Summary
Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.
Abstract
Leverfalen is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd, en de sterfte aan chronische leverziekte neemt sterk toe in de Verenigde Staten. Gezonde levers zijn in staat om te regenereren van toxische schade, maar bij gevorderde leverziekte is het natuurlijke vermogen van de lever om te regenereren aangetast. Zebravissen zijn ontstaan als een krachtig experimenteel systeem voor het bestuderen van regeneratie. Ze zijn een ideaal model voor het bestuderen van leverregeneratie van gedeeltelijke hepatectomie, een procedure met directe klinische relevantie waarbij een deel van de lever chirurgisch wordt verwijderd, waardoor de rest intact blijft. Er is geen standaardprotocol voor gedeeltelijke hepatectomie; eerdere studies met dit model hebben iets verschillende protocollen gebruikt en ongelijksoortige resultaten gerapporteerd. Hier beschreven is een efficiënt, reproduceerbaar protocol voor het uitvoeren van een gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen. We gebruiken deze techniek om aan te tonen dat zebravissen in staat zijn tot epimorfe regeneratie van de gereseceerde kwab. Dit protocol kan worden gebruikt om de mechanismen die nodig zijn voor leverregeneratie bij zebravissen verder te ondervragen.
Introduction
Onder de vaste organen bij mensen is de lever het enige orgaan dat in staat is tot regeneratie1. Dit is van cruciaal belang, omdat de lever een essentieel orgaan is, verantwoordelijk voor belangrijke metabolische functies, energieopslag, bloedontgifting, afscheiding van plasma-eiwitten en galproductie2. Hepatocyten die verloren gaan als gevolg van toxische of inflammatoire schade worden voornamelijk vervangen door deling van de resterende hepatocyten1. Een klassiek experimenteel model voor het bestuderen van leverregeneratie is gedeeltelijke hepatectomie, waarbij individuele kwabben van de lever worden verwijderd, waardoor de resterende kwabben intact blijven3. Deze procedure werd aanvankelijk ontwikkeld bij ratten, waarbij ongeveer tweederde van de levermassa wordt verwijderd. Na gedeeltelijke hepatectomie bij zoogdieren vindt compenserende regeneratie plaats in de resterende kwabben totdat de lever zijn oorspronkelijke massa herstelt. Met name de zoogdierlever vervangt de ontbrekende kwabben niet.
Zebravis (Danio rerio) vertegenwoordigt een tracteerbaar model voor het bestuderen van volwassen orgaanregeneratie4. De zebravislever, hoewel structureel verschillend van de zoogdierlever, bestaat uit dezelfde celtypen en vervult dezelfde functie als bij zoogdieren2. Het bestaat uit drie lobben, met twee dorsale lobben en een enkele ventrale kwab die langs de darm zijn afgeplat. Gedeeltelijke hepatectomie is eerder uitgevoerd bij zebravissen, met tegenstrijdige rekeningen over de precieze wijze van regeneratie. Meestal wordt een derde gedeeltelijke hepatectomie uitgevoerd door verwijdering van de hele ventrale kwab. Eerste rapporten gaven aan dat na verwijdering van de ventrale kwab, het volledig werd geregenereerd binnen een week5,6,7, wat suggereert dat in tegenstelling tot de zoogdierlever, de zebravislever in staat is tot epimorfe regeneratie. Latere studies toonden aan dat verwijdering van de ventrale kwab resulteerde in compenserende regeneratie in de dorsale kwabben, in plaats van de regeneratie van de ontbrekende ventrale kwab, en uiteindelijk het herstel van levermassa binnen een week8,9. Transcriptomische profilering van de dorsale kwabben na resectie van de ventrale kwab bracht significante veranderingen aan het licht die verband houden met compenserende regeneratie10. Gezien het feit dat de wijze van leverregeneratie kan variëren met de omvang van de verwonding8, speculeerden we dat de verschillen in resultaten te wijten kunnen zijn aan technische variatie in het partiële hepatectomieprotocol tussen onderzoeksgroepen.
Dit protocol beschrijft een procedure voor het uitvoeren van een derde gedeeltelijke hepatectomie op volwassen zebravissen door het verwijderen van de ventrale kwab. Deze techniek zal waardevol zijn voor het beoordelen van mechanismen van leverregeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebravissen werden gefokt volgens standaardprocedures. Experimenten werden goedgekeurd door het Brigham and Women's Hospital's Institutional Animal Care and Use Committee (2016N000405). Volwassen zebravissen werden 24 uur gevast voor het begin van het protocol. Systeemwater verwijst naar het water in zebravishuistanks in de aquatische faciliteit.
1. Voorbereiding en anesthesie
- Bereid 0,016% Tricaine-oplossing in systeemwater.
LET OP: Tricaine is irriterend als het in contact komt met de ogen, huid of luchtwegen. - Bereid een spons voor om verdoofde zebravissen vast te houden tijdens het dissectieprotocol. Snijd een volle spons in vieren. Verwijder met een scheermesje een dun sponswigje dat parallel loopt aan de lange as van het sponskwart.
- De spleet moet lang genoeg zijn voor een volwassen vis (dit zal variëren tussen verschillende groottes van vissen). Voor een volwassen vis met een lengte van 35 mm moet de lengte van de spleet bijvoorbeeld 20 mm zijn. Het hoofd en het lichaam worden goed vastgehouden in de spons, maar de staart loopt langs de rand van de spons (Figuur 1B).
- Week de spons in 0,016% Tricaine-oplossing.
- Plaats volwassen zebravissen (mannelijk of vrouwelijk) in 625 ml 0,016% Tricaine-oplossing.
- Incubeer gedurende 6 minuten of totdat de vis niet reageert om aan te raken.
- Verwijder met een tang de vis voorzichtig uit de Tricainetank en plaats de visventerale kant omhoog in de groef van de spons (afbeelding 1A - B).
- Plaats de spons onder een ontleedmicroscoop met top-down verlichting.
2. Chirurgie
- Knijp met behulp van een fijne tang de huid en schubben mediair, net achter het hart (figuur 1B).
- Maak met een veerbelaste schaar een snede onder de tang om een gat in de lichaamsholte te maken (figuur 1C - D). Zorg ervoor dat u het hart of een groot bloedvat niet verwondt, omdat dit zal leiden tot verhoogde mortaliteit.
- Maak met behulp van een veerbelaste schaar een incisie van 3-4 mm langs de buik, die posterieure verwerking tot de incisie bij de bekkenvinnen aankomt (Figuur 1D - E). Op dit punt kan de ventrale kwab van de lever zichtbaar zijn door de incisie.
- Knijp met één hand in de zijkanten van de spons om de viscerale organen uit de lichaamsholte te dwingen. De ventrale kwab van de lever zal zichtbaar zijn op de top van de darm (Figuren 1F,2A-B). De lever zal verschijnen als een roze of oranje structuur verspreid over de goudbruine darm. Dieren die zijn aangewezen als schijncontroles worden op dit punt teruggevonden.
- Knijp in de fijne tang zodat de twee tanden elkaar raken. Terwijl u druk op de spons houdt, schuift u de tanden van de fijne tang tussen de lever en de darm (figuur 1G). Zorg ervoor dat u de darm niet doorboort, omdat dit zal leiden tot verhoogde mortaliteit.
- Ontspan langzaam de druk op de tang, zodat de tanden van elkaar af bewegen (figuur 1H). Deze glijdende werking doorbreekt de talrijke poortaderaanhechtingen tussen de ventrale kwab en de darm (figuur 2B), en is noodzakelijk om de ventrale kwab netjes te verwijderen. Herhaal dit proces totdat alle portalverbindingen tussen de lever en darm zijn verbroken.
- Pel de ventrale kwab terug uit de darm met behulp van een fijne tang en snijd de ventrale kwab vrij van de rest van de lever (figuur 1I).
- Deze procedure resulteert in een derde gedeeltelijke hepatectomie (figuur 1J).
3. Herstel
- Verwijder de vis voorzichtig uit de spons en plaats deze in een tank met systeemwater.
- Pipetsysteem water over de kieuwen gedurende een paar minuten totdat de vis op zichzelf zwemt (Figuur 1K).
- Houd de vis 2-4 uur in de gaten voordat u ze weer op het systeem plaatst. Voer de vis na de operatie niet gedurende 24 uur.
- Controleer vis dagelijks gedurende de duur van het experiment.
- Na verloop van tijd zal de incisie in de lichaamswand op natuurlijke wijze genezen zonder dat hechtingen nodig zijn(figuur 1L,2C).
4. Ventrale kwab tot darmlengte analyse
- Euthanaseer alle dieren die bestemd zijn voor analyse in ijswater gedurende 10 minuten totdat alle operculaire bewegingen stoppen.
- Haal de vis uit het ijswater en plaats hem ventrale kant omhoog in de groef van een spons.
- Maak met behulp van een veerbelaste schaar een incisie in de ventrale lichaamswand in de voorste-achterste positie van het hart. Maak dan nog twee incisies die langs de voorste-achterste as lopen vanaf de eerste incisie helemaal tot aan de bekkenvinnen. (Figuur 2A).
- Pel de huid en spieren terug om de viscerale organen te onthullen (figuur 2A).
- Verkrijg heldere veld- en fluorescerende beelden van de viscerale organen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. Dit gezichtsveld omvat het gebied waar de ventrale kwab werd gereseceerd. Omdat dieren vóór de analyse worden geëuthanaseerd, sluit dit soort analyse langdurige beeldvorming van dezelfde vis uit.
5. Analyse van de verhouding tussen lever en lichaamsgewicht
- Euthanaseer alle dieren die bestemd zijn voor analyse in ijswater gedurende 10 minuten totdat alle operculaire bewegingen stoppen.
- Plaats vis in een conische buis van 50 ml.
- Voeg 25 ml 4% paraformaldehyde in 1x PBS en 0,3% Tween toe aan de buis.
LET OP: Formaldehyde is giftig en oplossingen die formaldehyde bevatten, moeten altijd in een chemische kap worden verwerkt. - Nutate gedurende 48 uur bij 4 °C.
- Voer vier wasbeurten van 10 minuten uit in 1x PBS en 0,3% Tween.
- Haal vis met tang en vlek droog op een papieren handdoek.
- Noteer het gewicht van de hele vis.
- Maak met behulp van een veerbelaste schaar een incisie in de ventrale lichaamswand in de voorste-achterste positie van het hart. Maak vervolgens nog twee incisies die langs de voorste-achterste as lopen vanaf de eerste incisie helemaal tot aan de bekkenvinnen. (Figuur 2A).
- Pel de huid en spieren terug om de viscerale organen te onthullen (figuur 2A).
- Verkrijg heldere veldbeelden van de lever met behulp van een epifluorescentiemicroscoop.
- Ontleed de lever en plaats de stukjes lever op een weegboot.
- Noteer het gewicht van de lever.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het regeneratieve potentieel van de volwassen zebravislever te onderzoeken, voerden we gedeeltelijke hepatectomie (PHX) uit bij volwassen zebravissen. Over het algemeen werden grote volwassenen (30-40 mm lang) geselecteerd, variërend van 1,5-2,5 jaar oud. Binnen individuele experimenten werden dieren uit dezelfde tank geselecteerd en waren ze qua leeftijd en grootte op elkaar afgestemd. Als een geschikte controle maakten we gebruik van schijnoperaties waarbij het dier zowel verdoofd was als een grote incisie kreeg in de ventrale lichaamswand, maar werd hersteld zonder weefsel te verwijderen. De overlevingspercentages voor schijncontroles varieerden van 90%-100% voor zowel mannelijke als vrouwelijke zebravissen. De overlevingspercentages voor PHX-dieren varieerden van 60%-75% voor mannelijke zebravissen en 60%-90% voor vrouwelijke zebravissen, waarbij alle sterfgevallen plaatsvonden in de eerste 24 uur na de operatie.
De gouden standaard voor het kwantificeren van het herstel van de lever na PHX is de verhouding tussen lever en lichaamsgewicht, of LBR. Deze test is gebruikt voor zowel de meting van levermassaherstel in zowel zoogdier11 als zebravismodellen8. Om het gewicht van de lever betrouwbaar te kwantificeren, hebben we gewichtsmetingen uitgevoerd op vaste dieren, zoals eerder beschreven8. We voerden LBR-metingen uit op wilde, ongewonde zebravissen en ontdekten dat, zoals eerder gemeld8, vrouwelijke zebravissen bijna het dubbele van de LBR hadden in vergelijking met mannelijke zebravissen (3,3% voor vrouwelijke zebravissen en 1,8% voor mannelijke zebravissen) (Figuur 3A). We voerden zowel schijn als PHX uit op volwassen zebravissen van beide geslachten en analyseerden de LBR op 0 en 7 dagen na letsel (dpi) (figuur 3B). Bij 0 dpi hadden schijndieren een duidelijk zichtbare ventrale kwab, terwijl bij PHX-dieren de ventrale kwab volledig afwezig was (figuur 3C). Dit resulteerde met name in een significante vermindering van de LBR (30% vermindering van mannelijke vissen, 20% vermindering van vrouwelijke vissen) (Figuur 3D). In het cohort van vissen geanalyseerd op 7 dpi, ontdekten we dat de ventrale kwab niet was geregenereerd (Figuur 3E), en toch waren de LBR van PHX- en schijncontroles vergelijkbaar (Figuur 3F). Deze metingen geven aan dat de lever met 7 dpi de massa heeft herwonnen ten opzichte van schijncontroles, vermoedelijk door compenserende regeneratie in de dorsale kwabben, in overeenstemming met eerdere rapporten8,9.
We besloten te onderzoeken of, na voldoende tijd, de ventrale kwab van de lever in staat was tot regeneratie. Volwassen Tg(fabp10a:CFP-NTR) vissen werden geselecteerd voor experimenten, omdat deze vissen GVB in hepatocyten uitdrukken, waardoor visualisatie van de lever mogelijk is met behulp van fluorescentiemicroscopie. Een cohort dieren werd onderworpen aan het volledige een derde gedeeltelijke hepatectomieprotocol. Dieren werden geanalyseerd bij 1 of 36 dpi (figuur 4A). Voor elk dier werd de verhouding tussen de lengte van de ventrale kwab en de darm gemeten (figuur 4B).
Dieren die aan schijnoperaties werden onderworpen, hadden een prominente ventrale kwab die 50%-100% van de darmlengte insloeg, terwijl dieren die aan een derde gedeeltelijke hepatectomie werden blootgesteld, een ernstig verminderde ventrale kwab hadden. Opvallend is dat veel gedeeltelijke hepatectomiedieren bij 36 dpi een verhoogde ventrale kwab-darmverhouding hadden in vergelijking met gedeeltelijke hepatectomiedieren bij 1 dpi (figuur 4C). Er was geen toename van de grootte van de ventrale kwab in schijncontroles; echter, een statistisch significante toename van de grootte van de ventrale kwab werd waargenomen na herstel van gedeeltelijke hepatectomie (Figuur 4D). We merkten op dat er een grote variatie was in de respons op de operatie, waarbij sommige dieren geen regeneratie vertoonden en andere duidelijk een goed gedefinieerde ventrale kwab regenereerden (figuur 4E). Deze resultaten tonen aan dat de ventrale kwab in staat is om te regenereren uit chirurgische leverresectie bij volwassen zebravissen. Alles bij elkaar genomen geeft ons werk aan dat de zebravislever in staat is tot zowel epimorfe als compenserende regeneratie.
Figuur 1: Het partiële hepatectomieprotocol. (A) Diagram van een volwassen zebravis, met de voorste-achterste en dorsaal-ventrale assen genoteerd. (B) Na anesthesie wordt een dier ingebed in een spons (blauw afgebeeld) zodat het ventrale kant naar boven is. Fijne tangen worden gebruikt om de huid net achter het hart te knijpen. De spons wordt niet voor de duidelijkheid in de volgende panelen weergegeven. (C) De schaar wordt gebruikt om de huid enkel posterior aan het hart te breken. (D-E) De schaar wordt gebruikt bij de nu open wond om een incisie van 3-4 mm te maken die van voor naar achter loopt en vlak voor de bekkenvinnen eindigt. (F) Het knijpen van de zijkanten van de spons zorgt ervoor dat de viscerale organen uit de grotere wond springen. (G) Fijne tangen met beide tanden aanraken worden geschoven tussen de ventrale kwab van de lever en de darm. (H) De tang is ontspannen, waardoor ze de poortaderaanhechtingen tussen de lever en de darm breken. Dit proces wordt herhaald over de lengte van de ventrale kwab. (I-J) De ventrale kwab wordt aan het achterste uiteinde omhoog getrokken, terwijl de schaar wordt gebruikt om de ventrale kwab van de rest van de lever te scheiden. (K) Het dier wordt in een herstelkamer met systeemwater geplaatst, waar het zelf weer bij bewustzijn en rechten komt. (L) Na verloop van tijd wordt de ingewanden teruggetrokken in de lichaamsholte en geneest de wond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Zebravisanatomie en herstel van gedeeltelijke hepatectomie. (A) Voor analyse van de viscerale organen worden dieren geëuthanaseerd en ventrale kant op een spons geplaatst. Eerst wordt een incisie uitgevoerd op de voorste-achterste positie van het hart (rode lijn). Vervolgens worden twee incisies gegenereerd die langs de voorste-achterste as naar de bekkenvinnen lopen (blauwe lijn). Vervolgens worden de huid en spieren terug geschild, waardoor de viscerale organen zichtbaar worden. Gelabeld zijn de darm, ventrale kwab van de lever en de centrale ader in die kwab. (B) Live beeld van een ventrale weergave van een zebravis voorbereid voor analyse van de viscerale organen. De ventrale kwab van de lever is omlijnd met een gestippelde witte lijn. Geel vak in de 2x afbeelding geeft de locatie van de 8x afbeelding aan. Witte pijlpunten duiden op poortaderverbindingen tussen de darm en de lever. (C) Ventrale weergave van de wond gegenereerd door de partiële hepatectomieprocedure op de aangegeven tijdstippen. Na verloop van tijd geneest de incisie volledig. Schaalbalken, 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Compenserende regeneratie na gedeeltelijke hepatectomie. (A) De verhouding tussen lever en lichaamsgewicht (LBR) werd gemeten voor wilde, niet-gewonde zebravissen. Vrouwelijke zebravissen hebben bijna het dubbele van de LBR in vergelijking met mannelijke zebravissen. Vrouwelijke dieren werden vergeleken met mannelijke dieren met behulp van een Wilcoxon rank sum test, ****p < 0,0001. (B) Schematisch dat aangeeft dat zebravissen van het wilde type voor dit experiment zijn gebruikt. Dieren werden onderworpen aan schijn of gedeeltelijke hepatectomie (PHX) en vervolgens vastgesteld op 0 of 7 dagen na letsel (dpi). Vaste dieren werden afgebeeld en onderworpen aan LBR-metingen. (C,E) Getoond zijn representatieve afbeeldingen van dieren die onderworpen zijn aan schijnvertoning of PHX bij 0 dpi (C) en 7 dpi (E). Let op de volledige afwezigheid van de ventrale kwabben bij PHX-dieren. Voor alle afbeeldingen wordt een ventrale weergave van de viscerale organen getoond. Afbeeldingen zijn heldere veldafbeeldingen. De ventrale kwab van de lever is wit omlijnd. Schaalbalken, 500 μm. (D,F) Staafgrafieken van de verhouding tussen lever en lichaamsgewicht voor zowel mannelijke als vrouwelijke zebravissen na schijn- en PHX-operaties bij 0 dpi (D) en 7 dpi (F). De hoogte van de balk is de gemiddelde waarde en de foutbalken vertegenwoordigen SEM. Terwijl er een vermindering van LBR is na gedeeltelijke hepatectomie bij 0 dpi, is er geen significant verschil tussen PHX en schijndieren bij 7 dpi, wat wijst op herstel van LBR. Partiële hepatectomiemonsters werden vergeleken met schijncontroles met behulp van een Wilcoxon rank sum test, ns = niet significant, *p < 0,05, **p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Zebravissen kunnen hun ventrale kwabben regenereren na gedeeltelijke hepatectomie. (A) Schematisch dat aangeeft dat Tg(fabp10a:CFP-NTR) voor dit experiment werd gebruikt. Chirurgie en analyse door beeldvorming werden uitgevoerd op de aangegeven tijdstippen. (B) Een voorbeeldafbeelding om aan te tonen hoe dieren werden geanalyseerd. Dieren werden gekwantificeerd door de lengte van de ventrale kwab (in rood), de lengte van de darm (in geel) te meten en het percentage van de darm te berekenen dat de ventrale kwab inneemt (in wit). (C) Getoond is een representatief beeld van dieren die na 1 en 36 dagen na het letsel (dpi) aan schijn of gedeeltelijke hepatectomie (PHX) zijn blootgesteld. (D) Vioolpercelen met een verhouding tussen de lengte van de ventrale kwab en de lengte van de darm voor dieren die bij 1 en 36 dpi aan schijn- of gedeeltelijke hepatectomie zijn blootgesteld. Elke stip vertegenwoordigt de waarde van een enkele vis. Waarden voor mannelijke vissen zijn in blauw, vrouwelijke vis in rood. Partiële hepatectomiemonsters werden vergeleken met schijncontroles met behulp van een Wilcoxon rank sum test, ns = niet significant, *p < 0,05. (E) Getoond zijn twee voorbeelden van gedeeltelijke hepatectomiedieren bij 36 dpi die niet regenereerden, en twee voorbeelden die wel regenereerden. Voor alle afbeeldingen wordt een ventrale weergave van de viscerale organen getoond. Afbeeldingen zijn een samenvoeging van een GVB-fluorescentieafbeelding en een helderveldafbeelding. CFP fluorescentie is alleen aanwezig in de lever. De ventrale kwab van de lever is rood omlijnd. Het percentage van de darm dat de ventrale kwab inneemt is in het wit. Schaalbalken, 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De anatomische verschillen tussen zebravissen en zoogdiermodellen voor leverregeneratie vormen unieke uitdagingen voor leverresectie. De lever bij zebravissen bevindt zich in de nabijheid van het hart en de darm; onbedoeld beschadigen van beide organen leidt tot verhoogde mortaliteit. De zebravislever is niet ingekapseld, waardoor het moeilijker is om van de darm te scheiden. De lever ontvangt voedingsrijk bloed uit de darm via poortaders. Bij zoogdieren komen aders die de darm verlaten samen op een primaire poortader die vervolgens splitst wanneer deze de lever binnenkomt12. De zebravislever daarentegen ontvangt portalecirculatie van een reeks kleine vaten die rechtstreeks van de darm naar de lever bewegen (figuur 2B). Zo wordt elke kwab van de lever, afgeplat over de darm, door deze vaten stevig aan de darm bevestigd. Een poging om de ventrale kwab te verwijderen zonder eerst de poortaders te doorsnijden, kan vaak leiden tot onvolledige resectie (gegevens worden niet weergegeven). Sommige van de oorspronkelijke protocollen beschrijven het uittrekken van de ventrale kwab door een relatief kleine incisie, waardoor deze portaalbevestigingen niet kunnen worden doorbroken5,6.
Het hier beschreven protocol is ontworpen om deze uitdagingen aan te pakken om consistente ventrale kwabverwijdering mogelijk te maken. Verdoofde zebravissen worden stevig in de groef van spons geplaatst om hun kieuwen nat te houden en hun lichaam onbeweeglijk voor de duur van de procedure. Het knijpen van de huid net achter het hart maakt het mogelijk om een incisie in de huid te plaatsen zonder een van de interne organen te beschadigen. Het openen van een grote (3-4 mm) incisie maakt het verwijderen van de lever en het beoordelen van de mate van verwijdering eenvoudig (Figuur 2C). Belangrijk is dat zebravissen kunnen herstellen van en uiteindelijk een wond van deze grootte kunnen genezen zonder primaire wondsluiting. Door de spons te knijpen en de lichaamswand samen te drukken, worden de viscerale organen toegankelijker en is het mogelijk om de tanden van een tang tussen de lever en de darm te schuiven. De tang kan vervolgens worden gebruikt om de portaalverbindingen tussen de lever en de darm te verbreken. Zodra dit is bereikt, kunnen fijne tangen worden gebruikt om de ventrale kwab af te pellen, zodat deze kan worden gescheiden van de rest van de lever.
We hebben de lever-lichaamsgewichtverhoudingen (LBR) gemeten van dieren die werden blootgesteld aan schijn- en PHX-operaties. We ontdekten dat de LBR van PHX-dieren met 7 dpi vergelijkbaar was met controles (figuur 3F). Aangezien de ventrale kwab op dit punt niet was geregenereerd(figuur 3E),hebben we geconcludeerd dat de regeneratie plaatsvond door compensatie in de dorsale kwabben. Om de vraag te beantwoorden of de ventrale kwab uiteindelijk kan regenereren bij zebravissen, hebben we PHX uitgevoerd en de leverhergroei onderzocht. Gemiddeld was de verhouding tussen de lengte van de ventrale kwab en de darm hoger bij 36 dpi dan bij 1 dpi, wat wijst op regeneratie van de ventrale kwab (Figuur 4C-D). Er is een grote variatie in de reactie van dieren op de verwondingen, waarbij sommige dieren zeer weinig groei ervaren en andere een aanzienlijk herstel van de ventrale kwab ervaren (figuur 4E). We concluderen dat de lever kan regenereren met een mengsel van epimorfe regeneratie van de ventrale kwab en compenserende regeneratie in de dorsale kwabben, zij het op verschillende tijdstippen. Aangezien eerdere studies gedeeltelijke hepatectomieën hebben gebruikt om de rol van individuele genen5,7,9 en signaleringsroutes6,8,10 na resectie te bepalen, verwachten we dat dit protocol ons begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen van leverregeneratie bij een volwassen gewerveld dier zal bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
I.M.O. wordt ondersteund door de NIAAA (F32AA027135). W.G. wordt ondersteund door R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 en het Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. is een Pew Scholar in Biomedical Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K.
- Grisham, J. W.
