Summary
यह प्रोटोकॉल वयस्क जेब्राफिश में यकृत के वेंट्रल पालि को हटाने की प्रक्रिया का वर्णन करता है ताकि यकृत उत्थान के अध्ययन को सक्षम किया जा सके।
Abstract
जिगर की विफलता दुनिया भर में मौत के प्रमुख कारणों में से एक है, और पुरानी जिगर की बीमारी से मृत्यु दर संयुक्त राज्य अमेरिका में तेजी से बढ़ रही है । स्वस्थ यकृत विषाक्त क्षति से पुनर्जीवित करने में सक्षम हैं, लेकिन उन्नत यकृत रोग में, यकृत की प्राकृतिक क्षमता को पुनर्जीवित करने के लिए बिगड़ा हुआ है। ज़ेब्राफिश पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक प्रणाली के रूप में उभरा है। वे आंशिक हेपेटेक्टॉमी से यकृत उत्थान का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल हैं, प्रत्यक्ष नैदानिक प्रासंगिकता के साथ एक प्रक्रिया जिसमें यकृत के हिस्से को शल्य चिकित्सा से हटा दिया जाता है, बाकी को बरकरार छोड़ दिया जाता है। आंशिक हेपेटेक्टॉमी के लिए कोई मानक प्रोटोकॉल नहीं है; इस मॉडल का उपयोग करके पिछले अध्ययनों ने थोड़ा अलग प्रोटोकॉल का उपयोग किया है और अलग परिणामों की सूचना दी है। यहां वर्णित वयस्क जेब्राफिश में आंशिक हेपेटेक्टॉमी करने के लिए एक कुशल, प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल है। हम इस तकनीक का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए करते हैं कि जेब्राफिश पुनः प्राप्त पालि के एपीमॉर्फिक पुनर्जनन में सक्षम हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग जेब्राफिश में यकृत उत्थान के लिए आवश्यक तंत्र से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
मनुष्यों में ठोस अंगों में, जिगर एकमात्र अंग है जो1पुनर्जनन करने में सक्षम है। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि यकृत एक आवश्यक अंग है, जो प्रमुख मेटाबोलिक कार्यों, ऊर्जा भंडारण, रक्त विषहरण, प्लाज्मा प्रोटीन का स्राव और पित्त उत्पादन2के लिए जिम्मेदार है। विषैले या भड़काऊ क्षति के कारण खोए गए हेपेटोसाइट्स को मुख्य रूप से शेष हेपेटोसाइट्स 1 के विभाजन के माध्यम से प्रतिस्थापित कियाजाताहै। यकृत उत्थान का अध्ययन करने के लिए एक शास्त्रीय प्रयोगात्मक मॉडल आंशिक हेपेटेक्टोमी है, जहां यकृत के व्यक्तिगत पालि को हटा दिया जाता है, शेष पालिको 3बरकरार छोड़ दिया जाता है। यह प्रक्रिया शुरू में चूहों में विकसित की गई थी, जिसमें लगभग दो तिहाई जिगर द्रव्यमान हटा दिया जाता है। स्तनधारियों में आंशिक हेपेटेक्टॉमी के बाद, शेष पालियों में प्रतिपूरक पुनर्जनन तब तक होता है जब तक कि यकृत अपने प्रारंभिक द्रव्यमान को ठीक नहीं करता है। विशेष रूप से, स्तनधारी जिगर लापता पालि की जगह नहीं है।
जेब्राफिश (डैनियो रेरियो)वयस्क अंग उत्थान4का अध्ययन करने के लिए एक ट्रैक्टेबल मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है । ज़ेब्राफ़िश जिगर, जबकि संरचनात्मक रूप से स्तनधारी जिगर से अलग है, एक ही कोशिका प्रकार से बना है और स्तनधारियों2में के रूप में एक ही कार्य कार्य करता है । यह तीन पालि से बना है, जिसमें दो पृष्ठीय पालि और एक एकल वेंट्रल पालि होती है जो आंत के साथ चपटी होती है। आंशिक हेपेटेक्टोमी पहले जेब्राफिश में किया गया है, जिसमें परस्पर विरोधी खातों के साथ पुनर्जनन के सटीक मोड के रूप में किया गया है। आमतौर पर, पूरे वेंट्रल पालि को हटाकर एक तिहाई आंशिक हेपेटेक्टोमी किया जाता है। प्रारंभिक रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि वेंट्रल पालि को हटाने के बाद, इसे एक सप्ताह के भीतर पूरी तरह से पुनर्जीवित किया गया था5,6,7,सुझाव है कि स्तनधारी जिगर के विपरीत, जेब्राफिश जिगर एपिमॉर्फिक पुनर्जनन में सक्षम है। बाद के अध्ययनों से पता चला कि वेंट्रल लोब को हटाने के परिणामस्वरूप पृष्ठीय पालि में क्षतिपूर्ति उत्थान हुआ, न कि लापता वेंट्रल पालि के पुनर्जनन के बजाय, और अंततः एक सप्ताह के भीतर यकृत द्रव्यमान की वसूली8,9। वेंट्रल लोब के पुन:खंड के बाद पृष्ठीय पालि की प्रतिलिपि प्रोफाइलिंग से प्रतिपूरक उत्थान10से जुड़े महत्वपूर्ण परिवर्तनों का पता चला । यह देखते हुए कि जिगर के उत्थान का तरीका चोट8की सीमा के साथ भिन्न हो सकता है, हमने अनुमान लगाया कि परिणामों में विसंगतियां अनुसंधान समूहों के बीच आंशिक हेपेटेक्टॉमी प्रोटोकॉल में तकनीकी भिन्नता के कारण हो सकती हैं।
यह प्रोटोकॉल वेंट्रल पालि को हटाकर वयस्क जेब्राफिश पर एक तिहाई आंशिक हेपेटेक्टॉमी करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। यह तकनीक यकृत उत्थान के तंत्र का आकलन करने के लिए मूल्यवान होगी।
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Protocol
जेब्राफिश को मानक प्रक्रियाओं के अनुसार उठाया और पैदा किया गया। प्रयोगों को ब्रिघम और महिला अस्पताल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (2016N000405) द्वारा अनुमोदित किया गया था । प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले वयस्क जेब्राफिश को 24 घंटे के लिए उपवास किया गया था। सिस्टम का पानी जलीय सुविधा में जेब्राफिश हाउसिंग टैंकों में पानी को संदर्भित करता है।
1. तैयारी और एनेस्थेटाइजेशन
- सिस्टम पानी में 0.016% ट्राइकेन समाधान तैयार करें।
सावधानी: यदि यह आंखों, त्वचा या श्वसन तंत्र के संपर्क में आता है तो ट्राइकेन एक अड़चन है। - विच्छेदन प्रोटोकॉल के दौरान एनेस्थेटाइज्ड जेब्राफिश को पकड़ने के लिए स्पंज तैयार करें। एक पूर्ण स्पंज को क्वार्टर में काट लें। रेजर ब्लेड का उपयोग करके, स्पंज की एक पतली कील को हटा दें जो स्पंज क्वार्टर की लंबी धुरी के समानांतर चलता है।
- भट्ठा एक वयस्क मछली को समायोजित करने के लिए काफी लंबा होना चाहिए (यह मछली के विभिन्न आकारों के बीच भिन्न होगा)। उदाहरण के लिए, एक वयस्क मछली के लिए लंबाई में 35 मिमी, भट्ठा की लंबाई 20 मिमी होनी चाहिए। सिर और शरीर को स्पंज में सुंघनी ढंग से आयोजित किया जाता है, लेकिन पूंछ स्पंज(चित्रा 1B)के किनारे पिछले चलाता है ।
- स्पंज को 0.016% ट्राइकेन समाधान में भिगो दें।
- 0.016% ट्राइकेन समाधान के 625 एमएल में वयस्क जेब्राफिश (या तो पुरुष या महिला) रखें।
- 6 मिनट के लिए या जब तक मछली को छूने के लिए अनुत्तरदायी है।
- संदंश का उपयोग करके, सावधानी से ट्राइकेन टैंक से मछली को हटा दें और मछली वेंट्रल साइड को स्पंज(चित्रा 1A - बी)के नाली में रखें।
- स्पंज को ऊपर-नीचे रोशनी के साथ विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
2. सर्जरी
- ठीक संदंश का उपयोग करना, त्वचा और तराजू मध्यस्थता चुटकी, बस दिल के पीछे(चित्रा 1B)।
- वसंत-भरी हुई कैंची का उपयोग करके, शरीर की गुहा(चित्रा 1C - D)में एक छेद बनाने के लिए संदंश के नीचे एक कट बनाएं। ध्यान रखें कि दिल या किसी बड़ी रक्त वाहिका को घायल न करें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप मृत्यु दर में वृद्धि होगी।
- वसंत-भरी हुई कैंची का उपयोग करके, पेट के साथ 3-4 मिमी चीरा बनाएं, जब तक चीरा पेल्विक पंख(चित्रा 1D - ई)पर नहीं आता, तब तक पीछे से प्रसंस्करण करें। इस बिंदु से, जिगर की वेंट्रल पालि चीरा के माध्यम से दिखाई दे सकता है।
- शरीर गुहा से आंत के अंगों को मजबूर करने के लिए स्पंज के किनारों को एक हाथ से निचोड़ें। जिगर की वेंट्रल पालि आंत के शीर्ष पर दिखाई देगी(आंकड़े 1F,2A-B)। जिगर सुनहरे भूरे रंग की आंत पर फैले गुलाबी या नारंगी संरचना के रूप में दिखाई देगा। नकली नियंत्रण के रूप में नामित जानवरों को इस बिंदु पर बरामद कर रहे हैं ।
- बारीक संदंश को निचोड़ें ताकि दोनों टीन्स छू सकें। स्पंज पर दबाव रखते हुए, लिवर और आंत(चित्रा 1G)के बीच में ठीक संदंश के टीन्स स्लाइड करें। आंत को पंक्चर न करने का ध्यान रखें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप मृत्यु दर में वृद्धि होगी।
- धीरे-धीरे संदंश पर दबाव को आराम दें ताकि टीन एक-दूसरे से दूर चले जाएं(चित्रा 1H)। यह स्लाइडिंग एक्शन वेंट्रल पालि और आंत(चित्रा 2B)के बीच कई पोर्टल नस अनुलग्नकों को तोड़ता है, और वेंट्रल पालि को साफ से हटाने के लिए आवश्यक है। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि यकृत और आंत के बीच सभी पोर्टल कनेक्शन कटे न हों।
- ठीक संदंश का उपयोग कर आंत से वेंट्रल पालि वापस छील और जिगर के बाकी हिस्सों से मुक्त वेंट्रल पालि में कटौती(चित्रा 1I)।
- इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप एक तिहाई आंशिक हेपेटेक्टॉमी(चित्रा 1J)होता है।
3. वसूली
- सावधानी से मछली को स्पंज से निकालकर सिस्टम के पानी के टैंक में रखें।
- पिपेट सिस्टम पानी कुछ मिनटों के लिए गिल्स पर जब तक मछली अपने आप में तैर रही है(चित्रा 1K)।
- उन्हें वापस सिस्टम पर रखने से पहले 2-4 घंटे के लिए मछली की निगरानी करें। सर्जरी के बाद पूरे 24 घंटे तक मछली न खिलाएं।
- प्रयोग की अवधि के लिए रोजाना मछली की निगरानी करें।
- समय के साथ, शरीर की दीवार में चीरा टांके की आवश्यकता के बिना स्वाभाविक रूप से ठीक हो जाएगा(चित्रा 1L,2C)।
4. आंत लंबाई विश्लेषण करने के लिए वेंट्रल पालि
- सभी सहकारी आंदोलनों के बंद होने तक 10 मिनट के लिए बर्फ के पानी में विश्लेषण के लिए किस्मत में सभी जानवरों को इच्छामृत्यु।
- बर्फ के पानी से मछली निकालें और इसे एक स्पंज की नाली में वेंट्रल साइड अप रखें।
- वसंत-भरी हुई कैंची का उपयोग करके, हृदय की पूर्वकाल-पीछे की स्थिति में वेंट्रल बॉडी वॉल में चीरा लगाएं। फिर दो और चीरों कि पहले चीरा से पूर्वकाल पीछे धुरी के साथ चलाने के सभी तरह श्रोणि पंख के लिए बनाते हैं । (चित्रा 2A)।
- आंत के अंगों(चित्रा 2A)को प्रकट करने के लिए त्वचा और मांसपेशियों को वापस छील दें।
- एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके आंत के अंगों की उज्ज्वल-क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियां प्राप्त करें। देखने के इस क्षेत्र में वह क्षेत्र शामिल होगा जहां वेंट्रल लोब को फिर से विभाजित किया गया था। क्योंकि जानवरों को विश्लेषण से पहले इच्छामृत्यु दी जाती है, इस तरह का विश्लेषण एक ही मछली की दीर्घकालिक इमेजिंग को रोकता है।
5. शरीर के वजन अनुपात विश्लेषण के लिए जिगर
- सभी सहकारी आंदोलनों के बंद होने तक 10 मिनट के लिए बर्फ के पानी में विश्लेषण के लिए किस्मत में सभी जानवरों को इच्छामृत्यु।
- मछली को 50 एमएल शंकु नली में रखें।
- 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 25 एमएल और ट्यूब में 0.3% ट्वीन जोड़ें।
सावधानी: फॉर्मलडिहाइड विषाक्त है, और फॉर्मलडिहाइड युक्त समाधानों को हमेशा रासायनिक हुड में संसाधित किया जाना चाहिए। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए नूटे।
- 1x पीबीएस और 0.3% ट्वीन में चार 10 मिनट वॉश करें।
- संदंश के साथ मछली पुनः प्राप्त करें, और एक कागज तौलिया पर सूखी दाग ।
- पूरी मछली का वजन रिकॉर्ड करें।
- वसंत-भरी हुई कैंची का उपयोग करके, हृदय की पूर्वकाल-पीछे की स्थिति में वेंट्रल बॉडी वॉल में चीरा लगाएं। फिर, दो और चीरों कि पहले चीरा से पूर्वकाल पीछे धुरी के साथ चलाने के सभी तरह श्रोणि पंख के लिए । (चित्रा 2A)।
- आंत के अंगों(चित्रा 2A)को प्रकट करने के लिए त्वचा और मांसपेशियों को वापस छील दें।
- एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके यकृत की उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों को प्राप्त करें।
- जिगर को काटना, जिगर के टुकड़ों को एक वजनी नाव पर रखना।
- लिवर का वजन रिकॉर्ड करें।
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Representative Results
वयस्क जेब्राफिश लिवर की पुनर्योजी क्षमता की जांच करने के लिए, हमने वयस्क जेब्राफिश में आंशिक हेपेटेक्टॉमी (पीएचएक्स) का प्रदर्शन किया। सामान्य तौर पर, बड़े वयस्कों (लंबाई में 30-40 मिमी) का चयन किया गया था, जो 1.5-2.5 साल पुराने थे। व्यक्तिगत प्रयोगों के भीतर, जानवरों को एक ही टैंक से चुना गया था, और उम्र और आकार मिलान किया गया था। एक उपयुक्त नियंत्रण के रूप में, हमने नकली सर्जरी का उपयोग किया जिसमें जानवर दोनों एनेस्थेटाइज्ड थे और वेंट्रल शरीर की दीवार में एक बड़ा चीरा प्राप्त किया गया था लेकिन किसी भी ऊतक को हटाने के बिना बरामद किया गया था। नकली नियंत्रण के लिए जीवित रहने की दर पुरुष और महिला दोनों जेब्राफिश के लिए 90%-100% से लेकर थी। PHX जानवरों के लिए जीवित रहने की दर पुरुष ज़ेब्राफिश के लिए 60%-75% और महिला ज़ेब्राफिश के लिए 60%-90% से लेकर, सर्जरी के बाद पहले 24 घंटे में होने वाली सभी मौतों के साथ ।
PHX के बाद जिगर की वसूली की मात्रा के लिए सोने के मानक शरीर के वजन अनुपात, या LBR के लिए जिगर है । इस परख का उपयोग स्तनधारी11 और जेब्राफिश मॉडल8दोनों में यकृत द्रव्यमान वसूली के दोनों माप के लिए किया गया है । जिगर के वजन को मज़बूती से निर्धारित करने के लिए, हमने निश्चित जानवरों पर वजन माप किया, जैसा कि पहले8वर्णित था। हमने जंगली प्रकार, अघायल जेब्राफिश पर एलबीआर माप किए, और पाया कि जैसा कि पहले8रिपोर्ट किया गया था, मादा जेब्राफिश ने नर जेब्राफिश (महिला जेब्राफिश के लिए 3.3% और पुरुष जेब्राफिश के लिए 1.8%)(चित्रा 3 ए)की तुलना में एलबीआर को लगभग दोगुना कर दिया था। हम दोनों लिंगों के वयस्क ज़ेब्राफिश पर नकली और PHX प्रदर्शन किया और 0 और 7 दिनों के बाद चोट (डीपीआई)(चित्रा 3B)पर LBR का विश्लेषण किया । 0 डीपीआई में, नकली जानवरों में स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली वेंट्रल पालि थी, जबकि पीएचएक्स जानवरों में वेंट्रल पालि पूरी तरह से अनुपस्थित थी(चित्रा 3 सी)। विशेष रूप से, इसके परिणामस्वरूप एलबीआर (नर मछली में 30% की कमी, मादा मछली में 20% की कमी)(चित्रा 3 डी)में उल्लेखनीय कमी आई। 7 डीपीआई में विश्लेषण की गई मछली की पलटन में, हमने पाया कि वेंट्रल पालि(चित्रा 3E)पुनर्जीवित नहीं हुई थी, और फिर भी पीएचएक्स और नकली नियंत्रण के एलबीआर तुलनीय थे(चित्रा 3F)। इन मापों से संकेत मिलता है कि 7 डीपीआई द्वारा, यकृत ने पूर्व रिपोर्ट8,9के साथ समझौते में, संभवतः पृष्ठीय लोब्स में प्रतिपूरक पुनर्जनन द्वारा नकली नियंत्रण के सापेक्ष बड़े पैमाने पर वापस आ गया है।
हमने यह जांच करने का फैसला किया कि क्या पर्याप्त समय दिया गया है, जिगर का वेंट्रल पालि उत्थान में सक्षम था। वयस्क टीजी (fabp10a: CFP-NTR) मछली को प्रयोग के लिए चुना गया था, क्योंकि ये मछली हेपेटोसाइट्स में सीएफपी एक्सप्रेस करती है, जो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके यकृत के दृश्य के लिए अनुमति देती है। जानवरों की एक पलटन पूर्ण एक तिहाई आंशिक हेपेटेक्टॉमी प्रोटोकॉल के अधीन थी। जानवरों का विश्लेषण 1 या 36 डीपीआई(चित्रा 4A)में किया गया था। प्रत्येक जानवर के लिए, आंत के लिए वेंट्रल पालि लंबाई का अनुपात मापा गया था(चित्रा 4B)।
नकली सर्जरी के अधीन जानवरों में एक प्रमुख वेंट्रल लोब था जो आंत की लंबाई का 50%-100% कब्जा कर लिया था, जबकि एक तिहाई आंशिक हेपेटेक्टॉमी के अधीन जानवरों में गंभीर रूप से कम वेंट्रल लोब था। आश्चर्यजनक रूप से, 36 डीपीआई में कई आंशिक हेपेटेक्टोमी जानवरों में 1 डीपीआई(चित्रा 4 सी)पर आंशिक हेपेटेक्टोमी जानवरों की तुलना में आंत अनुपात में वृद्धि हुई थी। नकली नियंत्रण में वेंट्रल पालि के आकार में कोई वृद्धि नहीं हुई; हालांकि, आंशिक हेपेटेक्टोमी(चित्रा 4डी)से वसूली के बाद वेंट्रल पालि के आकार में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई। हमने कहा कि सर्जरी के जवाब में एक व्यापक भिन्नता थी, कुछ जानवरों के साथ कोई उत्थान प्रदर्शित, और दूसरों को स्पष्ट रूप से एक अच्छी तरह से परिभाषित वेंट्रल पालि(चित्रा 4E)पुनर्जीवित । इन परिणामों से पता चलता है कि वेंट्रल पालि वयस्क जेब्राफिश में सर्जिकल लिवर रीसेक्शन से पुनर्जीवित करने में सक्षम है। एक साथ लिया गया, हमारा काम इंगित करता है कि जेब्राफिश जिगर एपीमॉर्फिक और प्रतिपूरक पुनर्जनन दोनों में सक्षम है।
चित्र 1:आंशिक हेपेटेक्टॉमी प्रोटोकॉल। (ए)वयस्क जेब्राफिश का आरेख, पूर्वकाल-पीछे और पृष्ठीय-वेंट्रल अक्षों के साथ उल्लेख किया गया। (ख)एनेस्थेटाइजेशन के बाद किसी जानवर को स्पंज (नीले रंग में दिखाया गया) में एम्बेडेड किया जाता है ताकि वह वेंट्रल साइड अप हो । ठीक संदंश त्वचा सिर्फ दिल के पीछे चुटकी के लिए उपयोग किया जाता है। स्पंज स्पष्टता के लिए बाद के पैनलों में नहीं दिखाया गया है। (ग)कैंची का उपयोग त्वचा को दिल के ठीक पीछे तोड़ने के लिए किया जाता है। (D-E) कैंची का उपयोग अब खुले घाव पर पूर्वकाल से पीछे तक चलने वाले 3-4 मिमी चीरा बनाने के लिए किया जाता है, जो श्रोणि पंख से ठीक पहले समाप्त होता है। (च)स्पंज के किनारों को निचोड़ने से आंत के अंग बड़े घाव से बाहर निकल जाते हैं । (जी)दोनों टीन्स को छूने वाले फाइन स्ट्रेंप्स लिवर और आंत के वेंट्रल पालि के बीच फिसलते हैं । (ज)संदंश आराम कर रहे हैं, जिससे उन्हें जिगर और आंत के बीच पोर्टल नस अनुलग्नकों को तोड़ने के लिए । इस प्रक्रिया को वेंट्रल पालि की लंबाई के साथ दोहराया जाता है। (I-J) वेंट्रल पालि को इसके पीछे के छोर से खींचा जाता है, जबकि कैंची का उपयोग लिवर के बाकी हिस्सों से वेंट्रल पालि को तोड़ने के लिए किया जाता है। (कश्मीर)जानवर प्रणाली पानी के साथ एक वसूली कक्ष में रखा जाता है, जहां यह चेतना और अधिकार ही आ जाता है । (L)समय के साथ, आंत शरीर गुहा में वापस खींच रहे हैं और घाव भर देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2:जेब्राफिश शरीर रचना विज्ञान और आंशिक हेपेटेक्टॉमी से वसूली। (ए)आंत के अंगों के विश्लेषण के लिए, जानवरों को इच्छामृत्यु दी जाती है और वेंट्रल साइड को स्पंज पर रखा जाता है। सबसे पहले, दिल (लाल रेखा) की पूर्वकाल-पीछे की स्थिति में एक चीरा किया जाता है। फिर, दो चीरे उत्पन्न होते हैं जो पूर्वकाल-पीछे की धुरी के साथ श्रोणि पंख (नीली रेखा) तक चलते हैं। फिर, त्वचा और मांसपेशियों को वापस छील दिया जाता है, आंत के अंगों का खुलासा होता है। लेबल आंत, जिगर की वेंट्रल पालि, और उस पालि में केंद्रीय नस हैं। (ख)आंत के अंगों के विश्लेषण के लिए एक जेब्राफिश के वेंट्रल दृश्य की लाइव छवि । जिगर के वेंट्रल लोब को बिंदीदार सफेद रेखा के साथ रेखांकित किया जाता है। 2x छवि में पीला बॉक्स 8x छवि के स्थान को इंगित करता है। सफेद एरोहेड आंत और जिगर के बीच पोर्टल नस कनेक्शन का संकेत देते हैं। (ग)संकेतित समय बिंदुओं पर आंशिक हेपेटेक्टॉमी प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न घाव का वेंट्रल दृश्य। समय के साथ, चीरा पूरी तरह से भर देता है। स्केल बार, 500 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:आंशिक हेपेटेक्टॉमी के बाद प्रतिपूरक उत्थान। (ए)लिवर टू बॉडी वेट (एलबीआर) अनुपात जंगली प्रकार, अघायल जेब्राफिश के लिए मापा गया था । मादा जेब्राफिश नर जेब्राफिश की तुलना में एलबीआर लगभग दोगुनी है। मादा जानवरों की तुलना विलकॉक्सन रैंक योग परीक्षण, ****पी < 0.0001 का उपयोग करके पुरुष जानवरों से की गई थी। (ख)योजनाबद्ध यह दर्शाता है कि इस प्रयोग के लिए जंगली प्रकार की जेब्राफिश का उपयोग किया गया था । जानवरों को नकली या आंशिक हेपेटेक्टॉमी (पीएचएक्स) के अधीन किया गया था, और फिर या तो चोट (डीपीआई) के बाद 0 या 7 दिनों में तय किया गया था। फिक्स्ड जानवरों को चित्रित किया गया था और एलबीआर माप के अधीन किया गया था। (C,E) दिखाया गया है कि 0 डीपीआई(सी)और 7 डीपीआई(ई)पर नकली या पीएचएक्स के अधीन जानवरों की प्रतिनिधि छवियां हैं। पीएचएक्स जानवरों में वेंट्रल लोब्स की पूरी अनुपस्थिति पर ध्यान दें। सभी छवियों के लिए, दिखाया गया आंत अंगों का एक वेंट्रल दृश्य है। छवियां उज्ज्वल क्षेत्र छवियां हैं। लिवर के वेंट्रल लोब को सफेद में रेखांकित किया जाता है। स्केल बार, 500 माइक्रोन। (D,F) 0 डीपीआई(डी)और 7 डीपीआई(एफ)पर नकली और पीएचएक्स सर्जरी के बाद पुरुष और महिला जेब्राफिश दोनों के लिए जिगर के शरीर के वजन अनुपात के लिए बार रेखांकन। बार की ऊंचाई मतलब मूल्य है, और त्रुटि सलाखों SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं । जबकि 0 डीपीआई पर आंशिक हेपेटेक्टॉमी के बाद एलबीआर में कमी आई है, 7 डीपीआई पर पीएचएक्स और नकली जानवरों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है, जो एलबीआर की बहाली का संकेत है। विल्कॉक्सन रैंक योग परीक्षण का उपयोग करके आंशिक हेपेटेक्टॉमी नमूनों की तुलना नकली नियंत्रण से की गई थी, एनएस = महत्वपूर्ण नहीं, * पी < 0.05, **p < 0.01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4:ज़ेब्राफिश आंशिक हेपेटेक्टॉमी के बाद अपने वेंट्रल लोब्स को पुनर्जीवित कर सकता है।(ए)योजनाबद्ध यह दर्शाता है कि इस प्रयोग के लिए टीजी (fabp10a:CFP-एनटीआर) का उपयोग किया गया था। इमेजिंग द्वारा सर्जरी और विश्लेषण संकेत समय बिंदुओं पर किया गया। (ख)जानवरों का विश्लेषण कैसे किया गया, यह प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण छवि । जानवरों को वेंट्रल लोब (लाल रंग में), आंत की लंबाई (पीले रंग में) की लंबाई को मापने और आंत के प्रतिशत की गणना करके निर्धारित किया गया था जो वेंट्रल लोब (सफेद में) है। (ग)दिखाया गया जानवरों की एक प्रतिनिधि छवि है जो चोट (डीपीआई) के बाद 1 और 36 दिनों में नकली या आंशिक हेपेटेक्टॉमी (पीएचएक्स) के अधीन है। (घ)1 और 36 डीपीआई में नकली या आंशिक हेपेटेक्टॉमी के अधीन जानवरों के लिए आंत की लंबाई के लिए वेंट्रल पालि लंबाई के अनुपात के वायलिन भूखंड। प्रत्येक डॉट एक ही मछली से मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। नर मछली के लिए मूल्य नीले रंग में हैं, लाल रंग में मादा मछली। विल्कॉक्सन रैंक राशि परीक्षण का उपयोग करके नकली नियंत्रणों की तुलना में आंशिक हेपेटेक्टॉमी नमूने थे, एनएस = महत्वपूर्ण नहीं, * पी < 0.05। (ई)दिखाया गया 36 डीपीआई में आंशिक हेपेटेक्टॉमी जानवरों के दो उदाहरण हैं जो पुनर्जीवित नहीं हुए, और दो उदाहरण जो पुनर्जीवित हुए। सभी छवियों के लिए, दिखाया गया आंत अंगों का एक वेंट्रल दृश्य है। छवियां एक CFP फ्लोरेसेंस छवि और एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि का एक विलय कर रहे हैं । सीएफपी फ्लोरेसेंस केवल यकृत में मौजूद है। जिगर के वेंट्रल लोब को लाल रंग में रेखांकित किया जाता है। आंत का प्रतिशत जो वेंट्रल पालि में रहता है वह सफेद में होता है। स्केल बार, 500 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
लिवर पुनर्जनन के लिए जेब्राफिश और स्तनधारी मॉडल के बीच शारीरिक अंतर जिगर की रिसेक्शन के लिए अनूठी चुनौतियां पेश करते हैं। ज़ेब्राफ़िश में जिगर दिल और आंत के करीब निकटता में है; अनजाने में या तो अंग को नुकसान पहुंचाने से मृत्यु दर में वृद्धि हुई । जेब्राफिश लिवर को समझाया नहीं जाता है, जिससे आंत से अलग होना ज्यादा मुश्किल हो जाता है। लिवर को पोर्टल नसों के जरिए आंत से पोषक तत्वों से भरपूर रक्त मिलता है। स्तनधारियों में, आंत छोड़ने वाली नसें एक प्राथमिक पोर्टल नस पर एकाग्र होती हैं जो फिर विभाजन हो जाती हैं क्योंकि यह यकृत12में प्रवेश करती है। इसके विपरीत, जेब्राफिश जिगर छोटे जहाजों की एक श्रृंखला से पोर्टल परिसंचरण प्राप्त करता है जो आंत से सीधे जिगर(चित्रा 2B)में जाते हैं। इस प्रकार, आंत पर चपटा जिगर का प्रत्येक पालि, इन जहाजों द्वारा आंत से सुरक्षित रूप से जुड़ा हुआ है। पहले पोर्टल नसों को तोड़ने के बिना वेंट्रल पालि को हटाने का प्रयास अक्सर अधूरा resection (डेटा नहीं दिखाया गया) में परिणाम कर सकते हैं । कुछ प्रारंभिक प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत मामूली चीरा के माध्यम से वेंट्रल पालि को बाहर निकालने का वर्णन करते हैं, जो इन पोर्टल अटैचमेंट5,6को तोड़ने की अनुमति नहीं देता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए बनाया गया है ताकि लगातार वेंट्रल लोब हटाने को सक्षम बनाया जा सके। एनेस्थेटाइज्ड जेब्राफिश को स्पंज के नाली में चुस्त रखा जाता है ताकि उनके गिलों को गीला रखा जा सके और प्रक्रिया की अवधि के लिए उनके शरीर स्थिर हो जाएं। त्वचा को दिल के ठीक पीछे से पिंच करने से किसी भी आंतरिक अंगों को नुकसान पहुंचाए बिना त्वचा में चीरा लगाना संभव हो जाता है। एक बड़ा (3-4 मिमी) चीरा खोलने जिगर को हटाने और हटाने की डिग्री का आकलन सीधा(चित्रा 2C)बनाता है । महत्वपूर्ण बात, ज़ेब्राफिश से उबर सकता है और अंततः किसी भी प्राथमिक घाव बंद होने के बिना इस आकार के घाव को ठीक कर सकता है। स्पंज को निचोड़कर और शरीर की दीवार को संकुचित करके, आंत के अंग अधिक सुलभ हो जाते हैं और यकृत और आंत के बीच में एक संदंश के टीन्स को स्लाइड करना संभव है। इसके बाद संदंश का उपयोग यकृत और आंत के बीच पोर्टल कनेक्शन को तोड़ने के लिए किया जा सकता है। एक बार यह हासिल हो जाने के बाद, वेंट्रल लोब को वापस छीलने के लिए ठीक संदंश का उपयोग किया जा सकता है ताकि इसे बाकी जिगर से अलग किया जा सके।
हम नकली और PHX सर्जरी के अधीन जानवरों के शरीर के वजन अनुपात (LBR) के लिए जिगर मापा । हमने पाया कि 7 डीपीआई द्वारा, पीएचएक्स जानवरों का एलबीआर नियंत्रण(चित्रा 3F)के बराबर था। यह देखते हुए कि वेंट्रल पालि इस बिंदु(चित्रा 3E)पर पुनर्जीवित नहीं हुई थी, हमने अनुमान लगाया कि पुनर्जनन पृष्ठीय पालि में मुआवजे के माध्यम से हुआ। इस सवाल का समाधान करने के लिए कि क्या वेंट्रल पालि अंततः जेब्राफिश में पुनर्जीवित हो सकती है, हमने पीएचएक्स का प्रदर्शन किया और लिवर री-ग्रोथ की जांच की। औसतन, आंत के लिए वेंट्रल पालि की लंबाई का अनुपात 1 डीपीआई की तुलना में 36 डीपीआई पर अधिक था, जो वेंट्रल लोब(चित्रा 4C-डी)के पुनर्जनन का संकेत देता है। चोटों के लिए जानवरों की प्रतिक्रिया में एक व्यापक भिन्नता है, कुछ जानवरों के साथ बहुत कम विकास का अनुभव होता है और अन्य वेंट्रल पालि(चित्रा 4E)की पर्याप्त वसूली का अनुभव करते हैं। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि यकृत पृष्ठीय पालि में वेंट्रल पालि और प्रतिपूरक पुनर्जनन के एपीमॉर्फिक पुनर्जनन के मिश्रण के साथ पुनर्जीवित हो सकता है, हालांकि विभिन्न टाइमस्केल पर। चूंकि पूर्व अध्ययनों में व्यक्तिगत जीन5, 7, 9और सिग्नलिंग पाथवे6,8,10 की भूमिका को परख करने के लिए आंशिक हेपेटेक्टॉमी का उपयोग किया गया है, इसलिए हम आशा करते हैं कि यह प्रोटोकॉल वयस्क कशेरुकी में यकृत उत्थान के आणविक और सेलुलर तंत्र की हमारी समझ को आगे बढ़ाएगा।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
I.M.O. NIAAA (F32AA027135) द्वारा समर्थित है। W.G. R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870, और कैंसर अनुसंधान में उत्कृष्टता के लिए क्लाउडिया एडम्स बर्र कार्यक्रम द्वारा समर्थित है। डब्ल्यूजी बायोमेडिकल साइंसेज में प्यू स्कॉलर है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
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