Summary
Bu protokol, karaciğer yenilenmesinin incelenmesini sağlamak için yetişkin zebra balıklarında karaciğerin ventral lobunun çıkarılması prosedürünü açıklar.
Abstract
Karaciğer yetmezliği dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde kronik karaciğer hastalığından ölüm oranı keskin bir şekilde artmaktadır. Sağlıklı karaciğerler toksik hasardan yenilenebilir, ancak ileri karaciğer hastalığında karaciğerin doğal yenilenme yeteneği bozulur. Zebra balığı, yenilenmeyi incelemek için güçlü bir deneysel sistem olarak ortaya çıkmıştır. Karaciğerin bir kısmının cerrahi olarak çıkarıldığı, geri kalanının sağlam bıraktığı doğrudan klinik alaka düzeyine sahip bir prosedür olan kısmi hepatektomiden karaciğer yenilenmesini incelemek için ideal bir modeldir. Kısmi hepatektomi için standart bir protokol yoktur; bu modeli kullanan önceki çalışmalar biraz farklı protokoller kullanmış ve farklı sonuçlar bildirmiştir. Burada açıklanan, yetişkin zebra balıklarında kısmi hepatektomi yapmak için verimli, tekrarlanabilir bir protokoldür. Zebra balıklarının resected lobun epimorfik rejenerasyonunu yapabildiğini göstermek için bu tekniği kullanıyoruz. Bu protokol zebra balıklarında karaciğer yenilenmesi için gerekli mekanizmaları daha fazla sorgulamak için kullanılabilir.
Introduction
İnsanlardaki katı organlar arasında karaciğer yenilenebilen tek organdır1. Karaciğer, temel metabolik fonksiyonlardan, enerji depolamadan, kan detoksifikasyonundan, plazma proteinlerinin salgılanmasından ve safra üretiminden sorumlu temel bir organ olduğu için bu kritiktir2. Toksik veya enflamatuar hasar nedeniyle kaybedilen hepatositler öncelikle kalan hepatositlerin bölünmesi ile değiştirilir1. Karaciğer yenilenmesini incelemek için klasik deneysel modellerden biri, karaciğerin bireysel loblarının çıkarıldığı ve kalan lobların sağlam kaldığı kısmi hepatektomidir3. Bu prosedür başlangıçta karaciğer kütlesinin yaklaşık üçte ikisinin çıkarıldığı sıçanlarda geliştirilmiştir. Memelilerde kısmi hepatektomiden sonra, karaciğer ilk kütlesini geri alana kadar kalan loblarda telafi edici rejenerasyon meydana gelir. Özellikle, memeli karaciğeri eksik lobların yerini almaz.
Zebra balığı (Danio rerio) yetişkin organ rejenerasyonunu incelemek için çekişli bir modeli temsil eder4. Zebra balığı karaciğeri, yapısal olarak memeli karaciğerinden farklı olsa da, aynı hücre türlerinden oluşur ve memelilerde olduğu gibi aynı işleve hizmet eder2. İki sırt lob ve bağırsak boyunca düzleştirilmiş tek bir ventral lob ile üç lobdan oluşur. Kısmi hepatektomi daha önce zebra balıklarında, kesin rejenerasyon modu ile çelişen hesaplarla gerçeklenmiştir. Tipik olarak, tüm ventral lobun çıkarılmasıyla üçte bir kısmi hepatektomi yapılır. İlk raporlar, ventral lobun çıkarılmasından sonra,5, 6,7hafta içinde tamamen yenilendiğini vememelikaraciğerinin aksine zebra balığı karaciğerinin epimorfik rejenerasyon yapabileceğini göstermektedir. Daha sonraki çalışmalar, ventral lobun çıkarılmasının, eksik ventral lobun yenilenmesi yerine sırt loblarında telafi edici yenilenme ile sonuçlendiğini ve sonuçta karaciğer kütlesinin bir hafta içinde iyileşmesine neden olduğunu göstermiştir8,9. Ventral lobun rezeksiyonunu takiben sırt loblarının transkriptomik profillemesi, kompanzasyon rejenerasyonu ile ilişkili önemli değişiklikler ortaya koydu10. Karaciğer rejenerasyon modunun yaralanmanın boyutuna göre değişebileceği göz önüne alındığında8, sonuçlardaki tutarsızlıkların araştırma grupları arasındaki kısmi hepatektomi protokolündeki teknik varyasyondan kaynaklanabileceğini tahmin ettik.
Bu protokol, ventral lobun çıkarılmasıyla yetişkin zebra balıklarında üçte bir kısmi hepatektomi yapılması için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu teknik karaciğer yenilenme mekanizmalarının değerlendirilmesi için değerli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebra balıkları standart prosedürlere göre yetiştirildi ve yetiştirildi. Deneyler Brigham ve Kadın Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (2016N000405) tarafından onaylandı. Yetişkin zebra balıkları, protokolün başlamasından önce 24 saat boyunca oruç tuttu. Sistem suyu, su tesisindeki zebra balığı muhafaza tanklarındaki suyu ifade eder.
1. Hazırlık ve anestezi
- Sistem suyunda %0,016 Trikain çözeltisi hazırlayın.
DİkKAT: Trikain gözlere, cilde veya solunum yollarına temas ederse tahriş edicidir. - Diseksiyon protokolü sırasında uyuşturulma zebra balıklarını tutmak için bir sünger hazırlayın. Tam bir süngeri çeyrekliklere kesin. Jilet kullanarak, sünger çeyreğinin uzun eksenine paralel çalışan ince bir sünger kamasını çıkarın.
- Yarık yetişkin bir balığı barındıracak kadar uzun olmalıdır (bu farklı balık boyutları arasında değişecektir). Örneğin, 35 mm uzunluğundaki yetişkin bir balık için yarık uzunluğu 20 mm olmalıdır. Baş ve vücut süngerde sıkıca tutulur, ancak kuyruk süngerin kenarından geçer (Şekil 1B).
- Süngeri% 0.016 Tricaine çözeltisinde bekletin.
- Yetişkin zebra balıklarını (erkek veya dişi) % 0.016 Trikain çözeltisinin 625 mL'sine yerleştirin.
- 6 dakika boyunca veya balık dokunmaya tepkisiz olana kadar kuluçkaya yatırın.
- Yaban arılarını kullanarak, balıkları Tricaine tankından dikkatlice çıkarın ve balık ventral tarafını süngerin oluğuna yerleştirin (Şekil 1A - B).
- Süngeri yukarıdan aşağıya aydınlatmalı bir kesme mikroskobu altına yerleştirin.
2. Cerrahi
- İnce tokmaklar kullanarak, cildi çimdikleyin ve kalbe sadece arka olarak orta derecede ölçeklendirin (Şekil 1B).
- Yaylı makas kullanarak, vücut boşluğunda bir delik oluşturmak için önpslerin altında bir kesim yapın (Şekil 1C - D). Kalbi veya büyük bir kan damarını yaralamamaya dikkat edin, çünkü bu ölüm oranının artmasına neden olacaktır.
- Yaylı makas kullanarak, karın boyunca 3-4 mm'lik bir kesi yapın, kesi pelvik yüzgeçlere ulaşana kadar arka arkaya işleyin (Şekil 1D - E). Bu noktada, karaciğerin ventral lob kesi yoluyla görülebilir.
- Visseral organları vücut boşluğundan çıkarmak için süngerin kenarlarını bir elinizle sıkın. Karaciğerin ventral lobları bağırsağın üstünde görülebilir (Şekil 1F, 2A-B). Karaciğer, altın-kahverengi bağırsağın üzerine yayılmış pembe veya turuncu bir yapı olarak görünecektir. Sahte kontrol olarak belirlenen hayvanlar bu noktada kurtarılır.
- İnce kaleleri iki tine dokunarak olacak şekilde sıkın. Sünger üzerinde baskı tutarken, ince kümeslerin tinelerini karaciğer ve bağırsak arasına kaydırın (Şekil 1G). Bağırsakları delmemeye dikkat edin, çünkü bu ölüm oranının artmasına neden olacaktır.
- Tinelerin birbirlerinden uzaklaşması için esinler üzerindeki basıncı yavaşça gevşetin (Şekil 1H). Bu kayar etki, ventral lob ve bağırsak arasındaki çok sayıda portal damar ekini keser (Şekil 2B) ve ventral lobu temiz bir şekilde çıkarmak için gereklidir. Karaciğer ve bağırsak arasındaki tüm portal bağlantıları kopana kadar bu işlemi tekrarlayın.
- İnce önseçimler kullanarak bağırsak lobunun bağırsaktan geri soyun ve ventral lobun karaciğerin geri kalanından arındırın(Şekil 1I).
- Bu prosedür üçte bir kısmi hepatektomi ile sonuçlanır (Şekil 1J).
3. kurtarma
- Balıkları süngerden dikkatlice çıkarın ve bir sistem suyu tankına yerleştirin.
- Pipet sistemi, balık kendi kendine yüzene kadar birkaç dakika solungaçların üzerinde su sağlar (Şekil 1K).
- Balıkları sisteme geri yerleştirmeden önce 2-4 saat izleyin. Ameliyattan sonra balığı tam 24 saat beslemeyin.
- Deney süresince balıkları günlük olarak izleyin.
- Zamanla, vücut duvarındaki kesi dikişe gerek kalmadan doğal olarak iyileşir (Şekil 1L, 2C).
4. Ventral lobdan bağırsak uzunluğu analizine
- Tüm opera hareketleri sona erene kadar buzlu suda analize yönelik tüm hayvanları 10 dakika ötenazi yapın.
- Balıkları buzlu sudan çıkarın ve ventral tarafı bir süngerin oluğuna yerleştirin.
- Yaylı makas kullanarak, kalbin ön-arka konumundaki ventral vücut duvarında bir kesi yapın. Daha sonra ilk kesiden pelvik yüzgeçlere kadar ön-arka eksen boyunca uzanan iki kesi daha yapın. (Şekil 2A).
- Viseral organları ortaya çıkarmak için cildi ve kası soyun (Şekil 2A).
- Epifluoresans mikroskobu kullanarak viseral organların parlak alan ve floresan görüntülerini elde edin. Bu görüş alanı, ventral lobun reseksiyon edildiği alanı içerecektir. Hayvanlar analizden önce ötenaziye tabi olduğundan, bu tür bir analiz aynı balığın uzun süreli görüntülenmesini önler.
5. Karaciğerden vücut ağırlığına oran analizi
- Tüm opera hareketleri sona erene kadar buzlu suda analize yönelik tüm hayvanları 10 dakika ötenazi yapın.
- Balıkları 50 mL konik bir tüpe yerleştirin.
- 1x PBS'de %4 paraformaldehitin 25 mL'sini ve tüpe %0,3 Arasını ekleyin.
DİkKAT: Formaldehit toksiktir ve formaldehit içeren çözeltiler her zaman kimyasal bir başlıkta işlenmelidir. - 4 °C'de 48 saat fındık.
- 1x PBS ve %0,3 Ara ile dört 10 dakikalık yıkama gerçekleştirin.
- Balıkları tokslarla alın ve bir kağıt havlu üzerinde kurutun.
- Tüm balığın ağırlığını kaydedin.
- Yaylı makas kullanarak, kalbin ön-arka konumundaki ventral vücut duvarında bir kesi yapın. Daha sonra, ilk kesiden pelvik yüzgeçlere kadar ön-arka eksen boyunca uzanan iki kesi daha yapın. (Şekil 2A).
- Viseral organları ortaya çıkarmak için cildi ve kası soyun (Şekil 2A).
- Epifluoresans mikroskobu kullanarak karaciğerin parlak alan görüntülerini elde edin.
- Karaciğeri parçalara ayırın, karaciğer parçalarını bir tartım teknesine yerleştirin.
- Karaciğerin ağırlığını kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yetişkin zebra balığı karaciğerinin rejeneratif potansiyelini incelemek için yetişkin zebra balıklarında kısmi hepatektomi (PHX) yaptık. Genel olarak, 1,5-2,5 yaş arasında değişen büyük yetişkinler (30-40 mm uzunluğunda) seçildi. Bireysel deneylerde, hayvanlar aynı tanktan seçildi ve yaş ve boyutla eşleşti. Uygun bir kontrol olarak, hayvanın hem uyuşturulduğu hem de ventral vücut duvarında büyük bir kesi aldığı ancak herhangi bir doku çıkarılmadan kurtarıldığı sahte ameliyatlardan yararlandık. Sahte kontroller için hayatta kalma oranları hem erkek hem de dişi zebra balıkları için% 90-% 100 arasında değişmektedir. PHX hayvanları için sağkalım oranları erkek zebra balıkları için% 60-% 75 ve dişi zebra balıkları için% 60-90 arasında değişmektedir ve tüm ölümler ameliyattan sonraki ilk 24 saat içinde meydana gelmektedir.
PHX'i takiben karaciğerin iyileşmesini ölçmek için altın standart karaciğerden vücut ağırlığına oranı veya LBR'dir. Bu test hemmemeli 11 hem de zebra balığı modellerinde karaciğer kütlesi iyileşmesinin ölçümü için kullanılmıştır8. Karaciğerin ağırlığını güvenilir bir şekilde ölçmek için, daha önce açıklandığı gibi sabit hayvanlar üzerinde ağırlık ölçümleri yaptık8. Vahşi tip, yaralanmamış zebra balığı üzerinde LBR ölçümleri yaptık ve daha önce bildirildiği gibi8, dişi zebra balıklarının erkek zebra balıklarına kıyasla LBR'yi neredeyse iki katına (dişi zebra balığı için% 3.3 ve erkek zebra balığı için% 1.8) bulduğunu gördük (Şekil 3A). Her iki cinsiyetin yetişkin zebra balıklarında hem sham hem de PHX yaptık ve LBR'yi yaralanma sonrası 0 ve 7 günde analiz ettik (dpi) (Şekil 3B). 0 dpi'de, sham hayvanların açıkça görülebilen bir ventral lobları vardı, PHX hayvanlarında ise ventral lob tamamen yoktu (Şekil 3C). Özellikle, bu LBR'de önemli bir azalmaya neden oldu (erkek balıklarda% 30 azalma, dişi balıklarda% 20 azalma) (Şekil 3D). 7 dpi'de analiz edilen balık kohortunda, ventral lobun yenilenmediğini gördük (Şekil 3E) ve yine de PHX ve sham kontrollerinin LBR'si karşılaştırılabilirdi (Şekil 3F). Bu ölçümler, 7 dpi ile karaciğerin, muhtemelen sırt loblarındaki telafi edici rejenerasyon ile, önceki raporlara göre sham kontrollerine göre kütleyi geri kazandığını göstermektedir8,9.
Yeterli zaman verildiğinde karaciğerin ventral lobunun yenilenip yenilenemeyeceğini araştırmaya karar verdik. Yetişkin Tg (fabp10a:CFP-NTR) balıkları deney için seçildi, çünkü bu balıklar HEPAT'ı hepatositlerde eksprese ederek floresan mikroskopisi kullanarak karaciğerin görselleştirilmesine izin verdi. Bir grup hayvan, üçte bir kısmi hepatektomi protokolüne tabi tutuldu. Hayvanlar 1 veya 36 dpi olarak analiz edildi (Şekil 4A). Her hayvan için ventral lob uzunluğunun bağırsağa oranı ölçüldüğünde(Şekil 4B).
Sham ameliyatlarına maruz kalan hayvanlar bağırsak uzunluğunun% 50-100'ünü işgal eden belirgin bir ventral loba sahipken, üçte bir kısmi hepatektomiye maruz kalan hayvanların ventral lobları ciddi şekilde azaldı. Çarpıcı bir şekilde, 36 dpi'deki birçok kısmi hepatektomi hayvanı, 1 dpi'deki kısmi hepatektomi hayvanlarına kıyasla artmış bir ventral lobdan bağırsak oranına sahipti (Şekil 4C). Sham kontrollerinde ventral lobun boyutunda bir artış olmadı; ancak kısmi hepatektomiden iyileşme sonrasında ventral lobun boyutunda istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlenmiştir(Şekil 4D). Ameliyata yanıtta geniş bir varyasyon olduğunu, bazı hayvanların yenilenme göstermediğini ve diğerlerinin iyi tanımlanmış bir ventral lobu açıkça yenilediğini kaydettik (Şekil 4E). Bu sonuçlar, ventral lobun yetişkin zebra balıklarında cerrahi karaciğer rezeksiyonundan yenilenebildiğini göstermektedir. Birlikte ele alındığında, çalışmalarımız zebra balığı karaciğerinin hem epimorfik hem de telafi edici yenilenme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Kısmi hepatektomi protokolü. (A) Ön-arka ve dorsal-ventral eksenlerle yetişkin zebra balığının diyagramı. (B) Anesteziden sonra, bir hayvan bir süngere gömülür (mavi renkte gösterilir) böylece ventral tarafı yukarı olur. İnce tokmaklar, kalbin hemen arkasını çimdiklemek için kullanılır. Sünger, netlik için sonraki panellerde gösterilmez. (C) Makas, kalbin hemen arkasını kırmak için kullanılır. (D-E) Makas, şimdi açık olan yarada, pelvik yüzgeçlerden hemen önce sonlanarak ön taraftan arkalığa uzanan 3-4 mm'lik bir kesi yapmak için kullanılır. (F) Süngerin yanlarını sıkmak, viseral organların daha büyük yaradan çıkmasına neden olur. (G) Her iki tine de dokunan ince kümesler karaciğerin ventral lobu ile bağırsak arasında kayar. (H) Kümesler gevşer, karaciğer ve bağırsak arasındaki portal damar eklerini kırmalarına neden olur. Bu işlem ventral lobun uzunluğu boyunca tekrarlanır. (I-J) Ventral lob arka ucundan yukarı çekilirken, makas ventral lobun karaciğerin geri kalanından kesilmesi için kullanılır. (K) Hayvan, bilinci ve haklarının kendisini geri kazandığı sistem suyu ile bir geri kazanım odasına yerleştirilir. (L) Zamanla, vissera vücut boşluğuna geri çekilir ve yara iyileşir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Zebra balığı anatomisi ve kısmi hepatektomiden iyileşme. (A) Viseral organların analizi için hayvanlar ötenaziye tabi tutulmakta ve ventral tarafı bir süngerin üzerine yerleştirilir. İlk olarak kalbin ön-arka pozisyonunda (kırmızı çizgi) bir kesi yapılır. Daha sonra, ön-arka eksen boyunca pelvik yüzgeçlere (mavi çizgi) uzanan iki kesi oluşturulur. Daha sonra, cilt ve kaslar geri soyulur ve viseral organları ortaya çıkarır. Etiketlenmiş bağırsak, karaciğerin ventral lob ve o lobdaki merkezi damardır. (B) Viseral organların analizi için hazırlanmış bir zebra balığının ventral görünümünün canlı görüntüsü. Karaciğerin ventral lobunun noktalı beyaz bir çizgi ile özetlenmiştir. 2x görüntüdeki sarı kutu, 8x görüntünün konumunu gösterir. Beyaz ok uçları bağırsak ve karaciğer arasındaki portal damar bağlantılarını gösterir. (C) Belirtilen zaman noktalarında kısmi hepatektomi işlemi ile oluşan yaranın ventral görünümü. Zamanla kesi tamamen iyileşir. Ölçek çubukları, 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kısmi hepatektomi sonrası telafi edici rejenerasyon. (A) Yabani tip, yaralanmamış zebra balığı için karaciğerden vücut ağırlığına (LBR) oranlar ölçüldü. Dişi zebra balıkları, erkek zebra balıklarına kıyasla LBR'nin neredeyse iki katına sahiptir. Dişi hayvanlar, 0.0001'< wilcoxon rütbe toplamı testi kullanılarak erkek hayvanlarla karşılaştırıldı. (B) Bu deney için vahşi tip zebra balığı kullanıldığını gösteren şematik. Hayvanlar sham veya kısmi hepatektomiye (PHX) maruz kaldı ve daha sonra yaralanma sonrası 0 veya 7 günde sabitlendi (dpi). Sabit hayvanlar görüntülendi ve LBR ölçümlerine tabi tutuldu. (C,E) 0 dpi (C) ve 7 dpi (E) de sham veya PHX'e maruz kalan hayvanların temsili görüntüleri gösterilmiştir. PHX hayvanlarında ventral lobların tamamen yokluğuna dikkat edin. Tüm görüntüler için gösterilen, viseral organların ventral bir görünümüdür. Görüntüler parlak alan görüntüleridir. Karaciğerin ventral lob beyaz olarak özetlenmiştir. Ölçek çubukları, 500 μm. (D,F) 0 dpi (D) ve 7 dpi(F)sham ve PHX ameliyatlarından sonra hem erkek hem de dişi zebra balıkları için karaciğerin vücut ağırlığı oranlarına çubuk grafikleri. Çubuğun yüksekliği ortalama değerdir ve hata çubukları SEM'i temsil eder. Kısmi hepatektomi örnekleri Wilcoxon derece toplamı testi kullanılarak sham kontrolleri ile karşılaştırıldı, ns = anlamlı değil, *p < 0.05, **p < 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Zebra balığı kısmi hepatektomi sonrası ventral loblarını yenileyebilir. (A) Bu deney için Tg(fabp10a:CFP-NTR) kullanıldığını gösteren şematik. Belirtilen zaman noktalarında görüntüleme ile ameliyat ve analiz yapıldı. (B) Hayvanların nasıl analiz edildiğini göstermek için örnek bir görüntü. Hayvanlar, ventral lobun uzunluğu (kırmızı), bağırsağın uzunluğu (sarı) ve ventral lobun kapladığı bağırsak yüzdesi (beyaz) hesaplanarek ölçülebilir. (C) 1 ve 36 gün sonra sham veya kısmi hepatektomi (PHX) maruz kalan hayvanların temsili bir görüntüsüdür (dpi). (D) 1 ve 36 dpi'de sham veya kısmi hepatektomiye maruz kalan hayvanlar için ventral lob uzunluğunun bağırsak uzunluğuna oranının keman çizimleri. Her nokta tek bir balıktan gelen değeri temsil eder. Erkek balıklar için değerler mavi, dişi balıklar kırmızıdır. Kısmi hepatektomi örnekleri Wilcoxon derece toplamı testi kullanılarak sham kontrolleri ile karşılaştırıldı, ns = anlamlı değil, *p < 0.05. (E) Gösterilen, 36 dpi'de yenilenmeyen kısmi hepatektomi hayvanlarına ve yenilenmeyen iki örnektir. Tüm görüntüler için gösterilen, viseral organların ventral bir görünümüdür. Görüntüler, CFP floresan görüntüsü ile parlak alan görüntüsünün birleştirilmesidir. CFP floresan sadece karaciğerde bulunur. Karaciğerin ventral lob kırmızı ile özetlenmiştir. Ventral lobun kapladığı bağırsağın yüzdesi beyazdır. Ölçek çubukları, 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karaciğer yenilenmesi için zebra balığı ve memeli modelleri arasındaki anatomik farklılıklar karaciğer rezeksiyonu için benzersiz zorluklar ortaya koyuyor. Zebra balıklarındaki karaciğer kalbe ve bağırsaya yakındır; yanlışlıkla her iki organa da zarar vermek mortalitenin artmasına neden olur. Zebra balığı karaciğeri kapsüllenmemiştir, bu da bağırsaktan ayrılmasını zorlaştırır. Karaciğer, portal damarlardan bağırsaktan besin bakımından zengin kan alır. Memelilerde, bağırsaktan ayrılan damarlar, karaciğere girerken bölünen birincil portal damar üzerinde birleşir12. Buna karşılık, zebra balığı karaciğeri, doğrudan bağırsaktan karaciğere hareket eden bir dizi küçük damardan portal dolaşımını alır (Şekil 2B). Böylece, karaciğerin bağırsak üzerinde düzleştirilmiş her lob, bu damarlar tarafından bağırsağa güvenli bir şekilde bağlanır. Portal damarlarını kesmeden ventral lobu çıkarmaya çalışmak genellikle eksik rezeksiyona neden olabilir (veriler gösterilmez). İlk protokollerden bazıları, ventral lobun nispeten küçük bir kesiden dışarı çekilmesini açıklar, bu da bu portal eklerinin kesilmesine izin vermez5,6.
Burada açıklanan protokol, tutarlı ventral lobun çıkarılmasını sağlamak için bu zorlukları ele almak için tasarlanmıştır. Uyuşturulmuş zebra balıkları, işlem süresince solungaçlarını ıslak ve vücutlarını hareketsiz tutmak için sünger oluğuna sıkıca yerleştirilir. Cildin sadece kalbin arkasını sıkıştırmak, iç organların hiçbirine zarar vermeden cilde bir kesi yerleştirmeyi mümkün kılar. Büyük (3-4 mm) bir kesi açmak karaciğerin çıkarılmasını ve çıkarılma derecesinin değerlendirilmesini kolaylaştırır (Şekil 2C). Daha da önemlisi, zebra balıkları herhangi bir birincil yara kapanması olmadan bu büyüklükteki bir yaradan iyileşebilir ve nihayetinde iyileştirebilir. Süngeri sıkarak ve vücut duvarını sıkıştırarak, viseral organlar daha erişilebilir hale gelir ve bir tokmakların tonlarını karaciğer ve bağırsak arasına kaydırmak mümkündür. Daha sonra kümesler karaciğer ve bağırsak arasındaki portal bağlantılarını kesmek için kullanılabilir. Bu sağlandıktan sonra, ince tokmaklar ventral lobun geri kabuğunu soymak için kullanılabilir, böylece karaciğerin geri kalanından ayrılabilir.
Sham ve PHX ameliyatlarına tabi tutulan hayvanların karaciğer ile vücut ağırlığı oranlarını (LBR) ölçtük. 7 dpi ile PHX hayvanlarının LBR'lerinin kontrollerle karşılaştırılabilir olduğunu gördük (Şekil 3F). Ventral lobun bu noktada yenilenmediği göz önüne alındığında (Şekil 3E), rejenerasyonun sırt loblarında kompanzasyon yoluyla gerçekleştiği sonucuna vardık. Ventral lobun zebra balıklarında nihayetinde yenilenip yenilenemeyeceği sorusunu ele almak için PHX yaptık ve karaciğerin yeniden büyümesini inceledik. Ortalama olarak, ventral lobun uzunluğunun bağırsağa oranı 36 dpi'de 1 dpi'den daha yüksekti, bu da ventral lobun yenilenmesini gösteriyordu (Şekil 4C-D). Yaralanmalara hayvan tepkisinde geniş bir çeşitlilik vardır, bazı hayvanlar çok az büyüme yaşar ve diğerleri ventral lobun önemli ölçüde iyileşmesini yaşar (Şekil 4E). Karaciğerin, farklı zaman ölçeklerinde de olsa, ventral lobun epimorfik yenilenmesi ve sırt loblarında telafi edici rejenerasyon karışımı ile yenilenebildiği sonucuna varıyoruz. Önceki çalışmalarda, rezeksiyondan sonra 5 , 7 ,9ve sinyal yolları6,8 ,10'un bireysel genlerin rolünü test etmek için kısmi hepatektomiler kullanıldığından, bu protokolün yetişkin bir omurgalıda karaciğer yenilenmesinin moleküler ve hücresel mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı ilerleteceğini öngörüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
I.M.O. NIAAA (F32AA027135) tarafından desteklenir. W.G., R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 ve Claudia Adams Barr Kanser Araştırmalarında Mükemmellik Programı tarafından desteklenmektedir. W.G. Biyomedikal Bilimler alanında bir Pew Bursiyeridir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K.
- Grisham, J. W.
