이 프로토콜은 드로소필라 폴리텐 세포에서 이종로크로마틴 골재를 시각화하는 것을 목표로 한다.
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이 논문에서
요약
초록
면역 염색에 의한 이종로크로마틴 골재의 시각화는 어려울 수 있습니다. 크로마틴의 많은 포유류 성분은 드로소필라 멜라노가스터에 보존된다. 따라서 이종로크로마티닌 형성 및 유지보수를 연구하는 우수한모델이다. 제3의 별D. 멜라노가스터 유충의 타액선에서 발견되는 것과 같은 다각화된 세포는 크로마틴을 거의 천 번 증폭시키는 것을 관찰하는 훌륭한 도구를 제공하고 연구자들은 핵에서 이종로크로마틴의 분포변화를 연구할 수 있게 하였다. 이종염색로마티신 성분의 관찰은 폴리텐 염색체 제제에서 직접 수행될 수 있지만, 일부 단백질의 국소화는 치료의 중증도에 의해 변경될 수 있다. 따라서, 세포에서 이종로크로마틴의 직접적인 시각화는 이러한 유형의 연구를 보완한다. 이 프로토콜에서, 우리는 이 조직에 사용된 면역 염색 기술, 이차 형광 항체의 사용 및 더 중대한 정밀도 및 세부사항으로 이 이 이종로막골을 관찰하기 위하여 공초점 현미경 검사법을 기술합니다.
서론
에밀 헤이츠1의초기 연구 이후, 이종학은 염색체의 유전자 발현, 메이오틱 및 미토틱 분리, 게놈 안정성2,3,4의 유지 와 같은 세포 과정의 중요한 레귤레이터로 간주되었다.
이종로크로마티닌은 주로 반복적인 시퀀스를 정의하는 구성이종, 텔로미어 및 원로메머와 같은 특정 염색체 부위에 존재하는 전이 가능한 요소의 두 가지 유형으로 나뉩니다. 이 종족의 이종은 주로 히스톤 H3(H3K9me3)의 리신 9의 디 또는 트라이메틸화와 헤테로크로마티틴 단백질 1a(HP1a)5,6의결합과 같은 특정 히스톤 마크에 의해 후성유전학적으로 정의된다. 한편, 이종은 염색체의 팔을 통해 국소화되며 주로 발달침묵유전자7,8로구성된다. 전상 세포에서 이종로크로마틴 블록의 면역 염색, 또는 단계 간 세포에서 이종로크로마티닌 골재의 관찰, 이종학 영역9의 형....
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프로토콜
1. 제3회 인스타 애벌레 문화
- 효모 100g, 정제되지 않은 통지팡이 설탕 100g, 한천 16g, 프로피오닉산 10mL, 젤라틴 14g을 추가하여 표준 미디어 1리터를 준비합니다. 효모를 제외한 모든 재료를 수돗물 800mL에 녹인 다음 효모를 녹입니다. 즉시 30분 동안 오토클레이브.
- 그 후, 미디어를 60°C로 식히고 최종 농도0.01%에 프로피오닉산을 첨가하게 한다. 젤라틴이 형성될 때까지 병을 방치하십시오.
- 3o 인스타 애벌레 문화를 최적화하기 위해 먼저 5-10일 된 성인을 모아 표준 미디어의 넓은 목 병에 50명(남성 25명, 암컷 25명)을 배치합니다.
- 알의 수가 50 (야생 형 변형의 경우 약 12 시간)이 될 때까지 25 °C에서 제어 온도 인큐베이터에 파리가있는 병을 놓습니다.
- 잠복기 시간이 끝나면 성인을 제거하고 새 병으로 옮겨 절차를 반복하십시오. 배아가 72시간 동안 18°C에서 자도록 하십시오.
참고: 드로소필라 재고 유지 보수 조건에 대한 자세한 내용은 테네시 및 Thymmel13을참조하십시오.
2. 애벌레 컬렉션
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결과
드로소필라 타액선에서 HP1a 면역염색의 대표적인 결과가 도 1에도시된다. 긍정적인 결과는 하나의 초점(도1a)(이종골골재 또는 응축수)을 관찰하는 것이다. 음의 결과는 신호나 분산된 신호가 아닙니다. 때로는 이중 신호를 관찰 할 수 있습니다, 즉, 이중 점(도 1c)와함께, 그러나 일반적으로 작은 양에서 발생합니다.
데이터 분석은 다양한 돌연변이 배경 내에서 HP1a분포를 비교하여 막대 그래프로 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 도 2에서 우리는 야생형 핵의 98%가 하나의 초점의 분포를 제시하고 핵의 2%가 2개의 포시를 제시하는 반면, 돌연변이체에서는, 비율 변화 및 2개의 포시의 존재가 40%로 증가한다는 것을 알 수 있다.
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토론
진핵 생물의 세포 기능은 크로마티닌과 RNA를 포함한 다양한 분자와의 상호 작용에 의해 지원되는 핵 내의 3D 구조를 정의할 수 있다. 지난 3년 동안 이종로크로마틴을 포함한 관련성이 있는 생물학적 응축수들은 활성 및 억압적인 크로마틴 16,17,18의뚜렷한 핵 공간 조직을 촉진하는 위상 분리 의 결정에 근본적인 역할을수행했다.
이테로크로마틴은 세포 기능과 정체성을 보존하는 데 필수적입니다. 이전에는 이 조밀한 지역이 전사되지 않았다고 생각되었습니다. 그러나, 이제 우리는 더 강력한 기술을 가지고, 우리는 이종학이 전사뿐만 아니라 핵의 비계를 유지하는 근본적인 과정이 아니라 개발 또는 병리학 적 과정에 민감하다는 것을 알 수 있습니다12,
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공개 사항
저자는 그들이 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 공초점 이미지의 일부를 복용 마르코 안토니오 로살레스 베가와 아벨 세구라, 미디어 준비를위한 카르멘 무뇨스 박사와 박사 아르투로 피멘텔, M.C. 안드레스 사라레기, 현미경의 사용에 대한 조언을 LMNA에서 크리스 우드 박사에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Axygen MCT-150-C | 11351904 | 브랜드는 중요하지 않음 |
| 16% 포름알데히드 | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, 분자 생물학 등급 | Roche | 10735078001 | 브랜드는 중요하지 않음 |
| 완전한, 프로테아제 억제제 Ultra EDTA-free 프로테아제 억제제 | Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22x22, 브랜드 중요하지 않음 |
| DTT | Sigma | d9779 | 브랜드 중요하지 않음 |
| EDTA | Sigma | E5134 | 브랜드 중요하지 않음 |
| EGTA | 브랜드 중요하지 않음 | ||
| 유리 슬라이드 | 골드 씰 | 3011 | 브랜드 중요하지 않음 |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | 브랜드는 중요하지 않습니다 |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | 제품 형태 농축액 0.1mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | 브랜드는 중요하지 않음 |
| 메탄올 | 베이커 | 9070-03 | 브랜드는 중요하지 않음 |
| NaCl | Sigma | 71376 | 브랜드는 중요하지 않음 |
| NaOH | 브랜드는 중요하지 않음 | ||
| PIPES | 브랜드는 중요하지 않음 | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | 브랜드는 중요하지 않습니다 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, 브랜드는 중요하지 않습니다 |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, 브랜드는 중요하지 않습니다 |
참고문헌
- Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572(2019).
- Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
- Kasinathan, B., et al.
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재인쇄 및 허가
