Method Article

단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

DOI:

10.3791/62398

⸱

February 14th, 2022

 ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은D2O대사의 단일 세포 자극 라만 산란 이미징에 의해 2.5시간 이내에 신속한 항균 감수성 테스트(AST) 분석을 제공합니다. 이 방법은 소변 또는 전혈 환경의 박테리아에 적용되며, 이는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST를 변형시킵니다.

Abstract

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항생제 내성 감염의 확산을 늦추고 예방하기 위해 병원균에 대한 항균 효과를 정량적으로 결정하기 위해 신속한 항균 감수성 검사 (AST)가 시급합니다. 전형적으로 장기간 배양에 기초한 통상적인 방법으로 AST를 완성하는 데 며칠이 걸리며, 이들은 임상 샘플에 대해 직접 작용하지 않는다. 여기에서는 산화중수소(D2O) 대사 혼입의 자극된 라만 산란(SRS) 이미징에 의해 가능해진 신속한 AST 방법을 보고합니다. 바이오매스로의D2O의 대사 혼입 및 단일 박테리아 수준에서 항생제에의 노출에 따른 대사 활성 억제는 SRS 영상화에 의해 모니터링된다. 항생제 노출 시 박테리아의 단일 세포 대사 불활성화 농도(SC-MIC)는 총 2.5시간의 샘플 준비 및 검출 후에 얻을 수 있습니다. 또한이 신속한 AST 방법은 소변이나 전혈과 같은 복잡한 생물학적 환경의 박테리아 샘플에 직접 적용 할 수 있습니다. 중수소 혼입의 SRS 대사 영상화는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST에 대한 변형입니다.

Introduction

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항생제 내성(AMR)은감염성 질환의 효과적인 치료에 대한 전 세계적으로 증가하는 위협입니다1. 항생제 내성 박테리아 퇴치를 위한 조치가 취해지지 않으면 AMR로 인해 연간 1,000만 명이 추가로 사망하고 2050년까지 전 세계 GDP 1,00조 달러의 손실이 발생할 것으로 예상됩니다.1,2. 이는 항생제 내성 박테리아의 출현을 늦추고 관련사망률을 줄이기 위해 감염성 박테리아의 항생제 감수성 검사(AST)를 위한 신속하고 혁신적인 진단 방법의 시급한 필요성을 강조합니다3. 최상의 임상 결과를 보장하려면 24시간 이내에 효과적인 치료법을 도입하는 것이 중요합니다. 그러나 디스크 확산 또는 브로스 희석 방법과 같은 현재의 금 표준 방법은 일반적으로 임상 샘플의 사전 배양 절차에 최소 24시간이 필요하고 최소 억제 농도(MIC) 결과를 얻기 위해 추가로 16-24시간이 필요합니다. 전반적으로, 이러한 방법은 클리닉에서 전염병 치료에 대한 즉각적인 결정을 안내하기에는 너무 시간이 많이 걸리며, 이는 항생제 내성의 출현 및 확산으로 이어집니다4.

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Protocol

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인간 혈액 표본의 사용은 보스턴 대학의 IRB와 국립 보건원 (NIH)의 지침에 따릅니다. 특히, 표본은 은행에서 왔으며 완전히 식별되지 않습니다. 이 표본은 보스턴 대학의 기관 검토위원회 (IRB) 사무실에서 인간 대상으로 간주되지 않습니다.

1. 박테리아 및 항생제 원액의 제조

  1. 1.5mL 마이크로 튜브의 멸균 1x 인산완충식염수(PBS) 또는 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 용해된 1mg/mL 농도의 항생제(황산겐타마이신 또는 아목시실린) 원액을 준비합니다. 겐타 마이신 설페이트를 멸균 PBS 용액에 녹이고 아목시실린을 멸균 DMSO 용매에 용해시킨다. 그 후, 항생제 용액을 제안된 대로 2-8°C에서 저장한다.
  2. D2O함유 양이온 조정 뮐러-힌튼 브로스(MHB) 배지를 만들기 위해, 10mL의 D2O에 220mg의 MHB 브로스 베이스를 첨가하여 100%D2O함유 배지를 만든다. 200nm 공극 크기의 필터로 여과하여 용액을 멸균합니다.
    알림: 이 프로토콜은 항상 추가 단계에서 배지 용액을 만들고 살균하는 데 사용하십시오.
  3. SRS 이미징을 위해 박테리아 샘플을 준비하려면 중수소가 포함되지 않은 일반 MHB 배지 2mL를 ....

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Results

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중수소 혼입에 대한 배양 시간의 영향은 C-D (2070-2250 cm-1) 및 CH (2,800-3,100 cm-1) 영역에서 자발적 라만 미세 분광법으로 측정됩니다 (그림 4a). 70% D2O 함유 배지에서 배양된 녹농균의 타임랩스 단일 세포 라만 스펙트럼은 0분에서 180분까지의 배양 시간에 걸쳐 CD/CH 강도가 증가하는 것을 보여줍니다(그림 4b) 단일 미생물 세포에서 증가하는 C-D 풍부도는D2O가 세포 내부의 중수소화 생체분자에 통합됨을 보여줍니다.

50% 이상의D2O표지는 23시간 잠복기 동안 박테리아 대사에 유의하게 영향을 미친다27. 25시간 배양 기간 동안D2O표지 농도가 70%.......

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Discussion

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신속한 AST는 샘플에서 SC-MIC 결과까지 2.5시간 이내에 단일 세포 SRS 대사 영상을 사용하여 항생제 치료에 대한 박테리아 대사 활성의 반응을 평가함으로써 얻을 수 있습니다. 박테리아 대사 활성 및 항미생물 감수성의 반응은 C-D 결합의 SRS 이미징을 사용하여 생체 분자 합성을 위한D2O의 대사 혼입을 모니터링함으로써 검출될 수 있다. 물은 살아있는 세포에서 어디에나 사용되기 때문에 SRS 대사 영상은 신속한 AST를위한 보편적 인 방법을 제공합니다. 신속한 AST 방법은 단일 박테리아 수준에서 소변이나 전혈과 같은 복잡한 생물학적 환경에서 박테리아를 검출하는 데 적용 할 수 있습니다. SC-MIC는 소변 및 혈액에서 박테리아의 1.5시간 배양 후 측정할 수 있으며, 이는 UTI 및 BSI 진단의 패러다임을 시간 소모적인 배양 의존적 절차에서 배양 독립적인 현장 접근 방식으로 전환하는 혁신적인 것으로 간주됩니다. 따라서 기존의 브로스 미세 희석 방법에 비해 진단 시간이 크게 단축되어.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 NIH R01AI141439에서 J.-X.C 및 M.S로, R35GM136223에서 J.-X.C.로 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
음향 광학 변조Gooch & HousegoR15180-1.06-LTD변조 스톡스 레이저 빔
AmoxicillinSigma AldrichA8523-5G
대역 통과 필터ChromaHQ825/150m포토다이오드 전에 스톡스 레이저 빔 차단
염화칼슘시그마 AldrichC1016-100G양이온 조정
Mueller-Hinton BrothFisher ScientificB12322국물 희석 방법에 의한 미생물의 항균 감수성 테스트
원심 분리기Thermo Scientific75002542
커버 안경VWR16004-318
스냅 캡이있는 배양 튜브Fisher brand149569B
DaptomycinAcrosA0386346
Deuterium oxide151882항생제를 용해시키는 유기 용매
Deuterium oxide-d6Sigma Aldrich156914SRS 이미징 시스템
Escherichia coli BW 25113The Coli Genetic Stock Center7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher brand05-408-129
Gentamicin sulfateSigma AldrichG4918
친수성 폴리비닐리덴 플루오라이드 필터Millipore-SigmaSLSV025NBpore size 5 µ m
ImageJ 소프트웨어NIH버전 : 2.0.0-rc-69 / 1.52t이미지 처리 및 분석
37 °deg에서 설정된 궤도 쉐이커를 인큐베이팅; CVWR97009-890
접종 루프SigmaBR452201-1000EA
InSight DeepSee 펨토초 펄스 레이저Spectra-PhysicsModel: insight X3SRS 이미징용 1045nm에서 조정 가능한 레이저 소스 및 고정 레이저 소스
Lock-in amplifier취리히 인스트루HF2LISRS 신호 복조
오일 콘덴서OlympusU-AACNA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)American Type Culture CollectionATCC 47085
PhotodiodeHamamatsuS3994-01검출기
폴리프로필렌 원추형 튜브 15 mLFalcon14-959-53A
폴리프로필렌 필터Thermo Scientific726-2520기공 크기 0.2 &마이크로; m
멸균 페트리 접시Corning07-202-031
주사기 10 mLFisher 브랜드14955459
UV/Vis 분광 광도계Beckman Coulter모델: DU 530600 nm
Vortex mixerVWR97043-562
물 대물렌즈OlympusUPLANAPO/IR60×의 파장에서 광학 밀도 측정, 해당 위치 1.2
먼트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10)....

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Antimicrobial Susceptibility TestingStimulated Raman ScatteringDeuterium IncorporationSingle Bacterium ImagingRapid ASTBacterial Metabolic ActivitySRS MicroscopyClinical Sample AnalysisPseudomonas AeruginosaEscherichia Coli

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