Summary
このプロトコルは、肝臓再生の研究を可能にするために、成体ゼブラフィッシュの肝臓の腹側葉を除去するための手順を説明します。
Abstract
肝不全は世界的に主要な死因の一つであり、慢性肝疾患による死亡率は米国で急激に増加している。健康な肝臓は、毒性の損傷から再生することができるが、先進の肝疾患では、再生する肝臓の自然な能力が損なわれる。ゼブラフィッシュは、再生を研究するための強力な実験システムとして登場しました。それらは部分的な肝切除術からの肝臓再生を研究するための理想的なモデルであり、肝臓の一部が外科的に除去され、残りはそのまま残る直接的な臨床的関連性を有する処置である。部分肝切除術のための標準的なプロトコルはありません。このモデルを使用した以前の研究では、わずかに異なるプロトコルを使用し、異なる結果を報告しました。ここで説明する、成体ゼブラフィッシュの部分肝切除術を行うための効率的で再現可能なプロトコルである。この技術を用い、ゼブラフィッシュが切除された葉のエピモルフィック再生が可能であることを実証する。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの肝臓再生に必要なメカニズムをさらに調べるのに使用できます。
Introduction
ヒトの固体器官の中で、肝臓は再生可能な唯一の器官である1.これは肝が必須臓器であるため、重要な代謝機能、エネルギー貯蔵、血液解毒、血漿タンパク質の分泌、胆汁産生を担う重要な2である。毒性または炎症性の損傷のために失われた肝細胞は、主に残りの肝細胞の分裂によって置換される1.肝臓再生を研究するための古典的な実験モデルの1つは、肝臓の個々の葉が除去され、残りの葉がそのまま残っている部分肝切除術である3.この手順は、最初にラットで開発されました, 肝臓の質量の約3分の2が除去されます.哺乳類の部分的な肝切除術の後、肝臓が最初の質量を回復するまで残りの葉に代償性再生が起こる。特に、哺乳類の肝臓は欠けている葉を置き換えません。
ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、成人臓器再生4を研究するための難解なモデルを表す。ゼブラフィッシュ肝臓は、哺乳類の肝臓と構造的に異なるが、同じ細胞タイプで構成され、哺乳動物2と同じ機能を果たす。それは3つの葉で構成され、2つの後部葉と腸に沿って平らにされる単一の腹側葉がある。部分的な肝切除術は、以前にゼブラフィッシュで行われ、再生の正確なモードに関して矛盾するアカウントを持つ。典型的には、腹側葉全体の除去によって3分の1分の肝切除術が行われる。最初の報告では、腹側葉を除去した後、1週間5、6、7以内に完全に再生し、哺乳類の肝臓とは対照的に、ゼブラフィッシュ肝臓はエピモルフィック再生が可能であることを示唆した。その後の研究では、腹側葉の除去は、行方不明の腹側葉の再生ではなく、後部葉の代償性再生をもたらし、最終的には週8、9以内に肝臓質量の回復をもたらした。腹側葉の切除後の側葉の転写的プロファイリングは、代償性再生10に関連する有意な変化を明らかにした。肝再生の様式は傷害8の程度によって変化する可能性があることを考えると、結果の不一致は研究グループ間の部分肝切除プロトコルの技術的変動によるものかもしれないと推測した。
このプロトコルは、腹側葉を除去することによって成体ゼブラフィッシュに3分の1の部分肝切除術を行うための手順を記述する。この技術は、肝再生のメカニズムを評価するために有用である。
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Protocol
ゼブラフィッシュは、標準的な手順に従って飼育され、飼育されました。実験はブリガム・アンド・ウィメンズ病院の施設動物の世話と使用委員会(2016N000405)によって承認されました。成体ゼブラフィッシュは、プロトコルの開始前に24時間断食した。システム水とは、水生施設のゼブラフィッシュの収容タンク内の水を指します。
1. 準備と麻酔
- システム水に0.016%トリケーヌ溶液を準備します。
注意:トリケーヌは、目、皮膚、または気道に接触すると刺激性です。 - 解剖プロトコル中に麻酔ゼブラフィッシュを保持するためにスポンジを準備します。完全なスポンジを四分の一に切ります。カミソリの刃を使用して、スポンジ四分の一の長い軸に平行に走るスポンジの薄いくさびを取り除きます。
- スリットは、成魚を収容するのに十分な長さでなければなりません(これは魚の異なるサイズによって異なります)。例えば、長さが35mmの成魚の場合、スリットの長さは20mmでなければなりません。頭と体はスポンジにぴったりと保持されていますが、尾はスポンジの端を越えて走ります(図1B)。
- スポンジを0.016%トリケイン溶液に浸します。
- 0.016%トリケーヌ溶液の625 mLに成体ゼブラフィッシュ(オスまたはメスのいずれか)を入れる。
- 6分間、または魚が触れに反応しなくなるまでインキュベートします。
- 鉗子を使用して、トリケーヌタンクから魚を慎重に取り出し、魚の腹側をスポンジの溝に上に置きます(図1A - B)。
- スポンジをトップダウン照明で解剖顕微鏡の下に置きます。
2. 手術
- 細かい鉗子を使って、皮膚をつまんで心をうろつき、心臓の後部にだけスケールする(図1B)。
- バネ付きハサミを使用して、鉗子の下にカットを行い、ボディキャビティに穴を開けます(図1C - D)。これは、増加死亡率をもたらすので、心臓や主要な血管を傷つけないように注意してください。
- バネ付きハサミを使用して、腹部に沿って3〜4mmの切開を行い、切開が骨盤ひれに到達するまで後処理する(図1D - E)。この時点で、肝臓の腹側葉は切開を通して見ることができる。
- 片手でスポンジの側面を絞り、内臓を体腔から強制的に外します。肝臓の腹側葉は腸の上に見えるでしょう(図1F、2A-B)。肝臓は、黄金色の腸の上に広がるピンクまたはオレンジ色の構造として表示されます。シャムコントロールとして指定された動物は、この時点で回収されます。
- 2つの尖叉が触れるように細かい鉗子を絞ります。スポンジに圧力をかけながら、肝臓と腸の間に細かい鉗子の尖叉をスライドさせます(図1G)。これは増加した死亡率をもたらすので、腸を穿刺しないように注意してください。
- 徐々に鉗子の圧力を緩め、尖叉が互いに離れるようにする(図1H)。この摺動作用は、腹側の葉と腸の間の多数の門脈の付着を切断し(図2B)、そして腹側の葉をきれいに取り除くために必要である。肝臓と腸の間のポータル接続がすべて切断されるまで、このプロセスを繰り返します。
- 細かい鉗子を使って腸から腹側葉を剥がし、残りの肝臓から離れた腹側葉を切る(図1I)。
- この手順により、3分の1の部分肝切除術が生じます(図1J)。
3. 回復
- 慎重にスポンジから魚を取り出し、システム水のタンクに置きます。
- ピペットシステムは、魚が自分で泳ぐまで数分間、エラの上に水を流します(図1K)。
- 魚をシステムに戻す前に2〜4時間監視します。手術後24時間魚に餌を与えないでください。
- 実験期間中、魚を毎日監視します。
- 時間が経つと、体壁の切開は縫合糸を必要とせずに自然に治癒します(図1L,2C)。
4. 腸長分析に対する腹側葉
- すべての眼の動きが止まるまで、氷水で10分間分析のために運命づけられたすべての動物を安楽死させます。
- 氷水から魚を取り出し、スポンジの溝に腹側を置きます。
- バネ付きハサミを使用して、心臓の前部後部位置の腹側の体壁に切開を行います。その後、最初の切開から骨盤のひれまで前部後方軸に沿って走る2つの切開をさらに2つ作ります。(図2A)
- 皮膚や筋肉を剥がして内臓を明らかにする(図2A)。
- 蛍光顕微鏡を用いて内臓の明視野画像と蛍光画像を取得します。この視野には、腹側葉が切除された領域が含まれます。動物は分析の前に安楽死させるため、この種の分析は同じ魚の長期イメージングを排除する。
5. 肝臓と体重比の分析
- すべての眼の動きが止まるまで、氷水で10分間分析のために運命づけられたすべての動物を安楽死させます。
- 50 mL円錐形のチューブに魚を入れる。
- 1x PBSに25mLのパラホルムアルデヒドを加え、チューブにツイーンを0.3%加えます。
注意:ホルムアルデヒドは有毒であり、ホルムアルデヒドを含む溶液は常に化学フードで処理する必要があります。 - 4°Cで48時間のヌテート。
- 1x PBSで10分の4回のスウィーを実行し、0.3%のトゥイーンを行います。
- 鉗子で魚を取り出し、ペーパータオルで乾かします。
- 魚全体の重量を記録します。
- バネ付きハサミを使用して、心臓の前部後部位置の腹側の体壁に切開を行います。その後、最初の切開から骨盤のフィンまで前部後方軸に沿って走る2つの切開をさらに2つ作ります。(図2A)
- 皮膚や筋肉を剥がして内臓を明らかにする(図2A)。
- 蛍光顕微鏡を用いて肝臓の明視野画像を取得する。
- 肝臓を解剖し、肝臓の破片を計量ボートに乗せた。
- 肝臓の体重を記録します。
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Representative Results
成体ゼブラフィッシュ肝臓の再生ポテンシャルを調べるために、成体ゼブラフィッシュで部分肝切除術(PHX)を行った。一般に、1.5〜2.5歳の範囲で、大きな成人(長さ30〜40mm)が選択された。個々の実験の中で、動物は同じタンクから選択され、年齢とサイズが一致した。適切な対照として、我々は、動物が麻酔を受け、腹側の体壁に大きな切開を受けたが、組織を除去せずに回収されたシャム手術を利用した。シャムコントロールの生存率は、オスとメスのゼブラフィッシュの両方で90%から100%の範囲であった。PHX動物の生存率は、オスのゼブラフィッシュで60%から75%、雌のゼブラフィッシュで60%から90%の範囲で、手術後の最初の24時間ですべての死亡が発生した。
PHXに続く肝臓の回復を定量化するためのゴールドスタンダードは、肝臓対体重比、またはLBRである。このアッセイは、哺乳動物11モデルとゼブラフィッシュモデル8の両方で肝臓質量回収の測定に使用されている。肝臓の重量を確実に定量するために、我々は、前に述べたように固定動物の体重測定を行った。野生型、怪我をしていないゼブラフィッシュに対してLBR測定を行い、以前に報告された8例のように、雌のゼブラフィッシュは雄ゼブラフィッシュ(雌ゼブラフィッシュでは3.3%、オスのゼブラフィッシュでは1.8%)と比較してLBRのほぼ2倍であることがわかりました(図3A)。男女ともに成体ゼブラフィッシュに対してシャムとPHXの両方を行い、外傷後0日と7日(dpi)でLBRを分析した(図3B)。0dpiでは、シャム動物ははっきりと見える腹側葉を持ち、PHX動物では腹側葉は完全に存在しなかった(図3C)。特に、これはLBRの大幅な減少(オスの魚の30%の減少、雌の魚の20%の減少)をもたらした(図3D)。7dpiで分析した魚のコホートでは、腹側の葉が再生していない(図3E)、それでもPHXとシャムコントロールのLBRは同等であることがわかりました(図3F)。これらの測定値は、7 dpiによって、肝臓が偽のコントロールに対して質量を取り戻したことを示し、おそらく、後葉の代償性再生によって、以前の報告8,9と一致する。
十分な時間を与えられた肝臓の腹側葉が再生できるかどうかを調べる。これらの魚は肝細胞でCFPを発現し、蛍光顕微鏡を用いて肝臓を可視化できるように、実験のために成人Tg(fabp10a:CFP-NTR)魚を選んだ。動物のコホートは、完全な3分の1分の肝切除プロトコルを受けた。動物は1または36dpiで分析した(図4A)。動物ごとに、腸に対する腹側葉長の比率を測定した(図4B)。
恥ずかしい手術を受けた動物は腸長の50%〜100%を占める顕著な腹側葉を有し、部分的な肝切除術を受けた動物は腹側葉を著しく減少させた。驚くべきことに、36dpiでの多くの部分肝切除術動物は、1dpiで部分肝切除動物と比較して腸に対する腹側葉の比率が増加した(図4C)。シャムコントロールでは腹側葉の大きさの増加はなかった。しかし、部分的な肝切除術から回復した後、腹側葉のサイズの統計的に有意な増加が観察された(図4D)。我々は、いくつかの動物が再生を示さない、および明確に明確に定義された腹側葉を再生する他の動物と、手術への応答に大きなばらつきがあることを指摘した(図4E)。これらの結果は、腹側葉が成体ゼブラフィッシュの外科的肝臓切除から再生できることを示している。一緒に考え、我々の研究は、ゼブラフィッシュ肝臓がエピモルフィックと代償性再生の両方が可能であることを示しています。
図1: 部分肝切除プロトコル( A)成体ゼブラフィッシュの図、前部後部および側側腹側の軸が記載されている図。(B)麻酔後、動物はスポンジ(青色で示す)に埋め込まれるので、腹側を上にします。細かい鉗子は心臓の後部の皮膚をつまむために使用される。スポンジは、明快さのために、後続のパネルに表示されません。(C)はさみは、心臓の後部の皮膚を壊すために使用されます。(D-E)はさみは、骨盤のフィンの直前に終了し、前から後部に3〜4ミリメートルの切開を行うために、現在開いている創傷で使用されます。(F)スポンジの側面を圧迫すると、内臓が大きな創傷から飛び出す。(G)両尖叉が触れた微細鉗子は、肝臓と腸の腹側葉の間で滑る。(H)鉗子はリラックスして、肝臓と腸の間の門脈の付着を壊す原因となる。このプロセスは、腹側の葉の長さに沿って繰り返されます。(I-J)腹側葉は後端から引き上げ、はさみは肝臓の残りの部分から腹側葉を切断するために使用される。(K)動物は、システム水と回復室に置かれ、そこで意識と権利そのものを取り戻す。(L)時間とともに、内臓は体腔に引き戻され、創傷は治癒する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ゼブラフィッシュの解剖学と部分肝切除術からの回復(A)内臓の分析のために、動物は安楽死させ、スポンジの上に腹側を置く。まず、心臓の前部後部位置(赤線)で切開が行われる。次いで、前部後軸に沿って骨盤のフィン(青線)に沿って走る2つの切開が生成される。その後、皮膚と筋肉が剥がれ、内臓が明らかになります。標識は、腸、肝臓の腹側葉、およびその葉の中枢静脈である。(B) 内臓の分析のために準備されたゼブラフィッシュの腹側図のライブ画像。肝臓の腹側葉は、白い点線で輪郭を描いています。2x イメージの黄色のボックスは、8x イメージの位置を示します。白い矢印は、腸と肝臓の間の門脈接続を示す。(C)示された時点で部分肝切除術によって発生した創傷の腹側図。時間が経つにつれて、切開は完全に治癒する。スケールバー、500 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:部分肝切除術後の代償性再生(A)肝臓から体重(LBR)比を野生型、傷つけていないゼブラフィッシュについて測定した。メスのゼブラフィッシュは、オスのゼブラフィッシュに比べてLBRのほぼ2倍です。雌の動物は、ウィルコクソンランクサムテストを使用して雄の動物と比較しました, ****p < 0.0001.(B) この実験に野生型ゼブラフィッシュを用いられたことを示す回路図。動物は、恥または部分的な肝切除術(PHX)を受け、その後、傷害後0または7日(dpi)に固定した。固定動物を画像化し、LBR測定を行った。(C,E)図示は、0dpi(C)および7dpi(E)でシャムまたはPHXを受けた動物の代表的な画像である。PHX動物の腹側葉の完全な欠如に注意してください。すべての画像について、示されているのは内臓の腹側図である。画像は明るいフィールドイメージです。肝臓の腹側葉は白で輪郭が描かされている。スケールバー、500 μm。(D, F)0 dpi(D)および 7 dpi(F)でのシャムおよび PHX 手術後の男女ゼブラフィッシュの両方の肝臓と体重の比率の棒グラフ。バーの高さは平均値であり、誤差範囲はSEMを表すが、0dpiでの部分肝切除術後のLBRの減少があるのに対し、7dpiでのPHXと偽動物の間に有意な差はなく、LBRの回復を示す。部分肝切除サンプルは、wilcoxonランク合計検定を用いた偽の対照と比較された、ns =有意ではない、*p<0.05、**p<0.01であった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ゼブラフィッシュは、部分的な肝切除術後に腹側葉を再生することができる。 画像による手術および分析は、示されたタイムポイントで行った。(B) 動物がどのように分析されたかを示す画像の例。動物は、腹側の葉の長さ(赤)、腸の長さ(黄色)を測定し、腹側の葉が占める腸の割合(白色)を計算することによって定量化した。(C)示されている動物の代表的な画像は、傷害後1日および36日後に恥または部分肝切除術(PHX)を受けた動物の代表的な画像である(dpi)。(D) 1及び36dpiで偽または部分的な肝切除術を受けた動物の腹側葉長と腸長の比率のバイオリンプロット。各ドットは、単一の魚からの値を表します。オスの魚の値は青で、メスの魚は赤です。部分肝切除サンプルを、Wilcoxonランク合計検定を用いた偽の対照と比較した <。(E)示されている部分肝切除動物の2例は再生しなかった36dpiで、そして再生した2つの例である。すべての画像について、示されているのは内臓の腹側図である。画像は、CFP蛍光画像と明視野画像の合成である。CFP蛍光は肝臓にのみ存在する。肝臓の腹側葉は赤で輪郭が描かされている。腹側の葉が占める腸の割合は白色である。スケールバー、500 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
肝臓再生のためのゼブラフィッシュと哺乳類モデルの解剖学的な違いは、肝臓切除に独特の課題を提示する。ゼブラフィッシュの肝臓は心臓と腸の近くにあります。誤ってどちらかの臓器にダメージを与えると、死亡率が増加する。ゼブラフィッシュの肝臓はカプセル化されておらず、腸から分離することがより困難になります。肝臓は、門脈を介して腸から栄養豊富な血液を受け取ります.哺乳類では、腸を離れる静脈は、肝臓12に入ると分裂する一次門脈に収束する。対照的に、ゼブラフィッシュ肝臓は、腸から肝臓に直接移動する一連の小さな血管から門脈循環を受ける(図2B)。したがって、肝臓の各葉は、腸の上に平らにされ、これらの血管によって腸にしっかりと付着している。最初に門脈を切断せずに腹側葉を取り除こうとすると、しばしば不完全な切除を引き起こす可能性があります(データは示されていません)。初期プロトコルの中には、比較的小さな切開を通して腹側葉を引き抜くものがあり、これらのポータルの添付ファイルを切断することを許可しない5,6.
ここで説明するプロトコルは、一貫した腹側葉除去を可能にするためにこれらの課題に対処するように設計されています。麻酔をかけたゼブラフィッシュは、スポンジの溝にぴったりと置かれ、手順の間、エラを濡らし、体を動かさないようにします。心臓の後部に皮膚をつまむと、内臓を傷つけずに皮膚に切開を起こすことができます。大きな(3-4 mm)切開すると、肝臓を除去し、除去の程度を簡単に評価します(図2C)。重要なことに、ゼブラフィッシュは、原発性創傷閉鎖なしに、この大きさの創傷から回復し、最終的に治癒することができる。スポンジを圧迫し、体壁を圧迫することで、内臓の臓器はよりアクセスしやすくなり、肝臓と腸の間に鉗子の尖叉を滑り込ますことができます。鉗子は肝臓と腸の間の門脈を切断するために使用することができる。これが達成されると、微細な鉗子を使用して腹側の葉を剥がし、肝臓の残りの部分から分離することができます。
恥とPHX手術を受けた動物の肝臓と体重比(LBR)を測定した。我々は、7 dpiによって、PHX動物のLBRが対照に匹敵することを発見した(図3F)。この時点で腹側葉が再生されていなかったことを考えると(図3E)、我々は、再生が後葉の補償によって起こったことを推測した。腹側葉が最終的にゼブラフィッシュで再生できるかどうかという問題に対処するために、PHXを行い、肝臓の再成長を調べた。平均して、腸に対する腹側葉の長さの比率は、1dpiよりも36dpiで高く、腹側葉の再生を示す(図4C-D)。怪我に対する動物の反応には大きなばらつきがあり、一部の動物は成長が非常に少なく、他の動物は腹側葉の実質的な回復を経験している(図4E)。我々は、肝臓が異なるタイムスケールではあるが、腹側葉の腹側葉のエピモルフィック再生と後部葉の代償再生の混合物で再生することができると結論付ける。切除後の個々の遺伝子5、7、9およびシグナル伝達経路6、8、10の役割をアッセイするために、以前の研究では、このプロトコルが成人脊椎動物における肝臓再生の分子および細胞メカニズムの理解を進めることが期待されます。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
I.M.O.は、NIAAA(F32AA027135)によってサポートされています。W.G.は、R01DK090311、R01DK105198、R24OD017870、およびがん研究の卓越性のためのクラウディア・アダムス・バー・プログラムによってサポートされています。W.G.は生物医学のピュー学者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K.
- Grisham, J. W.
