Summary
Questo documento descrive i metodi che dimostrano tre comuni tecniche di raccolta e disaggregazione del biofilm su due tipi di superficie, test di robustezza di un metodo di raccolta e informazioni minime da considerare quando si scelgono e ottimizzano le tecniche di raccolta e disaggregazione per aumentare la riproducibilità.
Abstract
I metodi del biofilm consistono in quattro fasi distinte: far crescere il biofilm in un modello pertinente, trattare il biofilm maturo, raccogliere il biofilm dalla superficie e disaggregare i ciuffi e analizzare il campione. Delle quattro fasi, la raccolta e la disaggregazione sono le meno studiate, ma comunque critiche quando si considera il potenziale di distorsione dei test. Questo articolo dimostra le tecniche di raccolta e disaggregazione comunemente usate per il biofilm coltivato su tre diverse superfici. Le tre tecniche di raccolta e disaggregazione del biofilm, raccolte da un'ampia revisione della letteratura, includono vortice e sonicazione, raschiatura e omogeneizzazione e raschiatura, vortice e sonicazione. Vengono considerati due tipi di superficie: duro non poroso (policarbonato e vetro borosilicato) e poroso (silicone). Inoltre, forniamo raccomandazioni per le informazioni minime che dovrebbero essere incluse quando si segnala la tecnica di raccolta seguita e un metodo di accompagnamento per verificare la presenza di pregiudizi.
Introduction
La definizione di biofilm si è evoluta negli ultimi decenni e comprende l'associazione microbica con una varietà di superfici biologiche e/o non biologiche, l'inclusione di componenti noncellulari1 che mostrano una crescita e un'espressione genetica diverse2 all'interno di una matrice. Il biofilm fornisce protezione dagli stress ambientali come l'essiccazione e può rendere l'azione dei disinfettanti chimici meno efficace con conseguente sopravvivenza dei microbi. I sopravvissuti all'interno di un biofilm possono potenzialmente fornire una fonte di microrganismi patogeni che sono un problema di salute pubblica3.
I metodi di biofilm sono composti da quattro fasi: crescita, trattamento, campionamento (raccolta e disaggregazione) e analisi. La crescita, il primo passo, in cui l'utente determina le condizioni di crescita dell'organismo, la temperatura, i mezzi, ecc., È il più considerato e riportato nella letteratura sui biofilm4,5,6,7. La fase di trattamento valuta gli antimicrobici (ad esempio, disinfettanti) per determinarne l'efficacia contro un biofilm maturo3,8,9 o l'antimicrobico può essere incorporato nella superficie per determinare la capacità del prodotto di prevenire o ridurre la crescita del biofilm10. La terza fase, il campionamento, include passaggi per raccogliere il biofilm dalla superficie su cui stava crescendo e per disaggregare i grumi rimossi3,8,11. La quarta fase, l'analisi, può includere conteggi cellulari vitali, microscopia, misurazioni di fluorescenza, esiti molecolari e/o una valutazione dei componenti della matrice8,9. La valutazione dei dati fornisce informazioni sull'esito di un esperimento. Dei quattro, il campionamento è spesso il passaggio più trascurato perché presume che la tecnica di raccolta e/o disaggregazione del biofilm scelta sia efficace al 100%, spesso senza verifica11.
Le sospensioni planctoniche di batteri, spesso considerate omogenee, richiedono un semplice vortice prima dell'analisi. I biofilm, invece, sono comunità complesse composte da microrganismi (procariotici e/o eucariotici), esopolisaccaridi, proteine, lipidi, DNA extracellulare e cellule ospiti12. Sono necessari passi oltre i tradizionali metodi di coltura microbiologica planctonica per raccogliere adeguatamente il biofilm da una superficie e quindi disaggregarlo in una sospensione monocellulare omogenea. Un'ampia rassegna della letteratura (informazioni non incluse in questa pubblicazione) ha dimostrato che la scelta della tecnica di rimozione e disaggregazione dipende da una serie di fattori, tra cui le specie presenti nel biofilm, la superficie a cui è attaccato il biofilm (non porosa o porosa), l'accessibilità alle superfici di crescita (cedola facilmente rimovibile o distruzione fisica dell'apparato in cui il biofilm sta crescendo), geometria della superficie (area e forma), densità del biofilm sulle superfici di crescita e attrezzature di laboratorio disponibili.
Quando il biofilm viene raccolto da una superficie, la sospensione cellulare risultante è eterogenea. Se questa sospensione non uniforme deve essere enumerata con precisione, deve essere disaggregata in singole celle. I conteggi delle piastre vitali presuppongono che un'unità formante una colonia provenga da un batterio. Se gli aggregati di biofilm sono posizionati sul terreno di crescita, è impossibile distinguere le singole cellule che potrebbero portare a stime imprecise. Ad esempio, durante i test di efficacia del disinfettante, se un trattamento rimuove il biofilm in modo molto efficace da una superficie rispetto al controllo, la riduzione del log potrebbe apparire artificialmente grande rispetto al controllo. D'altra parte, un disinfettante chimico che fissa il biofilm su una superficie rispetto al controllo sembrerà avere una riduzione del log inferiore11. Questo tipo di scenario potrebbe portare a un'interpretazione distorta dei dati sperimentali.
In preparazione alla pubblicazione, una revisione della letteratura ha determinato che gli approcci comuni alla raccolta e alla disaggregazione del biofilm includono raschiatura, tampone, sonicazione, vortice o una combinazione di questi. La raschiatura è definita come la rimozione fisica del biofilm dalle superfici con un bastone sterile, una spatola o un altro strumento. Il tampone si riferisce alla rimozione del biofilm dalle superfici con un bastoncino con punta di cotone o altro materiale assorbente fisso. La sonicazione si riferisce alla rottura del biofilm dalle superfici tramite onde ultrasoniche distribuite attraverso l'acqua. Il vortice si riferisce all'uso di un miscelatore per ottenere un vortice liquido del campione all'interno di un tubo. L'omogeneizzazione utilizza lame rotanti per tagliare i grumi di biofilm raccolti in una sospensione a singola cellula. In questo articolo, presentiamo tre metodi di raccolta e disaggregazione per due diversi tipi di superficie, dura / non porosa e porosa.
Viene fornito un elenco di informazioni minime raccomandate che i ricercatori dovrebbero includere nelle sezioni sui metodi delle pubblicazioni. Speriamo che l'inclusione di queste informazioni consenta ad altri ricercatori di riprodurre il loro lavoro. Non esiste un metodo di raccolta e disaggregazione perfetto, pertanto vengono fornite anche raccomandazioni su come controllare la tecnica.
Tre metodi comuni per raccogliere e disaggregare il biofilm da superfici di crescita comuni sono dimostrati in questo articolo. Queste informazioni consentiranno ai ricercatori di comprendere meglio la precisione complessiva e la distorsione di un metodo di prova del biofilm. I metodi descritti sono i seguenti: (1) Un biofilm pseudomonas aeruginosa coltivato su cedole di policarbonato (superficie dura non porosa) sotto elevato taglio fluido nel reattore a biofilm CDC viene raccolto e disaggregato seguendo una combinazione in cinque fasi di vortice e sonicazione per ottenere la raccolta e la disaggregazione del biofilm (2) A P. aeruginosa il biofilm coltivato su cedole di vetro borosilicato (superficie dura non porosa) nel reattore a flusso di gocciolamento sotto basso taglio fluido viene raccolto e disaggregato utilizzando raschiatura e omogeneizzazione (3) Un biofilm di Escherichia coli coltivato in tubi di silicone (superficie porosa) viene raccolto e disaggregato usando raschiatura, seguito da sonicazione e vortice.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vortice e sonicazione
- Coltivare un biofilm maturo di P. aeruginosa ATCC 15442 coltivato secondo lo standard ASTM E25622.
- Alla fine del periodo di crescita di 48 ore, preparati a trattare il biofilm e i coupon campione secondo lo standard ASTM E28718
- Inserire asetticamente paraspruzzi autoclavati in tubi conici sterili da 50 ml utilizzando pinze sterilizzate a fiamma. Ripetere per tutti i tubi che riceveranno il trattamento. I tubi per i coupon di controllo non hanno bisogno di un paraspruzzi.
- Rimuovere asetticamente un'asta selezionata casualmente dal reattore a biofilm CDC. Risciacquare i tagliandi per rimuovere le cellule attaccate liberamente immergendo delicatamente l'asta in 30 ml di acqua tamponata sterile.
- Tenere l'asta parallela al piano di lavoro, su un tubo conico vuoto e sterile da 50 ml e utilizzando una chiave a brugola sterilizzata a fiamma, allentare la vite per far cadere un coupon rivestito di biofilm nel tubo. Ripeti per il numero desiderato di coupon. Rimuovere i paraspruzzi e metterli in un contenitore separato per la sterilizzazione.
- Utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml, pipettare lentamente 4 mL del trattamento o del controllo nei tubi in modo che il liquido scorra lungo l'interno della parete del tubo.
- Picchiettare delicatamente il fondo del tubo in modo che eventuali bolle d'aria sotto il coupon vengano spostate. Consentire 30 - 60 s tra ogni aggiunta.
- Alla fine del tempo di contatto specificato, pipettare 36 mL di neutralizzatore nei tubi nello stesso ordine in cui è stato applicato il trattamento (o il controllo).
NOTA: Il volume finale del trattamento combinato e del neutralizzatore è importante per determinare con precisione la densità del log del biofilm. - Vortice ogni tubo sull'impostazione più alta per 30 ± 5 s. Assicurarsi che si raggiunga un vortice completo.
NOTA: Si deve prestare attenzione quando si vorticolano tagliandi pesanti come l'acciaio inossidabile in flaconcini di vetro in cui potrebbe verificarsi la rottura. - Determinare il numero ottimale di provette per bagno e il posizionamento all'interno del rack della provetta prima di elaborare i campioni effettivi. Se si elaborano più campioni, verificare che la temperatura dell'acqua nel bagno sonicante sia di 21 ± 2 oC.
- Posizionare i tubi nella cremagliera sospesa nel sonicatore degassato in modo tale che il livello dell'acqua nel bagno sia uguale al livello del liquido nei tubi. Sonicate a 45 kHz, potenza al 100% e funzione normale per 30 ± 5 s. Ripeti i cicli di vortice e sonicazione e poi termina con un vortice finale (5 cicli totali).
NOTA: Questi tubi con il biofilm raccolto e disaggregato sono la diluizione 100 o 0. - Campione diluito in serie in acqua tamponata. Piastra su agar R2A utilizzando il metodo di placcatura appropriato. Incubare a 36 ± 2 oC per 24 ore. Contare le colonie in base al metodo di placcatura utilizzato e registrare i dati.
2. Raschiatura e omogeneizzazione
- Coltivare un biofilm maturo di P. aeruginosa ATCC 15442 secondo lo standard ASTM E264713.
- Impostare la stazione di campionamento per includere il pannello di campionamento, l'etanolo al 95% in un becher, il bruciatore di alcol, gli emostati, lo strumento di rimozione dei coupon, i becher con acqua di diluizione sterile e i tubi di diluizione per il risciacquo dei coupon.
- Spegnere la pompa. Rimuovere una copertura del canale e utilizzare uno strumento sterile per la rimozione del coupon e gli emostati per rimuovere il coupon, facendo attenzione a non disturbare il biofilm.
- Risciacquare la cedola immergendola delicatamente, con un movimento fluido, in 45 ml di acqua di diluizione sterile (contenuta in un tubo centrifuga da 50 ml). Invertire immediatamente il movimento per rimuovere il coupon.
- Inserire il coupon in un becher contenente 45 ml di acqua di diluizione sterile. Raschiare la superficie della cedola ricoperta di biofilm in direzione verso il basso per circa 15 s, usando una spatola sterile o un raschietto. Risciacquare la spatola o il raschietto mescolandolo nel becher. Ripetere il processo di raschiatura e risciacquo 3-4 volte, garantendo la copertura completa della superficie del coupon.
- Risciacquare la cedola tenendola con un angolo di 60° sul becher sterile e pipettare 1 mL di acqua di diluizione sterile sulla superficie della cedola. Ripetere l'operazione per un totale di 5 risciacqui. Il volume finale nel becher è di 50 ml.
NOTA: Il volume finale del trattamento combinato e del neutralizzatore è importante per determinare con precisione la densità del log del biofilm. - Sostituisci ogni copertina del canale man mano che i coupon vengono rimossi.
- Lavorando nell'armadio di biosicurezza, omogeneizzare il campione di biofilm raschiato. Collegare una sonda omogeneizzatore sterile all'omogeneizzatore, posizionare la punta della sonda nel liquido, accendere l'omogeneizzatore e rampare fino a 20.500 giri / min.
- Omogeneizzare il campione per 30 s. Abbassare gli RPM e spegnere l'omogeneizzatore.
- Sanificare la sonda tra i campioni di biofilm omogeneizzando un vuoto di diluizione sterile di 9 ml a 20.500 giri / min per 30 s come descritto sopra. Omogeneizzare un tubo da 9 ml di etanolo al 70% per 30 s, staccare la sonda e lasciare riposare il tubo di etanolo per 1 minuto. Omogeneizzare due spazi vuoti di diluizione aggiuntivi.
NOTA: per ogni campione può essere utilizzata una sonda omogeneizzatore monouso. - Diluire in serie i campioni in acqua tamponata. Piastra su agar R2A utilizzando il metodo di placcatura appropriato. Incubare le piastre a 36 ± 2oC per 24 ore, contare le colonie come appropriato al metodo di placcatura utilizzato e registrare i dati.
3. Raschiatura, vortice e sonicazione
- Coltivare un biofilm maturo Escherichia coli ATCC 53498 in tubo catetere siliconico10.
- Preparare i materiali di campionamento: tubi di risciacquo, tubo centrifugo sterile, piastra di Petri sterile vuota, emostato e forbici in acciaio inossidabile sterilizzato a fiamma, timer e righello.
- Con la pompa in pausa, utilizzare il 70% di etanolo per pulire l'esterno del tubo. Misurare 2 cm dall'estremità, evitando l'area attaccata al connettore, e contrassegnare il tubo per determinare le posizioni di taglio.
- Con le forbici sterilizzate a fiamma, tagliare il tubo sul segno di 2 cm e posizionare il segmento in una capsula di Petri sterile vuota. Pulire il tubo con etanolo al 70% e ricollegare l'estremità distale al tubo di scarico.
- Risciacquare il segmento del tubo per rimuovere le cellule planctoniche. Con una pinza sterilizzata a fiamma, immergere delicatamente il segmento del tubo in 20 ml di acqua di diluizione sterile e quindi rimuovere immediatamente. Posizionare il segmento in 10 ml di neutralizzatore.
- Con una pinza sterilizzata a fiamma, tenere premuto il segmento del tubo e raschiare con un bastoncino applicatore di legno sterile fino a quando tutte le aree interne del tubo sono state raschiate. Risciacquare occasionalmente il bastoncino nei 10 ml di neutralizzatore e riposizionare il segmento nella provetta del campione. Il segmento dei tubi raschiati è la diluizione 100 o 0.
NOTA: Il volume finale del trattamento combinato e del neutralizzatore è importante per determinare con precisione la densità del log del biofilm. - Vortice ogni tubo sull'impostazione più alta per 30 ± 5 s. Posizionare il tubo nel rack del tubo sospeso nel sonicatore in modo tale che il livello dell'acqua nel bagno sia uguale al livello del liquido nei tubi. Sonicate a 45 kHz, potenza al 100% e funzione normale per 30 ± 5 secondi. Ripeti i cicli di vortice e sonicazione, quindi termina con un vortice finale.
NOTA: Questo tubo con il biofilm raccolto e disaggregato è la diluizione 100 . - Diluire in serie i campioni in acqua tamponata. Piastra su Tryptic Soy Agar utilizzando il metodo di placcatura appropriato.
- Incubare le piastre a 36 ± 2 oC per 24 ore. Contare le colonie in base al metodo di placcatura utilizzato, registrare i dati e calcolare la media aritmetica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validazione/Conferma di un metodo di raccolta
Diversi studi condotti nel nostro laboratorio hanno esaminato la capacità del vortice e della sonicazione di raccogliere efficacemente il biofilm coltivato nel reattore a biofilm (ASTM E2562)2 utilizzando il metodo a tubo singolo (ASTM E2871)8.
Un biofilm P. aeruginosa ATCC 15442 è stato coltivato secondo ASTM E25622 su tagliandi di vetro borosilicato. Dopo 48 ore, quattro tagliandi sono stati inseriti in flaconcini, "trattati" con 4 ml di acqua tamponata sterile e neutralizzati con 36 mL di brodo neutralizzante D/E 2x. L'impostazione iniziale di sonicazione di 45 kHz, potenza del 10%, impostazione Sweep, 30 ± 5 s è stata utilizzata per raccogliere e disaggregare il biofilm da tre dei quattro coupon. Al termine del ciclo di vortice e sonicazione, ogni coupon è stato macchiato di viola cristallo e fotografato. La Figura 1 mostra la quantità di biofilm rimanente sui tre coupon dopo il vortice e la sonicazione rispetto al controllo.
Per testare ulteriormente questo, un biofilm P. aeruginosa ATCC 15442 è stato coltivato come descritto in precedenza e sono state confrontate due impostazioni di sonicazione: 1) 45 kHz, potenza del 10%, impostazione Sweep, 30 ± 5 secondi e 2) 45 kHz, potenza del 100%, impostazione normale, 30 ± 5 secondi. Un coupon per ogni set dei tre è stato colorato con la macchia BacLight Live / Dead e ripreso utilizzando la microscopia confocale (CM). I restanti due coupon di ciascun set sono stati diluiti, placcati ed enumerati per le cellule vitali. I risultati validi del conteggio delle piastre sono stati 9,230 Log10 CFU / cedola ± 0,007 (SD_R) per l'impostazione 1 e 9,272 Log10 CFU / coupon ± 0,066 (SD_R) per l'impostazione di sonicazione 2. Questi dati hanno confermato uno studio collaborativo EPA Single Tube Method del 2015 in cui è stato raggiunto 9,03 Log10 CFU / coupon ± 0,272 (SD_R)9. Secondo i conteggi delle piastre vitali, sembra che tutti e tre i mezzi siano abbastanza simili da non giustificare ulteriori indagini sulle differenze tra i due metodi di raccolta. Tuttavia, le immagini microscopiche mostrate nella Figura 2 possono suggerire che più biofilm è rimasto dopo l'uso dell'impostazione 1 rispetto all'impostazione 2. Mentre osserviamo che il biofilm che rimane sui coupon appare morto (di colore rosso), l'interpretazione della fattibilità quando si utilizza la macchia BacLight Live / Dead è difficile14,15. Piuttosto che concentrarci sulle implicazioni di vitalità del biofilm colorato, abbiamo usato questa macchia per visualizzare il biofilm rimanente sulle superfici. Inoltre, mentre riconosciamo che la sonicazione potrebbe essere deleteria per la vitalità batterica, una pubblicazione del 2007 di Kobayashi et al.16 ha dimostrato che l'aumento del tempo di sonicazione oltre i 5 minuti ha comportato una diminuzione del numero di piastre vitali. Poiché il nostro studio ha utilizzato un totale di 1 minuto di sonicazione, siamo fiduciosi che poche cellule siano state uccise tramite sonicazione, come mostrato dal >9.2 LOG10 CFU / coupon per i due parametri di sonicazione. È interessante notare che una raccolta completa del biofilm dalla superficie non è stata raggiunta con nessuno dei due metodi. Questa scoperta dimostra che i conteggi delle piastre vitali da soli non sono adeguati per determinare la raccolta e la distorsione della disaggregazione e quindi devono essere abbinati a un metodo aggiuntivo, ad esempio la microscopia.
Oltre alle impostazioni del sonicatore, abbiamo studiato altri fattori importanti che influenzano la sonicazione. Questi includevano il volume di liquido nei flaconcini (10 o 40 mL), il tipo di liquido nel flaconcino (acqua tamponata o brodo neutralizzante 2X D/E) e il numero di flaconcini posti nel bagno contemporaneamente (3 o 12 flaconcini)9.
I biofilm di P. aeruginosa sui coupon cdc Biofilm Reactor sono stati sonicati utilizzando l'impostazione del sonicatore 2 (45 kHz, potenza al 100%, impostazione normale, 30 ± 5 secondi). Tutti i campioni sono stati ruotati 3 alla volta o 6 alla volta utilizzando un vortice dotato di un attacco per tubi a 6 posti, quindi sonicati come descritto nella Figura 3. Un coupon di ciascuna delle seguenti categorie è stato ripreso utilizzando CM (Figura 3).
Nel secondo studio in cui sono stati studiati i parametri di sonicazione, le immagini microscopiche (Figura 3) suggeriscono che la minimizzazione del volume nei tubi, la riduzione del numero di tubi lavorati contemporaneamente e l'uso di D / E Neutralizing Broth (che contiene tensioattivo) contribuiscono tutti a migliorare la raccolta di biofilm dai coupon.
I biocidi possono migliorare positivamente o negativamente la raccolta e la disaggregazione. Analogamente alla conferma che un neutralizzatore arresta efficacemente l'attivo senza aumentare l'uccisione prima di eseguire un test di efficacia, è importante confermare che un biocida non influisce in modo differenziale sulla raccolta e sulla disaggregazione. Per i test di efficacia, i risultati della polarizzazione sono se e solo se vi è una rimozione differenziale per il controllo rispetto ai campioni di biofilm trattati11.
Figura 1: Foto di coupon macchiati di viola cristallo che dimostrano il biofilm residuo. A) Cedola rimossa dal reattore e macchiata di cristallo viola. B, C, D) Tre tagliandi replicati sono stati "trattati" separatamente con acqua tampone sterile e poi neutralizzati. Per raccogliere e disaggregare, i coupon sono stati vortexed (30 ± 5 secondi) e sonicati (45 kHz, 10% di potenza, impostazione Sweep, 30 ± 5 secondi) due volte, quindi hanno ricevuto un vortice finale. Immagini per gentile concessione di Danielle Orr e Blaine Fritz. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini al microscopio confocale di coupon che confrontano due diverse impostazioni di sonicazione. Coupon (ingrandimento 12,5X) elaborati tramite impostazione di sonicazione 1 (45 kHz, potenza del 10%, impostazione Sweep) a sinistra o impostazione di sonicazione 2 (45 kHz, potenza 100%, impostazione normale) a destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immagini al microscopio confocale di coupon confrontando volumi, liquido di sonicazione e numero di tubi. Tagliandi (ingrandimento 12,5X) lavorati in volumi da 10 o 40 mL, in acqua di diluizione (DW) o D/E Neutralizing Broth (D/E), 3 o 12 tubi alla volta con impostazione di sonicazione ottimizzata (45 kHz, potenza al 100%, impostazione normale). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Parametri chiave di importanza per la raccolta e la disaggagregazione Fare clic qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Informazioni minime per i metodi di raccolta e disaggregazione
Per creare dati riproducibili sul biofilm in tutta la comunità scientifica, è imperativo che gli autori includano il maggior numero possibile di dettagli su ciascuna delle fasi di crescita, trattamento, campionamento e analisi di un metodo di biofilm. La standardizzazione dei metodi del biofilm ha aiutato in questo sforzo in quanto consente al ricercatore di fare riferimento a un metodo specifico e ad eventuali modifiche rilevanti. Tuttavia, molti articoli includono solo una frase o due per descrivere la raccolta e la disaggregazione del biofilm. Per una migliore riproducibilità, raccomandiamo che le informazioni minime per la raccolta di biofilm siano incluse nelle pubblicazioni. Questo si basa sull'iniziativa Minimum Information About a Biofilm Experiment (MIABiE) presentata da Lourenco et al.17. Nel caso di utilizzo della sonicazione per la raccolta di biofilm e i parametri di disaggregazione, le informazioni dovrebbero includere: posizione dei tubi all'interno del bagno (raccomandazioni dei produttori per evitare di danneggiare i trasduttori), numero di tubi sonicati contemporaneamente, materiale del tubo, volume e tipo di liquido nel tubo, presenza di tensioattivo, posizione del liquido nei tubi rispetto al livello del liquido del bagno ad ultrasuoni, dispositivo utilizzato per tenere i tubi nella vasca da bagno (bicchieri di vetro vs rack della provetta), degasaggio del bagno d'acqua prima della sonicazione dei campioni (se il degasaggio non è un'opzione del produttore, il semplice funzionamento del bagno prima di inserire i campioni aiuterà a rimuovere alcuni gas disciolti dal liquido del bagno), temperatura del bagno d'acqua (le temperature possono aumentare dopo lunghi periodi di sonicazione), frequenza (25 kHz o 45 kHz, ad esempio), funzione bagno (sweep o normale, ad esempio) e intervallo di potenza fornito ai trasduttori (10 - 100%, per esempio). Queste impostazioni dovrebbero essere ottimizzate per il biofilm studiato, il sistema utilizzato per far crescere il biofilm e la marca / modello specifico del bagno ad ultrasuoni18.
Le impostazioni del sonicatore possono essere modificate per ottimizzare gli effetti di raccolta desiderati. Il degasaggio rimuove l'aria disciolta all'interno del liquido del bagno, migliorando così il potere pulente. La frequenza può essere regolata su un'impostazione bassa o alta. Un'impostazione bassa come 25 kHz, ad esempio, aiuterebbe a raccogliere campioni tenaci mentre un'impostazione più elevata di 45 kHz sarebbe più appropriata per i campioni sensibili. Una funzione bagno di sweep o normale consente la distribuzione della cavitazione. La funzione sweep crea uno spostamento continuo dei massimi di pressione sonora. La funzione normale consente ai trasduttori di funzionare in modalità a doppia semionde che può causare zone morte, rendendo così la sonicazione meno efficace. Le gamme di potenza possono essere modificate dal 10 al 100% della potenza erogata ai trasduttori19. È noto che la sonicazione può influire negativamente sulla vitalità batterica. Uno studio del 2008 di Stamper et al.20 ha esposto colture batteriche all'aumento dell'energia ultrasonica nel tempo per creare curve di uccisione batterica. Si consiglia agli utenti di confermare che una particolare combinazione di impostazioni di sonicazione non causa una diminuzione dei batteri vitali20.
Non esiste un metodo perfetto per raccogliere e disaggregare il biofilm, ma metodi particolari funzionano meglio per alcune combinazioni di superfici / microbi rispetto ad altri. Chiediamo al lettore di determinare quali parametri sono importanti per il loro particolare scenario di biofilm. I parametri chiave importanti per la raccolta e la disaggregazione sono inclusi nel fascicolo supplementare 1.
Per gli studi di sonicazione condotti per valutare la raccolta e la distorsione di disaggregazione, abbiamo scoperto che la sonicazione è conveniente, efficiente e in grado di essere standardizzata per la raccolta e la disaggregazione del biofilm dalle superfici. Il posizionamento dei coupon nelle fiale riduce al minimo la variabilità da tecnico a tecnico che si incontrerebbe nei metodi in cui i coupon vengono fisicamente raschiati dal personale di laboratorio, ad esempio. Anche se sembra abbastanza semplice posizionare le fiale in un bagno d'acqua sonicante, ci sono molti parametri che devono essere considerati per ottenere una raccolta ottimale del biofilm.
Sono disponibili due tipi di apparecchiature di sonicazione, bagni ad ultrasuoni e sonde ad ultrasuoni. Questo documento si concentra principalmente sui bagni ad ultrasuoni in cui l'energia ultrasonica viene generata nell'intervallo da alta (20 - 45 kHz) a normale (40 - 60 Hz) frequenza.
Tre processi principali sono in gioco quando si utilizza un dispositivo ad ultrasuoni per pulire una superficie. L'energia elettrica viene convertita in energia acustica quando una corrente ad alta frequenza viene inviata a un trasduttore piezoelettrico o magnetostrittivo che oscilla in risposta alla corrente. L'oscillazione genera onde di compressione (rarefazione) nel liquido. Le bolle di cavitazione si formano a causa della pressione negativa durante la rarefazione. Le bolle crescono fino a raggiungere una dimensione instabile e collassano, creando un getto d'acqua che pulisce le superfici21.
Tre approcci di raccolta e disaggregazione sono dimostrati in questo articolo: metodi di sonicazione e vortice per la raccolta e la disaggregazione del biofilm quando coltivato su cedole in policarbonato nel reattore a biofilm CDC secondo il metodo a tubo singolo. I metodi di raschiatura e omogeneizzazione per la raccolta e la disaggregazione del biofilm vengono mostrati quando vengono coltivati su tagliandi di vetro utilizzando il reattore a biofilm a flusso di gocciolamento. I metodi di raschiatura, sonicazione e vortice per la raccolta e la disaggregazione del biofilm vengono mostrati quando vengono coltivati in tubi di silicone.
Non esiste un metodo perfetto per raccogliere e disaggregare il biofilm, ma alcuni approcci sono migliori per diverse superfici e / o applicazioni. Ciò che è importante è prendersi il tempo necessario per convalidare il metodo utilizzato. In questo articolo, abbiamo discusso l'uso del viola cristallino e della microscopia, ma esistono altre scelte a seconda della sensibilità richiesta. Se la ricerca include test di efficacia, è fondamentale confermare la validità dell'approccio in presenza dell'antimicrobico6. Tutte le attrezzature sono leggermente diverse, quindi anche se il metodo di raccolta e disaggregazione è stato standardizzato, è comunque prudente confermare il processo per l'attrezzatura utilizzata. I metodi di raccolta e disaggregazione sono specifici per i batteri associati alla superficie e al biofilm. La ricerca ha dimostrato che scelte improprie possono portare a risultati di test distorti. Tuttavia, la raccolta e la disaggregazione sono le meno studiate delle quattro fasi nei metodi di biofilm. Generalmente è anche il passo non convalidato (dato per scontato come funzionante) con il minor numero di informazioni presenti nel documento pubblicato che rende difficile riprodurre il processo in un laboratorio diverso. Questo documento e il video di accompagnamento mostrano tre approcci comuni per due tipi di superficie e suggeriscono come convalidare un metodo per un singolo laboratorio. Queste informazioni aiuteranno i ricercatori a prendere decisioni più informate su quale metodo utilizzare e forniscono indicazioni su cosa segnalare per migliorare la riproducibilità.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno divulgazioni.
Acknowledgments
Desideriamo ringraziare Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers e Fei San Lee per i loro contributi a questo documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2017).
- Environmental Protection Agency (USEPA). Efficacy Test Methods, Test Criteria, and Labeling Guidance for Antimicrobial Products with Claims Against Biofilm on Hard, Non-Porous Surfaces. Environmental Protection Agency (USEPA). , Available from: http://www.epa.gov/perticide-analytical-methods/efficacy-test-methods-test-criteria-and-labeling-guidance-antimicrobial (2021).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. Simoes, M., et al. , Elsevier Science and Technology. 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- Summers, J. G. The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University. , Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019).
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. Donelli, G. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. 0, 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , Singen, Germany. (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S.
