Summary
ここでは、NMR分光法による溶液NMRの緩和分散プロファイルを 取得および分析するための実験室で実施されるプロトコルの詳細な説明が提供される。
Abstract
タンパク質立体構造ダイナミクスは、重要な生物学的プロセスである酵素触媒、リガンド結合、アロステリー、およびシグナル伝達の調節において基本的な役割を果たします。構造とダイナミクスのバランスが生物学的機能をどのように支配するかを理解することは、現代の構造生物学における新たなフロンティアであり、いくつかの技術的および方法論的発展に火をつけた。これらの中で、CPMG緩和分散液NMR法は、μs-msタイムスケールで発生するタンパク質の構造、運動学、熱力学に関するユニークな原子分解能情報を提供します。ここでは、15Nの緩和分散実験の取得および分析のための詳細なプロトコルを提示する。例として、細菌のC末端領域におけるμs-msダイナミクスの分析のためのパイプラインを示す酵素I。
Introduction
カーパーセルメイブーム-ギル(CPMG)の緩和分散体(RD)実験は、溶液NMR分光法1、2、3、4、5によってμs-msタイムスケールで発生する立体構造平衡を特徴付けるためにルーチンベースで使用される。コンフォメーションダイナミクスの他の方法と比較して、CPMG技術は、現代のNMR分光計で比較的容易に実装でき、特殊なサンプル調製ステップ(すなわち、結晶化、サンプル凍結または位置合わせ、および/または蛍光または常磁性タグを有する共有結合結合)を必要とせず、構造、運動、熱力学の構造、運動、熱力学の情報を返す共統構造の包括的な特性を提供する。CPMG実験が立体構造平衡を報告するためには、(i)観測されたNMRスピンが、立体構造交換を行っている状態(微小状態)と(ii)の間に50μsから~10msの範囲の時間スケールで起こらなければならないという2つの条件が適用されなければならない。これらの条件下では、観察された横方向緩和率 
()は、組み込みR2(μs-msダイナミクスの無しで測定したR2) 
と、横弛緩(Rex)への交換寄与の和である。R2obsへのRex寄与は、パルス系列のCPMGブロックを構成する180°パルス間の間隔を減少させることによって徐々に消光することができ、そして得られたRD曲線は、ブロッホ・マッコネル理論を用いて、微小状態間の化学シフト差、各微小状態の小数体の母集団、およびマイクロステート間の交換率を得ることができる( 図1,2.
15N CPMG実験の文献では、いくつかの異なるパルスシーケンスおよび分析プロトコルが報告されている。本明細書において、実験室で実施されるプロトコルについて説明する。特に、NMRサンプルの調製、NMR実験の設定と取得、およびNMRデータの処理と分析のための重要なステップが導入される(図2)。プロトコルを他の研究所に転送しやすくするために、パルスプログラム、処理および解析スクリプト、およびデータセットの例が補足ファイルとして提供され、(https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html)からダウンロードできます。提供されたパルスシーケンスは、オフセット依存性アーチファクト6の抑制のためにCPMGブロックに4段階のフェーズサイクルを組み込み、いくつかのインターリーブ実験を取得するためにコード化される。これらのインターリーブ実験は、同じ緩和期間を有するが、異なるCPMGフィールド7を達成するために、再焦点パルスの異なる数を有する。また、説明されたパルスプログラムがNMR信号8のTROSY成分の15 NR2を測定することに注意することも重要である。全体として、このプロトコルは、中型および大型タンパク質4、5、9、10における立体構造交換の特性評価に対して正常に適用されている。より小さいシステム(<20 kDa)の場合、ヘテロ核単一量子コヒーレンス(HSQC)ベースのパルスシーケンス11、12の使用が推奨される。
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Protocol
1. NMRサンプルの調製
- 目的のタンパク質の2H、15 N-labledサンプルを精製して精製します。
注: 15個の N 標識タンパク質サンプルを使用して CPMG RD 実験を取得できますが、可能な場合は測定によって得られたデータの品質が大幅に向上します。透過性タンパク質の製造のためのプロトコルは、文献13で入手可能です。 - 精製したタンパク質サンプルを脱気NMRバッファーにバッファー交換します。
- NMRサンプルをNMRチューブに移します。
注: シグナル対ノイズ比を最大化し、タンパク質とタンパク質の相互作用の発生を最小限に抑えるためには、NMRサンプルの濃度を慎重に最適化する必要があります。一般に、CPMG実験の典型的な濃度範囲は0.1〜1.0 mMである。
2. 初回NMR実験のセットアップ
- 補足ファイルをダウンロードして解凍します。
- ファイル bits.vv と trosy_15N_cpmg.vv (pulseprogram という名前のフォルダーにある) をパルス プログラム ディレクトリ (
/exp/スタン/nmr/リスト/pp/user にコピーします。
注: trosy_15N_cpmg.vv ファイルの最初の行にリストされている bits.vv へのパスが正しいことを確認します。 - 取得ソフトウェアを開き、以前に実行した 1H-15N HSQC 実験を、コマンド edcを使用して新しい実験にコピーします。
- パル プログコマンドを使用して、パルスプログラムtrosy_15N_cpmg.vvを新しく作成した実験にロードします。
- パルスプログラムファイル(trosy_15N_cpmg.vv)の最後に記載されている指示を使用して、CPMG実験を設定します。
3. NMR実験のルーチンセットアップ
- マグネットにサンプルを導入し、NMR実験を取得するためのすべての基本的な手順を実行します: サンプルをロックし、シム;1 H および15N チャネルに合致し、調整します。
- p1とp7を それぞれ1Hおよび 15N硬度90°パルスの持続時間に設定します。
注意:最適な結果を得るには、15N 90°パルスを細心の注意を払って調整することが重要です。校正は、通常、分光器マニュアルに記載されているように、DMSOで15N標識尿素の100 mMサンプルを使用して行われます。また、最初のINEPTブロックの15N 90°パルスが180°パルスに切り替わった1H-15 N HSQCスペクトルの最初の増分を取得することにより、作業NMRサンプル上のキャリブレーションを直接再確認することができます。 キャリブレーションが正しい場合は、null を取得する必要があります。 - 取得ウィンドウで 、1H および 15N 次元の中心とスペクトル幅を設定します。
注: 最適な水抑制のために、水信号の周波数で 1H スペクトルを中央に配置します。 - 緩和遅延(d30)を0.7T2に設定し、T2はタンパク質の予想 される15N横方向緩和時間です。
注: d30 の値は経験的に最適化して最良の結果を得ることができます。 - コマンドvclistを使用して、図 1A および図 1Bのパラメーター n に対応する整数のリストを作成します。ν cpmg = 4 x n/d30 に従って、リスト内の各項目が異なるCPMGフィールド (νcpmg)に対応していることを確認してください。リストの最初の数値が 0 (CPMG ブロックがスキップされ、d30 = 0 s である参照実験に対応) であり、1,000 x d30 /4 より大きい数値を使用しないようにしてください。このしきい値より大きい数値は、1 kHz > νcpmgとなり、プローブに損傷を与える可能性があります。
- l8 を vclist 内のエントリ数に設定し、l3 を間接ディメンションの実数 (通常は 64- 200 の範囲は l3 に設定) に設定し、1 td は l8 x l3 x 2 に等しい値に設定します。
注: 手順 3.7 ~ 3.11 を実行して、水の抑制を最適化します。 - 受信機ゲイン (rg) を 1 に設定します。パルスプログラムファイル (edcpul) を開き、91 行目に移動し 、goto 999の前にあるセミコロンを削除して、ファイルを保存します。
- コマンド gs を使用して、FID 信号の強度を最小限に抑えるために、パラメーター spdb0 (または spdw0) を調整します。
- パルス・プログラム・ファイルの 91 行目にセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。
- ステップ 3.7 から 3.9 を繰り返して、spdb11 (パルス・プログラム・ファイルの 168 行目)、spdb2 (パルス・プログラム・ファイルの 179 行目) 、および pldb2 (パルス・プログラム・ファイルの 184 行目) を最適化します。
- コマンド rga を実行して、レシーバゲインを最適化します。
- スキャンの数 (ns) を 8 の倍数に設定します。
- コマンド zg を実行して実験を開始します。
4. NMRデータの処理と分析
- Process (補足ファイル) という名前のフォルダを、ser ファイルが格納されているディレクトリにコピーします。
- ファイルsep_fid.comと ft2D.com を使用して、NMR データを処理します。
注: 処理スクリプトの編集方法については、sep_fid.comファイルと ft2D.com ファイル内で説明します。 - Sparky のディレクトリ CPMG_Sparky_filesに含まれる ucsf ファイルを開きます。
注: ucsf ファイルは、処理スクリプトによって作成されます。vclist の各エントリに対して 1 つの ucsf ファイルがあります。最初の ucsf ファイル(test_1.ucsf)には、参照実験が含まれています。後続の ucsf ファイル (test_2.ucsf、test_3.ucsf,...test_n.ucsf) は、νcpmgの最小値から最大値まで順に並べられます。 - 参照 NMR スペクトル(test_1.ucsf)の NMR クロスピークをピックします。
- Sparky コマンド paを使用して、選択したすべてのクロスピークを選択します。
- Sparky コマンド rhを実行します。このコマンドは、ダイアログ ウィンドウを開きます。 各スペクトルの同じ位置にあるオプションの高さを選択します。 [設定 ]をクリックし、すべてのNMRスペクトルを確認します。 [更新 ]をクリックし、出力ファイルを作業ディレクトリに保存します。出力ファイルには、開かれた NMR スペクトル全体の信号強度の行列が含まれます。
注: インターリーブ擬似 3D 実験から強度を回復するために線形フィッティングを使用する、より正確なプロトコルが文献14に記載されています。ラインシェイプフィッティング用の自由に利用できるソフトウェアは、https://pint-nmr.github.io/PINT/(PINT)、https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/(FUDA)、NMRPipe(nLinLSモジュール)およびSPARKY(それモジュール)内で利用できます。 - 各CPMGフィールドについて、I 0とI
d30は、それぞれ基準(vc = 0)と緩和(vc >0)NMRスペクトルの強度である式を使用して、R2レートに信号強度を変換します。
注: 補足ファイルでは、信号強度を R2 レートに変換し、RD プロファイルを視覚化するために使用されるスプレッドシート ファイル (R2_calc.xls) のテンプレートが提供されています。 - Sparky コマンド st を使用してリファレンススペクトルのノイズ レベルを読み取り、R2 レートでエラーを伝播します。
注: 補足ファイルでは、測定された R2 レートでエラーを伝播するために使用されるスプレッドシート ファイル (R2_calc.xls) のテンプレートが提供されます。
d30は、それぞれ基準(vc = 0)と緩和(vc >0)NMRスペクトルの強度である式を使用して、R2レートに信号強度を変換します。5. フィッティングRDカーブ
- RD_fitting (補足ファイル) という名前のフォルダを作業ディレクトリにコピーします。
- 割り当てられた各 NMR ピークについて、R ex を計算して見積もる rexは
vclist 内の最も低いおよび最高の νcpmgで測定される R2レートです。
- Rex の推定誤差の 2 倍より大きい RD カーブを視覚的に調べ、正確にモデル化するにはあまりにも騒がすぎない RD カーブをすべて破棄します。
メモ: Rex上のノイズは、エラーと . - 推定エラーの 2 倍を超える Rex を持つすべての RD カーブを使用して、適合スクリプト用の入力ファイルを準備します。
注: 入力ファイルの準備に関する詳細な指示は、フィッティングスクリプト内で提供されています。入力ファイルの例は 、補足ファイルとして提供されます。一般に、RDデータは2つの異なる静的フィールドで測定され、同時に適合します。このプロトコルでは、2 つの異なる入力ファイル (補足ファイル) が必要です。 - 「 補足ファイル」に記載されているスクリプトを使用して RD データを適合します。
注: RD カーブの残基ベースまたはグローバル フィットを実行するために、それぞれ 2 つの異なるスクリプトが用意されています。どちらのスクリプトも、2 サイト交換モデルとカーバー リチャーズ方程式を使用して RD 曲線に適合します。フィッティングスクリプト内で、より詳細な手順が提供されています。Chemex(https://github.com/gbouvignies/ChemEx)やCATIA(https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/)などの追加のソフトウェアパッケージを利用して、ブロック-マッコネル方程式を使用してデータフィッティングを実行できます。 - pbおよび kexの関数として、減らされたχ2を推定する適合パラメータの信頼性をテストします。
注: 減らされた χ2 は出力ファイルに提供されます。pb および kex は、フィッティング手順で下限と上限を使用して特定の値に拘束することができます。このスクリプトでは、pb の下限と上限はそれぞれ lb(2) と ub(2) です。kex の下限と上限はそれぞれ lb(3) と ub(3) です。 - 適合パラメータの誤差を推定します。これは、スクリプト内のMC_facの値を 1 に設定し、フィッティングを複数回繰り返すことで行うことができます (通常、>20 繰り返し)。各パラメータの誤差は分布の標準偏差として推定されます。
注: MC_facを 1 に設定すると、実験データにガウス分散誤差 (実験誤差に基づいて計算) が追加される合成データセットが生成されます。
vclist 内の最も低いおよび最高の νcpmgで測定される R2レートです。
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Representative Results
ここで説明するプロトコルは、1H-15N TROSYスペクトルの各ピークのRDプロファイルを取得する結果となる(図3A)。取得したRDプロファイルから、各バックボーンアミド群の15N横方向緩和への交換寄与を推定することができる(図3A、3B)。調査中のタンパク質の3D構造にRexをプロットすることにより、μs-ms時間スケールで立体構造交換を行っている構造領域を特定することができる(図3C)。カーバー・リチャーズ方程式を用いたRD曲線のモデリングは、平衡状態の状態の小数母集団やこれらの状態間の交換速度など、交換プロセスにおける熱力学的および運動的パラメータを返す(図1、図3D)。これらの熱力学および運動パラメータ(複数の実験温度でRD実験を取得した)の温度依存性は、それぞれvan't Hoff方程式とアイリング方程式を用いてモデル化し、立体構造交換のエネルギーに関する詳細な情報を得ることができる(図3E)9、10。
図1: CPMG RD実験の概要 (A) RDデータの取得に使用されるCPMGブロックの概略図180°パルスは黒い長方形で示されています。オペレータは 
CPMGブロックに出入りする磁化を示します。CPMG フィールドは、後続の再焦点パルス間の間隔 (2τ)によって決まります。(B)2点測定では、緩和遅延(CPMGブロックが適用される間)は一定に保たれ、CPMGフィールドはn(緩和遅延期間中にCPMGブロックが適用される回数)と τの値を変化させることによって変化する。(C)立体AとBの間の2部位平衡の概略表現。為替レート定数 (kex) は、それぞれ順方向および逆方向のレート定数 kab と kbaの合計です。pa とpb(= 1 - pa)は、それぞれ種AとBの分数集団である。Δωab は、コンフォメーションAとBの間の化学シフト差(D)CPMG(左上)がアクセスできる範囲にある交換プロセスのシミュレーションRD曲線で、CPMG(右上)で検出するには速すぎる、CPMG(下右)では検出が遅すぎる、およびΔωab が小さすぎて検出できない(左下)。pb 値は3%に設定した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:RDデータの取得と分析のための主要なパイプライン 本プロトコルで説明されているワークフローの概略表現。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CPMG RD実験によるEICのμs-msダイナミクス(A) ここで説明するプロトコルを用いてEICの40°Cおよび800MHzで測定された例15N RDプロファイル。Rexの推定は赤で示されています。(B) Rex値は、残基指数に対してプロットされ、(C)は、コンフォメーション交換を行っている残基を同定するために、酵素のX線構造上でプロットされる。(D) Rexがエラーより大きい NMR 信号をモデル化し、平衡のキネティクス (kabおよび kba)および熱力学 (pb)を得るために (補足ファイルに示されているスクリプトを使用して) モデリングされます。()複数の温度でのRDデータの取得は、立体構造変化のエネルギーに関する情報を返す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、タンパク質に関する15N RDデータの取得および分析のために研究室で実施されるプロトコルについて説明します。特に、NMRサンプルの調製、NMRデータの測定、およびRDプロファイルの分析のための重要なステップがカバーされています。RD実験の取得と解析に関する重要な側面について以下に説明します。しかし、実験とデータ分析の詳細な説明のために、元の文献の慎重な研究は3、8、11、15、16を強くお勧めします。
NMRサンプルを調製する際には、μs-msタイムスケール上の任意のマイナー(<1%人口)状態の存在が検出可能なRDプロファイル1を生成することを考慮することが極めて重要である。したがって、高度に精製されたタンパク質ストック(>90%純粋)を使用して、調査中のシステムと一過性の複合体を形成する可能性のある汚染物質の存在を避けることをお勧めします。また、タンパクリガンド複合体の立体構造ダイナミクスを調べれば、リガンド結合の動態によって生じるスプリアスRDプロファイルの存在を避けるために、リガンドの飽和濃度を使用することが重要です。
高分子量システム(>20 kDa)を使用する場合、透過性タンパク質サンプルとTROSYパルスシーケンスを使用して、現在のプロトコルで提示され、横方向の緩和速度を低下させ、緩和期間を最大化する(私たちのパルスプログラムではd30)ことも推奨されます。確かに、最も低い入手可能なνcpmgとして.= 4/d30は、長い緩和期間を使用して、R2 への交換寄与が最大である小さなνcpmgでR2 データを取得することを可能にする。この点で、本プロトコルで提供されたものと同様のパルスシーケンスが、分光器の標準パルスシーケンスポートフォリオに存在することに言及することも重要である(ファイル名:trhncorexf3gp)。2つのファイルの主な違いは、標準シーケンスはTROSY-HNCO実験に基づいているのに対し、我々の実験はTROSY-HSQC実験に基づいており、サンプルの 13C標識を必要としないことです。
もう一つの問題は、取得温度です。実際、RDデータは通常複数の静的フィールドで測定されるため、取得温度が使用されるすべての分光計の間で一貫していることは重要です。そのため、実験を設定する前に温度較正を確認することを強くお勧めします。
RD曲線の解析に関する事項については、ここで示す手順とフィッティングスクリプトがカーバー-リチャーズ方程式を利用していることを強調することが重要です。これは、RDデータの定量モデリングのための文献で適用される最も一般的な手順であるが、カーバーリチャーズ方程式は、近似の数を組み込み、2サイト交換ケース17に限定される。データ モデリングのために特定のデータセットにより厳密な Bloch-McConnell 行列が必要な場合は、フィッティング手順を18、19、20に応じて変更する必要があります。上記のプロトコルでは、ブロッホ・マッコネル理論を使用してデータモデリングを実行する、自由に利用可能なソフトウェアパッケージがいくつかリストされています。
最後に、我々の原稿はタンパク質立体構造ダイナミクスの調査のための15のN RDデータの適用のみに焦点を当てているが、他のいくつかの実験は、異なる核および他の生物学的および非生物学的分子系18、19、21、22、23上のRD曲線を測定する文献に記載された。特に異なる核の使用は、タンパク質構造のより密なサンプリングを可能にし、このプロトコル5、21、23で提示された15のNベースの実験によって大部分が無視される側鎖ダイナミクスに関する情報を提供するので、非常に重要である。
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Disclosures
すべての著者は原稿を読み、承認しました。私たちは利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は、NIGMS R35GM133488からの資金とロイJ.カーバー慈善信託からV.V.への資金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Acquisition Software |
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