Analyse des modèles de motilité du stentor pendant et après la régénération de l’appareil buccal à l’aide du suivi cellulaire

Summary

Nous présentons un protocole pour la caractérisation de la motilité et du comportement d’une population de cellules de taille cent microns à millimètres en utilisant la microscopie à fond clair et le suivi cellulaire. Ce test révèle que Stentor coeruleus passe par quatre phases comportementalement distinctes lors de la régénération d’un appareil buccal perdu.

Abstract

Stentor coeruleus est un organisme modèle bien connu pour l’étude de la régénération unicellulaire. L’analyse transcriptomique de cellules individuelles a révélé des centaines de gènes – dont beaucoup ne sont pas associés à l’appareil buccal (OA) – qui sont régulés différemment par phases tout au long du processus de régénération. On a émis l’hypothèse que cette réorganisation systémique et cette mobilisation des ressources cellulaires vers la croissance d’une nouvelle arthrose entraîneront des changements observables dans le mouvement et le comportement correspondant dans le temps aux phases d’expression différentielle des gènes. Cependant, la complexité morphologique de S. coeruleus a nécessité le développement d’un test pour capturer les statistiques et l’échelle de temps. Un script personnalisé a été utilisé pour suivre les cellules dans de courtes vidéos, et des statistiques ont été compilées sur une grande population (N ~ 100). Lors de la perte de l’OA, S. coeruleus perd initialement la capacité de mouvement dirigé; puis à partir de ~4 h, il présente une baisse significative de vitesse jusqu’à ~8 h. Ce test fournit un outil utile pour le dépistage des phénotypes de motilité et peut être adapté pour l’étude d’autres organismes.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) est un organisme modèle bien connu qui a été utilisé pour étudier la régénération unicellulaire en raison de sa grande taille, de sa capacité à résister à plusieurs techniques microchirurgicales et de sa facilité de culture en laboratoire ^1,2,3. Les premières études de régénération se sont concentrées sur la caractéristique la plus importante et la plus morphologiquement distincte de Stentor – l’ARTH – qui est complètement éliminée lors ^{d’un choc chimique 4,5,6}. Le remplacement de novo d’une arthrose perdue commence par l’émergence d’une nouvelle bande membranellelle, un ensemble de cils qui se déplacent progressivement vers l’avant de la cellule avant de former une arthrose fonctionnelle au cours de huit stades morphologiques³. Ces étapes ont été observées séquentiellement, quelle que soit la température, et constituent un point de référence universel pour presque toutes les études⁵.

L’analyse mécaniste de la régénération stentor nécessite des outils de mesure du moment de la régénération qui sont suffisamment robustes et simples pour être appliqués à plusieurs échantillons dans le cadre d’un criblage chimique ou moléculaire. La méthode standard pour effectuer un test cellulaire est l’imagerie, dans ce cas, l’imagerie de la formation d’une nouvelle arthrose pendant la régénération. Cependant, de tels tests basés sur l’imagerie sont plus efficaces lorsque la structure régénérante contient des composants moléculaires distincts qui peuvent être utilisés comme marqueurs, de sorte qu’ils seraient facilement détectés dans une image de fluorescence. Dans le cas du Stentor OA, les composants connus (cils, corps basaux) sont également présents sur le reste de la surface cellulaire ; par conséquent, la reconnaissance de la restauration de l’accès ouvert ne peut être obtenue simplement en recherchant la présence ou l’absence d’un composant.

Au contraire, une certaine forme de reconnaissance de forme serait nécessaire pour détecter une arthrose, ce qui est potentiellement très difficile étant donné que les cellules Stentor changent souvent de forme via un processus contractile rapide. Cet article présente un test alternatif pour la régénération qui repose sur l’activité mobile du corps et des cils OA. Au fur et à mesure que l’arthrose se régénère, les cils nouvellement formés subissent des changements reproductibles de position et d’activité, ce qui affecte la motilité de nage de la cellule. En analysant la motilité, il est possible d’effectuer un test de « régénération fonctionnelle » qui quantifie la régénération en quantifiant la fonction des structures régénérées. L’analyse antérieure de la fonction ciliaire de Stentor pendant la régénération utilisait la vélocimétrie d’image de particules, combinée à des billes traceuses ajoutées au milieu externe, pour observer les changements dans le schéma d’écoulement à différents stades de la régénération⁷; cependant, cette approche nécessite une imagerie laborieuse des cellules individuelles et de leurs champs d’écoulement associés, une à la fois.

En utilisant le mouvement de la cellule elle-même comme proxy pour le flux généré par les cils, il serait possible d’analyser un plus grand nombre de cellules en parallèle, en utilisant des systèmes d’imagerie à basse résolution compatibles avec les plates-formes de criblage à haut débit. Ce test peut, en principe, être utilisé pour étudier le développement et la régénération fonctionnelle chez d’autres organismes nageurs à l’échelle des centaines de microns à millimètres. La section 1 du protocole décrit la construction d’une lame d’échantillon multipuits, qui permet l’imagerie à haut débit d’une population de cellules sur une journée entière. Des détails sont fournis sur la façon de s’ajuster pour une utilisation avec d’autres types de cellules. La section 2 du protocole couvre l’acquisition de données vidéo pour ce test, qui peut être réalisée sur un microscope à dissection avec un appareil photo reflex numérique à objectif unique. La section 3 du protocole fournit une procédure pas à pas du suivi des cellules et du calcul de la vitesse des cellules à l’aide du code MATLAB (informations supplémentaires). La section 4 du protocole explique comment transformer les résultats numériques en graphiques, comme le montrent les figures 1C-F et 2C pour faciliter l’interprétation des résultats.

Protocol

NOTE: Une population d’environ cent cellules de S. coeruleus a été cultivée conformément à un protocole JoVE⁸ publié précédemment.

1. Préparation de l’échantillon

1. Coupez un morceau de feuille d’espacement en silicone de 250 μm d’épaisseur (table des matériaux) légèrement plus petit en hauteur et en largeur qu’une lame de microscope. À l’aide d’un poinçon de trou de 5/16 », créez des puits circulaires. Veillez à laisser suffisamment d’espace entre les puits voisins pour assurer une bonne étanchéité.
   NOTE : Un espace de 3 mm entre les puits voisins s’est avéré suffisant. Avec de la pratique, dix puits peuvent être placés sur une seule lame d’échantillon.
2. Initier la régénération de l’arthrose en incubant les cellules dans 10 % de saccharose ou 2 % d’urée pendant 2 min (Figure 1A). Ensuite, laver trois fois avec du milieu frais⁸. Pipettez doucement environ dix Stentor dans chaque puits. Veillez à ce que le volume de l’échantillon corresponde le plus possible au volume du puits.
   REMARQUE : Pour les dimensions de puits utilisées ici, 12,5 μL d’échantillon ont été pipetés dans chaque puits.
3. Fermez les puits en abaissant doucement un morceau de verre de couverture (voir Tableau des matériaux) sur les puits à partir d’un bord. Utilisez un objet étroit et légèrement flexible, tel qu’une pointe de pipette de 10 μL, pour appuyer sur le verre de couverture à l’endroit où il entre en contact avec la feuille de silicone, afin d’assurer une bonne étanchéité.

2. Time-lapse de microscopie à lumière visible

1. Placez l’échantillon sur la scène du microscope et réglez le grossissement au plus bas disponible de sorte que l’un d’eux tienne bien dans le cadre dans son intégralité.
   REMARQUE: Un adaptateur de caméra 1,6x et un grossissement 1x sur l’objectif ont été utilisés sur le microscope pour ce protocole.
2. Commencez le time-lapse. Acquérir une vidéo de 10 s à 30 images par seconde de chaque puits à chaque point temporel. Si vous utilisez une configuration de microscope avec un étage X-Y motorisé, automatisez l’ensemble du time-lapse. Sinon, assurez-vous qu’un utilisateur est présent à chaque point temporel pour traduire manuellement l’échantillon afin d’enregistrer chaque puits.
   REMARQUE: Évitez de laisser l’échantillon éclairé lorsque vous n’imaginez pas pour éviter le chauffage et l’évaporation. Les volumes d’échantillons sont faibles et l’évaporation entraînera des bulles d’air.
3. Enregistrez les films au format TIFF, MOV ou AVI.
   REMARQUE: Ce sont les types de fichiers vidéo non propriétaires les plus courants. Selon le logiciel de microscope spécifique, les vidéos peuvent être enregistrées par défaut dans un type de fichier propriétaire, mais peuvent ensuite être exportées vers l’un des types de fichiers susmentionnés.
4. Utilisez un facteur de conversion pixel-millimètre pour l’échelle physique et effectuez un étalonnage ou utilisez la taille de pixel connue de la caméra utilisée. Pour calibrer, obtenez une image claire d’une diapositive d’étalonnage ou d’une règle claire avec les mêmes paramètres de grossissement que les vidéos. À l’aide de n’importe quel programme de visualisation d’images, comptez le nombre de pixels entre les marques d’une distance physique connue.
   REMARQUE: Par exemple, si l’image d’une règle montre la marque de 1 mm et la marque de 2 mm à séparer par 100 pixels, le facteur de conversion est de 1 mm pour 100 pixels. Alternativement, pour dériver ce facteur de la taille des pixels de l’appareil photo, il suffit de multiplier la taille du pixel de l’appareil photo par le grossissement. Par exemple, si l’appareil photo utilisé a 3,45 μm de pixels et que le grossissement utilisé était de 1,6x, la conversion est de 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm par 1 pixel.

3. Suivi des cellules

1. Téléchargez les deux scripts, TrackCells.m et CleanTraces.m, dans un emplacement facile à retenir sur l’ordinateur. Si les vidéos de données ne sont pas déjà sur cet ordinateur, transférez-les sur cet ordinateur.
   REMARQUE : Les vidéos de données et les scripts n’ont pas besoin d’être dans le même dossier.
2. Organisez les vidéos de données dans des dossiers, un pour chaque point temporel. Utilisez d’abord le script TrackCells.m pour effectuer un suivi automatisé des cellules dans les vidéos de données. Ouvrez TrackCells.m et exécutez le script.
3. Choisissez Ajouter au chemin d’accès si une fenêtre contextuelle vous y invite, ce qui ne se produit généralement que lorsque le script est exécuté pour la première fois à partir d’un dossier donné. Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez une ou plusieurs vidéos de données pour lancer le suivi, accédez aux vidéos de données (section 2). Sélectionnez plusieurs fichiers vidéo à l’aide d’un clic tout en maintenant la touche Maj enfoncée, en maintenant la touche Ctrl enfoncée ou en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé tout en déplaçant les fichiers pour les mettre en surbrillance.
4. Une fois satisfait de la liste des fichiers dans la case Nom de fichier: en bas de la fenêtre d’invite, cliquez sur Ouvrir. Effectuez d’abord un test sur une vidéo pour confirmer que tous les paramètres sont correctement définis (voir la discussion ci-dessous).
   REMARQUE: Ce script va maintenant créer un dossier pour chaque fichier vidéo choisi. Il écrira ensuite dans ce dossier chaque image de la vidéo sous forme de fichier .jpg et un fichier nommé position_estimates.mat, qui contient toutes les traces trouvées dans la vidéo. Selon la taille des vidéos, le nombre de vidéos et la vitesse de l’ordinateur, l’exécution de ce script peut prendre des heures.

4. Vérification des traces

1. Vérifiez que les étapes décrites à la section 3 ont été suivies correctement en vérifiant qu’il n’y a pas de messages d’erreur avant de continuer. Utilisez le script CleanTraces.m pour rejeter manuellement les traces anormales ou fausses. Ouvrez CleanTraces.m dans la fenêtre de l’éditeur MATLAB en double-cliquant sur le fichier.
2. À l’invite , sélectionnez la sortie du dossier de données par TrackCells.m. Il aura le même nom que le fichier vidéo, accédez à l’un des dossiers créés comme décrit dans la section 3. Choisissez un seul dossier.
   REMARQUE : Ce script affichera désormais les traces une par une dans une fenêtre contextuelle. Ils sont superposés sur l’image de la vidéo où commence la trace, en vert, et sur l’image de la vidéo où la trace se termine, en magenta. Par conséquent, une trace valide devrait lier une cellule verte et une cellule magenta.
3. Lorsque vous y êtes invité, entrez 1 pour conserver la trace et 0 pour rejeter la trace. Appuyez sur Entrée pour passer à la trace suivante.
   REMARQUE : Les nouvelles traces continueront de s’afficher jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de traces ou que les soixante premières aient été affichées. Une fois ce processus terminé, le script crée automatiquement un dossier nommé CLEAN TRACES pour enregistrer les sorties et affiche toutes les traces restantes au-dessus de la première image de la vidéo (Figure 1B). Cette image est automatiquement enregistrée en tant que LabeledTraces.png pour référence ultérieure. Toutes les traces que l’utilisateur avait choisi de conserver seront enregistrées dans le fichier clean_traces.mat.
4. Terminez cette étape pour toutes les vidéos en un seul point temporel avant de continuer.
   NOTE: Pour les données de ce manuscrit, une vidéo a été acquise pour chaque puits à chaque point temporel, pour un total de dix vidéos par point temporel.

5. Visualisation des données

REMARQUE : Pour comparer visuellement la motilité de l’ensemble de la population cellulaire à différents points temporels, toutes les traces de la section 4 ont été traduites pour commencer à l’origine et créer un déplacement radial par rapport au diagramme temporel pour chaque point temporel (Figure 1C-F, voir la figure supplémentaire S1 pour tous les points temporels).

1. Commencez par télécharger le script intitulé SpaghettiPlots.m. Ouvrez et exécutez le script. Lorsqu’une fenêtre de navigateur de fichiers s’affiche avec l’invite Sélectionner le dossier temporel contenant les données de puits (clean_traces.mat) à représenter graphiquement, accédez au dossier de l’un des points temporels. Notez que ce dossier doit contenir un dossier pour chacune des vidéos analysées.
2. Lorsque vous êtes invité à Calibration : Quel est le nombre de pixels par millimètre ?, tapez la valeur d’étalonnage trouvée à l’étape 2.4, puis appuyez sur Entrée.
   REMARQUE: Le script va maintenant combiner les traces de toutes les vidéos analysées à ce point temporel en un seul tracé (Figure 1C-F). De faibles cercles pointillés dans le tracé indiquent des déplacements radiaux de 1, 2, 3 et 4 mm.
3. Ajustez les axes du tracé si nécessaire en modifiant la ligne 55 du script, qui par défaut, est définie sur rr = 4 pour inclure un rayon allant jusqu’à 4 mm. Enregistrez le tracé.

Representative Results

L’objectif de ce test est de quantifier le changement progressif des schémas de mouvement et l’augmentation progressive de la vitesse de mouvement des cellules au sein d’une grande population de stentors régénérants (N ~ 100). Pour faciliter l’interprétation des résultats, le code personnalisé inclus dans ce protocole génère deux types de tracés : une superposition de toutes les traces de mouvement des cellules dans un ensemble de données vidéo (Figure 1C-F et Figure S1) et un tracé de la vitesse de nage par heure depuis le début de la régénération (Figure 2C). Une population de Stentor, qui se régénère normalement, devrait démontrer une transition régulière de la natation sans direction à la nage dirigée (Figure 1G). Bien que chaque cellule subisse cette transition dans son intégralité au cours du processus de régénération de l’arthrose s’étendant sur environ 8 h, la variation entre les individus nécessite d’examiner le mouvement d’une grande population dans son ensemble pour que les tendances deviennent claires.

La figure 1C-F montre la motilité collective d’une même population de cellules Stentor à 2, 3, 7 et 8 h dans le processus de régénération de l’arthrose. Ces graphiques montrent à la fois l’augmentation attendue du nombre d’individus mobiles (nombre de traces visibles) et l’augmentation par quatre de l’aire de répartition des cellules les plus mobiles au sein de la population (déplacement radial). Il est important de noter que les axes sont différents entre les différents panneaux de la figure 1C-F, avec 1 mm (heure 2), 2 mm (heures 3 et 7) et 4 mm (heure 8) choisis comme les plus appropriés pour mettre en valeur le mouvement. À 2 h, le premier point temporel, aucune cellule ne se déplace de plus de 1 mm pendant la vidéo de 10 s, alors qu’à 9 h, de nombreuses cellules ont parcouru plus de 5 mm pendant la même durée. La figure supplémentaire S1 fournit ces graphiques pour le time-lapse complet, avec des axes identiques utilisés sur tous les graphiques pour donner une vue plus claire de l’augmentation attendue de la motilité dans une expérience réussie.

Il y a une mise en garde à l’interprétation de cette série d’exemples de graphiques. Les cellules de natation les plus rapides ont pu traverser le puits dans la vidéo, surtout si (par hasard) elles ont commencé près du bord; ainsi, ils sont empêchés de nager entièrement en ligne droite, et leur amplitude de mouvement, telle que visualisée de cette façon, apparaîtra plus petite. Bien que cela complique toute tentative de quantifier la distance parcourue par les cellules, cela ne modifie pas la tendance qualitative selon laquelle l’amplitude des mouvements augmente sur au moins 8 h. Ceci est conforme à la chronologie connue de la régénération morphologique (Figure 2A)³.

Pour compiler les statistiques de population, les cellules suivies ont été classées en trois catégories distinctes : non mobiles sans retenue visible, non mobiles avec retenue visible et mobiles. Ces catégories de comportement ont déjà été définies par Tartar, mais n’ont jamais été quantifiées pour leur prévalence au cours du temps³. La figure 2B montre un histogramme empilé résumant le nombre relatif de cellules dans ces catégories en fonction des heures de régénération. À tout moment, plus de la moitié de la population cellulaire n’était pas visiblement mobile. De plus, plus tard, un nombre important de cellules ont été trouvées dans des colonies avec des dispositifs de retenue visibles, ce qui suggère fortement qu’elles avaient exploré l’environnement et s’étaient attachées de préférence près d’autres de leur espèce. Un exemple de ceci peut être vu dans l’encart final de la figure 2C.

Ce test permet une comparaison statistique des vitesses de nage au cours de chaque phase de récupération de la motilité. La moyenne et l’écart-type des données présentées à la figure 2C sont résumés ci-dessous (tableau 1). Une fois que ces quantités statistiques ont été extraites par suivi cellulaire, le mouvement présenté par la population de cellules dans les différentes phases peut être rigoureusement comparé à l’aide du test t non apparié. À titre d’exemple concret, pour les données présentées, la statistique t comparant les vitesses de nage dans la phase 1 et la phase 2 est calculée par:

où x₁ et x₂ désignent la vitesse moyenne pendant les phases 1 et 2, respectivement; s₁ et s₂ désignent les écarts-types de la vitesse au cours des phases 1 et 2, respectivement; n₁ et n₂ et désignent le nombre de traces extraites au cours des phases 1 et 2, respectivement. La statistique t t₁₂ résultante peut ensuite être traduite en une valeur de p pour le test d’hypothèse. Pour les données présentées à la figure 2C, les transitions de la phase 1 à la phase 2 (p < 0,1 %) et de la phase 2 à la phase 3 (p < 0,1 %) sont statistiquement significatives, alors que la transition de la phase 3 à la phase 4 (p > 20 %) ne l’est pas. Il est important de noter que la tendance des cellules à s’installer en petites colonies au cours de la phase 4 (Figure 2B, encadré), comme le montrent les vidéos brutes, est un exemple de différence comportementale qui n’est pas bien capturée par la mesure des vitesses de nage seule. Cela explique l’écart-type important mesuré au cours de la phase 4 (0,26 mm/s), ce qui, à son tour, a contribué à une statistique t plus faible en la comparant à la phase 3.

Figure 1 : Le suivi cellulaire révèle une récupération progressive de la nage dirigée. (A) Le choc saccharose induit Stentor coeruleus à se débarrasser de la bande membranellaire. (B) Exemple de suivi du résultat de la régénération de cellules dans une vidéo de 10 s avec des cercles rayés indiquant des bulles d’air dans le puits. (C-F) Superposition de toutes les trajectoires à 2 h, 3 h, 7 h et 8 h. Les heures ont été arrondies à l’heure la plus proche lors de la compilation des données. Les cercles pointillés indiquent des déplacements radiaux d’un millimètre. (G) La motilité cellulaire évolue de la nage sans direction caractérisée par de courtes trajectoires circulaires à la nage dirigée caractérisée par de longues trajectoires sinusoïdales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : La sous-population mobile illustre quatre phases distinctes de comportement par régénération de l’arthrose. (A) Morphologie de la régénération du stentor. (B) Comptage normalisé des cellules à chaque fois qui n’étaient pas (bleues) mobiles, sans retenue visible; (orange) non mobile, avec une retenue visible; (vert) mobile. Plusieurs ensembles de données couvrant différents sous-ensembles d’heures ont été combinés pour cette figure, de sorte que le nombre total de cellules par heure variait de 57 à plus de 376. La légende montre les cellules représentatives sous chaque catégorie telles que visualisées par fausse couleur, en magenta et en vert. (C) Boxplot de la vitesse de nage; les cases s’étendent des valeurs du quartile Q1 au Q3 à chaque fois avec la valeur médiane indiquée en vert. Les superpositions de dispersion sont la vitesse moyenne de chaque cellule mobile. L’encadré montre le comportement représentatif de la population au cours de chacune des quatre phases. Abréviations: OA = appareil buccal; Q1 = premier quartile; Q3 = troisième quartile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : L’analyse de la motilité en tant qu’outil de dépistage du phénotype nécessite un grand nombre de cellules. (A, B) Résultats du suivi de deux puits à 12 h. (C, D) Résultats du suivi des deux mêmes puits à 18 h. Les cellules de stentor ont la préférence de s’attacher en grappes, certains puits s’installant dans les colonies des heures plus tôt que d’autres. Les zones rayées indiquent des bulles d’air dans le puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

	Moyenne (mm/s)	Écart-type (mm/s)
Phase 1	0.14	0.24
Phase 2	0.06	0.13
Phase 3	0.16	0.16
Phase 4	0.15	0.26

Tableau 1 : Comparaison des vitesses de nage au cours de chaque phase de récupération de la motilité.

Figure supplémentaire S1 : Habitudes de nage de la population grâce à la régénération et au-delà. (A-M) Mouvement des cellules Stentor coeruleus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 et 18 h, respectivement, après l’initiation de la régénération de l’appareil buccal. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéos supplémentaires 1-3: Exemples de vidéos de microscopie de S. coeruleus pour le débogage de script. La section 5 du protocole peut être effectuée sur cet ensemble de trois vidéos de données pour une confirmation rapide que les scripts s’exécutent correctement. En outre, ces vidéos fournissent un exemple concret des exigences de contraste et de résolution pour les vidéos de données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichiers supplémentaires : Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

De nombreux algorithmes de suivi des particules et des cellules existent actuellement, certains entièrement gratuits. Le coût et la convivialité sont souvent des compromis qui nécessitent des compromis. De plus, de nombreux programmes de suivi cellulaire existants sont conçus pour suivre le mouvement lent des cellules de culture tissulaire, plutôt que le mouvement de nage rapide de Stentor, qui tourne pendant la natation et peut subir des changements soudains de direction. Après avoir testé bon nombre de ces options, le protocole présenté ici se veut une solution unique pour aller de l’acquisition de données à la visualisation de données en utilisant uniquement un équipement à faible coût et un seul progiciel scientifique (Table of Materials). Ceci est particulièrement intéressant pour les laboratoires de recherche dans les établissements axés sur l’enseignement ou les laboratoires d’enseignement de biophysique où la plupart de l’équipement nécessaire est déjà disponible, car cela réduit l’obstacle pour les étudiants de poser leurs propres questions et d’arriver à des résultats quantitatifs dans un court laps de temps.

La méthode présentée dans ce manuscrit peut être adaptée pour caractériser quantitativement la motilité d’une population d’organismes à l’échelle de cent microns à millimètres. L’application à des organismes plus petits ou plus grands nécessitera des changements dans la façon dont les données vidéo doivent être acquises. Appliqué ici à une population de S. coeruleus en régénération, ce protocole a donné une chronologie de la récupération fonctionnelle de la motilité dans la population cellulaire, qui complète ce que l’on sait actuellement sur la chronologie transcriptionnelle. Par exemple, on sait par séquençage de l’ARN que la synthèse des gènes codant pour les protéines de motilité ciliaire n’a lieu que plusieurs heures après le début du processus de régénération, longtemps après la formation des cils eux-mêmes ^9,10. La baisse statistiquement significative de la motilité des heures 0-3 (phase 1) à l’heure 4 (phase 2) démontrée ci-dessus est cohérente avec ce décalage dans l’expression des facteurs de motilité ciliaire par rapport à l’expression des gènes impliqués dans l’assemblage ciliaire. Aucune étude transcriptomique de la régénération du stentor à ce jour n’avait été réalisée au-delà de la neuvième heure, de sorte que l’on sait peu de choses sur l’activité génomique. L’absence de différence statistiquement significative entre les heures 8-10 (phase 3) et les heures 11+ (phase 4) suggère que les cellules se sont complètement régénérées à ce moment-là, et que peu de gènes pertinents pour la motilité cellulaire devraient être régulés différemment au-delà de l’heure 9.

Deux limites majeures à cette méthode sont son incapacité à suivre les cellules groupées et / ou touchantes, et son incapacité à quantifier des aspects plus complexes du mouvement que les vitesses ou les trajectoires de nage. Tous les algorithmes de suivi des particules/cellules ont de la difficulté à suivre les cellules qui sont temporairement obstruées visuellement par une autre cellule, et lorsque plusieurs cellules passent plusieurs images à proximité; le script inclus ici n’est pas une exception. Heureusement, la fréquence de la première peut être efficacement réduite simplement en limitant le nombre de cellules placées à l’intérieur d’un puits comme discuté dans le paragraphe suivant. Spécifiquement pour la population de S. coeruleus étudiée ici, leur préférence pour s’installer en colonies (Figure 3) a fait que certaines de ces cellules n’ont pas été identifiées par l’écriture. Cependant, comme toutes ces cellules présentent peu ou pas de mouvement, les statistiques sur la population de cellules mobiles ne sont pas affectées. De plus, les vidéos où plusieurs cellules échappent au suivi sont faciles à identifier et exclues manuellement d’une analyse plus approfondie. En ce qui concerne la quantification des aspects complexes du mouvement, le passage de la nage sans direction à la nage dirigée observée dans la figure supplémentaire S1 suggère des changements quantitatifs dans la corrélation temporelle de la direction, de l’accélération moyenne et potentiellement d’autres mesurables. La vitesse et la portée, les seules grandeurs analysées dans ce protocole, ne représentent qu’un petit aspect du mouvement.

Enfin, quelques parties du protocole revêtent une importance ou une conséquence particulière dans la pratique. L’assemblage des lames d’échantillons multipuits avec de fines feuilles de silicone, comme décrit dans la section 1 du protocole, nécessite de la pratique. Il est facile d’introduire des fuites ou des bulles d’air dans au moins un puits tout en scellant l’échantillon avec le verre de couverture. Les puits peuvent être divisés sur plusieurs lames d’échantillon pour permettre l’utilisation de verre de couverture plus petit, ce qui facilitera le processus (et les erreurs moins coûteuses). Bien que le test présenté ici puisse être utilisé pour caractériser les modèles de motilité d’une population cellulaire à un seul point temporel, il est démontré ici comme un outil pour comparer les modèles de motilité d’une seule population sur une longue période (plus de 10 h). Comme pour tout long time-lapse, l’évaporation d’un échantillon humide est inévitable. L’évaporation peut être minimisée par un joint sécurisé de l’entretoise en silicone dans la chambre d’imagerie à la fois à la glissière de verre et au couvercle. Si vous ne le faites pas, des puits s’infiltreront les uns dans les autres ou des bulles d’air se formeront à l’intérieur des puits. Pour les chercheurs qui ne sont pas familiers avec l’utilisation d’entretoises en silicone, l’eau de source pasteurisée ou tout autre milieu propre doit être pipeté dans chaque puits pour tester les fuites avant utilisation. Les dimensions des puits d’échantillonnage ont toutes été choisies pour bien fonctionner pour S. coeruleus, qui mesurent environ 1 mm. Cela comprend l’épaisseur de l’entretoise en silicone (choisie pour contraindre les cellules de S. coeruleus étudiées à un plan bidimensionnel), un diamètre de 5/16 " et 10 cellules par puits. Ces chiffres doivent être ajustés lors de l’adaptation de ce protocole à d’autres types de cellules.

Plusieurs paramètres du script TrackCells.m peuvent être modifiés pour optimiser l’identification automatique des cellules et la validation des traces. Les paramètres MinCellArea et MaxCellArea (lignes 15 et 16 du script) permettent à l’utilisateur de définir la plage de tailles acceptable pour une cellule en pixels carrés. Les meilleures valeurs dépendent de nombreux détails de l’expérience, notamment la taille des cellules, la taille des pixels de l’appareil photo, le grossissement et s’il existe des objets qui pourraient être identifiés à tort comme des cellules, par exemple des bulles d’air. Les valeurs par défaut de 300 et 1500 étaient optimales pour l’équipement exact et les paramètres fournis dans le protocole. Une fois MinCellArea et MaxCellArea optimisés, réglez le paramètre Threshold (ligne 17) pour modifier le contraste de l’image. Lorsqu’ils sont mal définis, les contours de la cellule seront mal identifiés ou complètement manqués, ce qui entravera le suivi correct. Si aucune valeur de Seuil ne fonctionne bien pour un suivi correct, essayez avec une vidéo avec un contraste plus élevé ou plus au point. La ligne 218 du script, bad_trks = find(strk_trks > 20); est responsable de l’élimination des traces qui s’écartent trop souvent du mouvement prédit (via le filtre de Kalman). En l’état, le script a ce seuil pour trop de personnes fixé à 20. Réduisez cette valeur entière jusqu’à 1 pour éliminer les traces de manière plus agressive. Augmentez la valeur pour jeter moins agressivement. Une grande partie de TrackCells.m a été adoptée à partir du didacticiel de suivi multi-objets librement accessible à http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html, auquel le lecteur pourrait se référer pour plus de détails. Les vidéos supplémentaires 1 à 3 sont des exemples de vidéos de données pour un test des scripts.

La capacité de S. coeruleus à régénérer complètement une arthrose perdue a été observée pour la première fois il y a plus d’un siècle, mais de nombreuses questions restent en suspens concernant la récupération de la motilité et des états comportementaux. Le protocole présenté ici vise à démystifier la combinaison de l’imagerie en champ clair, de l’identification et du suivi automatisés des cellules et de la visualisation des données que les auteurs ont utilisées pour caractériser quantitativement la motilité d’une population de stentors régénérants. Ce flux de travail est largement applicable à l’étude de la motilité en général, et les scripts et le protocole inclus peuvent être facilement adoptés pour fonctionner avec d’autres systèmes biologiques de taille et de vitesse similaires, par exemple, d’autres ciliés tels que Paramecium et Blepharisma. De plus, la modification de la chambre d’imagerie (p. ex., à l’aide de puits secs ou de puits de différentes tailles couplés à un grossissement d’imagerie différent) élargit considérablement l’applicabilité de ce flux de travail. La boîte à outils actuelle pour Stentor comprend la dissection chirurgicale, le choc osmotique, l’ARNi, l’analyse de l’ADN / ARN et les inhibiteurs de petites molécules⁶. La méthode à haut débit de quantification de la motilité présentée ici ajoute un degré complémentaire de caractérisation et sera utilisée dans les travaux futurs pour étudier les phénotypes de motilité.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m