופרקולריות ייפסקו.
- מוציאים את הדג ממי קרח ומניחים אותו בצד הגחון למעלה בחריץ של ספוג.
- באמצעות מספריים קפיץ טעון, לעשות חותך בקיר הגוף הגחון בעמדה הקדמית-אחורית של הלב. לאחר מכן בצעו עוד שני חותכים לאורך הציר הקדמי-אחורי מהחתיכה הראשונה כל הדרך לסנפירי האגן. (איור 2A).
- לקלף את העור ואת השריר כדי לחשוף את איברי הקרביים (איור 2A).
- לרכוש תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטי של איברי הקרביים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. שדה ראייה זה יכלול את האזור שבו נפלטה האונה הגחונית. מכיוון שבעלי חיים מורדמים לפני הניתוח, ניתוח מסוג זה מונע הדמיה ארוכת טווח של אותם דגים.
5. ניתוח יחס משקל כבד לגוף
- המתת חסד כל בעלי החיים המיועדים לניתוח במי קרח במשך 10 דקות עד שכל התנועות האופרקולריות ייפסקו.
- מניחים דגים בצינור חרוט 50 מ"ל.
- הוסף 25 מ"ל של 4% paraformaldehyde ב 1x PBS ו 0.3% Tween לצינור.
זהירות: פורמלדהיד רעיל, ופתרונות המכילים פורמלדהיד תמיד צריכים להיות מעובדים במכסה כימי. - אגוזים ל-48 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
- בצע ארבע כביסות של 10 דקות ב- PBS 1x ו- 0.3% Tween.
- יש לאחזר דגים עם מלקחיים, ולהכתים יבש על מגבת נייר.
- תקליט את המשקל של כל הדג.
- באמצעות מספריים קפיץ טעון, לעשות חותך בקיר הגוף הגחון בעמדה הקדמית-אחורית של הלב. לאחר מכן, לעשות עוד שני חותכים לרוץ לאורך הציר הקדמי-אחורי מן החותך הראשון כל הדרך לסנפירי האגן. (איור 2A).
- לקלף את העור ואת השריר כדי לחשוף את איברי הקרביים (איור 2A).
- לרכוש תמונות שדה בהיר של הכבד באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות.
- לנתח את הכבד, מניח את חתיכות הכבד על סירת שקילה.
- להקליט את המשקל של הכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על מנת לבחון את הפוטנציאל המתחדש של כבד דג הזברה הבוגר, ביצענו כריתת הפטקטומיה חלקית (PHX) בדגי זברה בוגרים. באופן כללי, נבחרו מבוגרים גדולים (30-40 מ"מ אורך) הנעים בין 1.5-2.5 שנים. במסגרת ניסויים בודדים, בעלי חיים נבחרו מאותו טנק, והיו מותאמים לגילם ולגודלם. כבקרה מתאימה, השתמשנו בניתוחים מזויפים שבהם החיה הייתה גם מרדים וקיבלה חתירה גדולה בקיר הגוף הגחון אך התאוששה מבלי להסיר רקמה. שיעורי ההישרדות של פקדי זיוף נעו בין 90%-100% עבור דגי זברה זכרים ונקביים כאחד. שיעורי ההישרדות של בעלי חיים PHX נעו בין 60%-75% עבור דגי זברה זכרים ו 60%-90% עבור דגי זברה נקבה, עם כל מקרי המוות המתרחשים ב 24 השעות הראשונות לאחר הניתוח.
תקן הזהב לכימות ההתאוששות של הכבד בעקבות PHX הוא יחס משקל הכבד לגוף, או LBR. נעשה שימוש בבחן זה הן למדידת התאוששות מסת הכבד הן במודלים של יונקים11 והן במודלים של דגי זברה8. כדי לכמת באופן אמין את משקל הכבד, עשינו מדידות משקל על בעלי חיים קבועים, כפי שתואר בעבר8. ביצענו מדידות LBR על סוג בר, דג זברה ללא פגע, ומצאנו כי כפי שדווח בעבר8,דג זברה נקבה היה כמעט כפול LBR לעומת דגי זברה זכר (3.3% עבור דג זברה נקבה ו 1.8% עבור דג זברה זכר)(איור 3A). ביצענו גם זיוף וגם PHX על דגי זברה בוגרים משני המינים וניתחנו את ה- LBR ב 0 ו -7 ימים לאחר פציעה (dpi) (איור 3B). ב 0 dpi, בעלי חיים מזויפים היו אונה גחוני גלוי בבירור, ואילו בבעלי חיים PHX האונה הגחון נעדר לחלוטין(איור 3C). ראוי לציין כי הדבר הביא לירידה משמעותית ב-LBR (ירידה של 30% בדגים זכריים, ירידה של 20% בדגיהנקבה) (איור 3D). בקוהורטת הדגים שניתחו ב-7 dpi, גילינו שהאונה הגחונית לא התחדשה (איור 3E),ובכל זאת ה-LBR של פקדי PHX ותחמת מזויפים היה דומה(איור 3F). מדידות אלה מצביעות על כך ש- 7 dpi, הכבד חזר למסה ביחס לבקרות מזויפות, ככל הנראה על ידי התחדשות מפצה באונות החזיר, בהסכמה עם דיווחים קודמים8,9.
החלטנו לחקור אם, בהינתן מספיק זמן, האונה הגחונה של הכבד הייתה מסוגלת להתחדש. דגים בוגרים Tg (fabp10a:CFP-NTR) נבחרו לניסויים, כמו דגים אלה מבטאים CFP בהפטוציטים, המאפשר הדמיה של הכבד באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. קבוצה של בעלי חיים הייתה כפופה לפרוטוקול כריתת הפטיקטומיה החלקית המלא של שליש. בעלי חיים נותחו ב 1 או 36 dpi(איור 4A). עבור כל חיה נמדד היחס בין אורך האונה הגחוני למעי (איור 4B).
לבעלי חיים שעברו ניתוחים מזויפים הייתה אונה גחונית בולטת שכבשה 50%-100% מאורך המעי, בעוד שבעלי חיים שעברו כריתת הפטיקטומיה חלקית שליש סבלו מאונה גחונית מופחתת מאוד. באופן מפתיע, בעלי חיים רבים כריתת החלקית ב 36 dpi היה יחס אונה גחוני למעי מוגבר לעומת בעלי חיים כריתת החלקית ב 1 dpi(איור 4C). לא הייתה עלייה בגודל האונה הגחונה בבקרות מזויפות; עם זאת, עלייה משמעותית סטטיסטית בגודל האונה הגחונית נצפתה לאחר התאוששות מהפטיקטומיה חלקית (איור 4D). ציינו כי הייתה שונות רחבה בתגובה לניתוח, כאשר חלק מבעלי החיים לא הציגו התחדשות, ואחרים חידשו בבירור אונה גחונית מוגדרת היטב(איור 4E). תוצאות אלה מראות כי האונה הגחונית מסוגלת להתחדש מחיתת כבד כירורגית בדגי זברה בוגרים. יחד, עבודתנו מצביעה על כך שכבד דגי הזברה מסוגל הן להתחדשות אפימורפית והן להתחדשות מפצה.
איור 1: פרוטוקול כריתת ההפטקטומיה החלקית. (א)תרשים של דג זברה בוגר, עם הצירים הקדמיים-אחוריים וגחון-גחון- גחון. (B)לאחר יראת חסד, בעל חיים מוטבע בספוג (מוצג בכחול) כך שהוא צד גחוני למעלה. מלקחיים עדינים משמשים לצבוט את העור רק אחורי ללב. הספוג אינו מוצג בלוחות הבאים לבהירות. (ג)מספריים משמשים כדי לשבור את העור רק אחורי ללב. (D-E) המספריים משמשים בפצע הפתוח כעת כדי לבצע חותך 3-4 מ"מ פועל מהק הקדמי לארב, מסתיים ממש לפני סנפירי האגן. (ו)סחיטת צידי הספוג גורמת לאיברים הקרביים לקפוץ מתוך הפצע הגדול יותר. (ז)מלקחיים עדינים עם שני הגינונים הנוגעים ללב גולשים בין האונה הגחונית של הכבד והמעי. המלקחייםרגועים וגורמים להם לשבור את הקשרים בין הכבד למעי. תהליך זה חוזר על עצמו לאורך האונה הגחונית. (I-J) האונה הגחונית נמשכת מהקצה האחורי שלה, בעוד המספריים משמשים לניתוק האונה הגחונית משאר הכבד. (K)החיה ממוקמת בתא התאוששות עם מי מערכת, שם היא חוזרת להכרה ולזכויות עצמה. עםהזמן, הקרביים נמשכים בחזרה לחלל הגוף והפצע מחלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אנטומיה של דגי זברה והתאוששות מהפטיקטומיה חלקית. (א)לניתוח איברי הקרביים, בעלי חיים מורדמים ומונחים בצד הגחוני על ספוג. ראשית, חותך מתבצע בעמדה הקדמית-אחורית של הלב (קו אדום). לאחר מכן, נוצרים שני חותכים הנעים לאורך הציר הקדמי-אחורי לסנפירי האגן (קו כחול). לאחר מכן, העור והשרירים קלופים בחזרה, חושפים את האיברים הקרביים. מתויגים המעי, האונה הגחונית של הכבד, והוריד המרכזי באונה. (ב)תמונה חיה של מבט גחוני של דג זברה מוכן לניתוח של איברי הקרביים. האונה הגחונה של הכבד מסומנת בקו לבן מנוקד. תיבה צהובה בתמונה 2x מציינת את המיקום של תמונת 8x. ראשי חץ לבנים מצביעים על קשרים ורידים פורטל בין המעי לכבד. (C)מבט גחוני על הפצע שנוצר על ידי הליך כריתת ההפטיקטומיה החלקית בנקודות הזמן המצוינות. עם הזמן, ההסתה מחלימה לחלוטין. מוטות קנה מידה, 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התחדשות מפצה לאחר כריתת הפטקטומיה חלקית. (A)נמדדו יחסי כבד למשקל גוף (LBR) עבור סוג בר, דגי זברה שלא נפגעו. נקבות דגי הזברה כמעט כפולות מה-LBR בהשוואה לדגי זברה זכרים. נקבות בעלי חיים הושוו לחיות זכריות באמצעות בדיקת סכום דרגת וילקוסון, ****p < 0.0001. (ב)סכמטי המציין כי דגי זברה מסוג בר שימשו לניסוי זה. בעלי חיים היו נתונים לכפוף או כריתת הפטיקטומיה חלקית (PHX), ולאחר מכן תוקנו ב 0 או 7 ימים לאחר פציעה (dpi). בעלי חיים קבועים צולמו ונחשפו למדידות LBR. (C,E) מוצגות תמונות מייצגות של בעלי חיים נתונים לשאפת או PHX ב- 0 dpi (C) ו- 7 dpi (E). שימו לב להיעדר המוחלט של האונות הגחון בחיות PHX. עבור כל התמונות, מוצג הוא מבט גחון של איברי הקרביים. התמונות הן תמונות של שדות בהירים. האונה הגחונה של הכבד מסומנת בלבן. מוטות קנה מידה, 500 מיקרומטר. (D,F) גרפים של הכבד למשקל הגוף עבור דגי זברה זכריים ונקביים לאחר ניתוחי זיוף ו- PHX ב 0 dpi (D) ו 7 dpi (F). הגובה של הסרגל הוא הערך הממוצע, ופסי השגיאה מייצגים את SEM. בעוד שיש ירידה ב- LBR לאחר כריתת hepatectomy חלקית ב- 0 dpi, אין הבדל משמעותי בין PHX וחיות מזויפות ב- 7 dpi, המציין שחזור של LBR. דגימות כריתת הפטיקטומיה חלקיות הושוו לבקרות מזויפות באמצעות בדיקת סכום דרגת וילקוסון, ns = לא משמעותי, *p < 0.05, **p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דגי זברה יכולים לחדש את ההונות הגחון שלהם לאחר כריתת הפטיקטומיה חלקית. (A)סכמטי המציין כי Tg (fabp10a:CFP-NTR) שימשו לניסוי זה. ניתוח וניתוח על ידי הדמיה בוצעו בנקודות הזמן שצוינו. (ב)תמונה לדוגמה המדגימה כיצד נותחו בעלי חיים. בעלי חיים היו מכומתים על ידי מדידת אורך האונה הגחונית (באדום), אורך המעי (בצהוב), וחישוב אחוז המעי כי האונה הגחונית תופסת (בלבן). (C)מוצגת תמונה מייצגת של בעלי חיים נתונים ל כריתת hepatectomy מזויפת או חלקית (PHX) ב 1 ו 36 ימים לאחר פציעה (dpi). (D)חלקות כינור של היחס בין אורך האונה הגחונית לאורך המעי לבעלי חיים הכפופים לכריתת hepatectomy מזויף או חלקית ב 1 ו 36 dpi. כל נקודה מייצגת את הערך מדג בודד. הערכים לדגים זכרים הם בכחול, דג נקבה באדום. דגימות כריתת הפטיקטומיה חלקית הושוו לבקרות מזויפות באמצעות בדיקת סכום דרגת וילקוסון, ns = לא משמעותי, *p < 0.05. (ה)מוצגות שתי דוגמאות של בעלי חיים כריתת הפטי חלקית ב 36 dpi שלא התחדש, ושתי דוגמאות כי להתחדש. עבור כל התמונות, מוצג הוא מבט גחון של איברי הקרביים. תמונות הן מיזוג של תמונת פלואורסצנטיות של CFP ותמונה בעלת שדה בהיר. פלואורסצנטיות CFP קיימת רק בכבד. האונה הגחונה של הכבד מסומנת באדום. אחוז המעי שהאונה הגחונית תופסת הוא בלבן. מוטות קנה מידה, 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההבדלים האנטומיים בין דגי זברה למודלים של יונקים להתחדשות הכבד מציבים אתגרים ייחודיים לפירוק הכבד. הכבד בדגי זברה נמצא בסמיכות ללב והמעי; פגיעה בשוגג בכל איבר גורמת לתמותה מוגברת. כבד דג הזברה אינו עטוף, מה שמקשה על הנפרדות מהמעי. הכבד מקבל דם עשיר בחומרים מזינים מהמעי דרך ורידים פורטל. ביונקים, ורידים עוזבים את המעי מתכנסים על וריד פורטל ראשוני כי לאחר מכן מתפצל כפי שהוא נכנס לכבד12. לעומת זאת, כבד דג הזברה מקבל את זרימת הדם של הפורטל מסדרה של כלי שיט זעירים שעוברים ישירות מהמעי אל הכבד(איור 2B). לכן, כל אונה של הכבד, שטוח מעל המעי, מחובר בבטחה למעי על ידי כלי אלה. ניסיון להסיר את האונה הגחונית מבלי לנתק תחילה את ורידי הפורטל יכול לעתים קרובות לגרום כריתה חלקית (נתונים לא מוצגים). חלק מהפרוטוקולים הראשוניים מתארים משיכת האונה הגחונית החוצה דרך חתך קטן יחסית, שאינו מאפשר לנתק את קבצים מצורפים אלה בפורטל5,6.
הפרוטוקול המתואר כאן נועד להתמודד עם אתגרים אלה כדי לאפשר הסרת אונה גחון עקבית. דגי זברה מרדים ממוקמים בחוזקה בחריץ הספוג כדי לשמור על זימים רטובים וגופם משותק למשך ההליך. צביטת העור רק אחורית ללב מאפשרת למקם נתק בעור מבלי לפגוע באף אחד מהאיברים הפנימיים. פתיחת חתיכה גדולה (3-4 מ"מ) הופכת את הסרת הכבד להערכת מידת ההסרה פשוטה (איור 2C). חשוב לציין, דגי זברה יכולים להתאושש ובסופו של דבר לרפא פצע בגודל זה ללא כל סגירת פצע ראשונית. על ידי סחיטה של הספוג ודחיסת דופן הגוף, האיברים הקרביים הופכים לנגישים יותר וניתן להחליק את הפחיות של מלקחיים בין הכבד למעי. לאחר מכן ניתן להשתמש במלקחיים כדי לנתק את קשרי הפורטל בין הכבד למעי. לאחר זה הושג, מלקחיים עדינים ניתן להשתמש כדי לקלף בחזרה את האונה הגחון, כך שניתן להפריד אותו משאר הכבד.
מדדנו את יחס משקל הכבד לגוף (LBR) של בעלי חיים שעברו ניתוחי זיוף ו- PHX. מצאנו כי על ידי 7 dpi, LBR של בעלי חיים PHX היה דומה פקדים(איור 3F). בהתחשב בכך שהאונה הגחונית לא התחדשה בשלב זה (איור 3E),הגענו להסיק כי ההתחדשות התרחשה באמצעות פיצוי באונות החזיר. כדי לענות על השאלה אם האונה הגחונית יכולה בסופו של דבר להתחדש בדגי זברה, ביצענו PHX ובדקנו צמיחה מחדש של הכבד. בממוצע, היחס בין אורך האונה הגחונה למעי היה גבוה יותר ב-36 dpi מאשר ב-1 dpi, מה שמצביע על התחדשות האונה הגחונה (איור 4C-D). יש שונות רחבה בתגובה של בעלי החיים לפציעות, כאשר חלק מבעלי החיים חווים מעט מאוד צמיחה ואחרים חווים התאוששות משמעותית של האונה הגחונית(איור 4E). אנו מסיקים כי הכבד יכול להתחדש עם תערובת של התחדשות אפימורפית של האונה הגחונית והתחדשות מפצה באונות הגב, אם כי בלוחות זמנים שונים. כמו מחקרים קודמים השתמשו hepatectomies חלקית כדי assay לתפקיד שלגניםבודדים 5,7,9 ומסלולי איתות6,8,10 לאחר כריתה, אנו צופים כי פרוטוקול זה יקדם את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים והסלולריים של התחדשות הכבד בעל חוליות מבוגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
I.M.O. נתמך על ידי NIAAA (F32AA027135). W.G. נתמך על ידי R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870, ואת תוכנית קלאודיה אדמס בר למצוינות בחקר הסרטן. וו.ג'י הוא חוקר מכון פיו במדעי הביו-רפואה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K.
- Grisham, J. W.
