Summary
Este protocolo visa visualizar agregados de heterocromatina em células de politento de Drosophila.
Abstract
A visualização dos agregados de heterocromatina por imunostaining pode ser desafiadora. Muitos componentes mamíferos da cromatina são conservados em Drosophila melanogaster. Portanto, é um excelente modelo para estudar a formação e manutenção da heterocromatina. Células politenizadas, como as encontradas nas glândulas salivares da terceira instar D. melanogaster larvas, fornecem uma excelente ferramenta para observar a cromatina amplificada quase mil vezes e permitiram aos pesquisadores estudar mudanças na distribuição de heterocromatina no núcleo. Embora a observação dos componentes da heterocromatina possa ser realizada diretamente nas preparações cromossômicas de politento, a localização de algumas proteínas pode ser alterada pela gravidade do tratamento. Portanto, a visualização direta da heterocromatina nas células complementa esse tipo de estudo. Neste protocolo, descrevemos as técnicas de imunossuagem utilizadas para este tecido, o uso de anticorpos fluorescentes secundários e a microscopia confocal para observar esses agregados de heterocromatina com maior precisão e detalhe.
Introduction
Desde os primeiros estudos de Emil Heitz1, a heterocromatina tem sido considerada um importante regulador de processos celulares, como expressão genética, separação meiomática e mitótica de cromossomos, e a manutenção da estabilidade do genoma2,3,4.
A heterocromatina é dividida principalmente em dois tipos: heterocromatina constitutiva que define caracteristicamente sequências repetitivas, e elementos transposáveis que estão presentes em locais específicos do cromossomo, como os telômeros e os centrosmers. Este tipo de heterocromatina é definida principalmente epigeneticamente por marcas de histona específicas, como a di ou tri-metilação de lysina 9 de histona H3 (H3K9me3) e a ligação da proteína heterocromatina 1a (HP1a)5,6. Por outro lado, a heterocromatina facultativa localiza através dos braços do cromossomo e consiste principalmente em genes silenciados de desenvolvimento7,8. A imunossuagem de blocos de heterocromatina em células metafósicas, ou a observação de agregados de heterocromatina em células interfásicas, revelou muita luz no entendimento da formação e função das regiões heterocromáticas9.
O uso de Drosophila como sistema modelo permitiu o desenvolvimento de ferramentas essenciais para estudar heterocromatina sem o uso de microscopia eletrônica10. Desde a descrição da variegação do efeito de posição e a descoberta de proteínas associadas à heterocromatina, como hp1a, e modificações pós-translacionais de histona, muitos grupos desenvolveram várias técnicas imunohistoquímicas que permitem a visualização dessas regiões heterocromáticas10,11.
Essas técnicas baseiam-se no uso de anticorpos específicos que reconhecem proteínas associadas à heterocromatina ou marcas de histona. Para cada tipo de célula e anticorpo, as condições de fixação e permeabilização devem ser determinadas empiricamente. Além disso, as condições podem variar se forem utilizados processos mecânicos adicionais, como técnicas de esmagamento. Neste protocolo, descrevemos o uso de glândulas salivares drosophila para estudar focos heterocromáticos. As glândulas salivares possuem células politensas que contêm mais de 1.000 cópias do genoma, fornecendo assim uma visão amplificada da maioria das características da cromatina, com exceção do DNA do satélite e algumas regiões heterocromáticas que estão sob replicação. No entanto, as regiões heterocromatinas são facilmente visualizadas em preparações cromossômicas de politenso, mas as técnicas de esmagamento podem às vezes interromper complexos característicos ligados à cromatina ou a arquitetura cromatina. Portanto, a imunolocalização de proteínas em tecido de glândula salivar inteira pode superar esses efeitos indesejados. Usamos este protocolo para detectar várias proteínas ligadas à cromatina, e demonstramos que este protocolo combinado com os estoques mutantes de Drosophila pode ser usado para estudar a interrupção da heterocromatina12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Terceira cultura de larvas instar
- Prepare 1 litro de mídia padrão adicionando 100 g de levedura, 100 g de açúcar de cana inteiro não refinado, 16 g de ágar, 10 mL de ácido propiônico e 14 g de gelatina. Dissolva todos os ingredientes, exceto o fermento em 800 mL de água da torneira e, em seguida, dissolva a levedura. Autoclave imediatamente por 30 minutos.
- Depois, deixe a mídia esfriar até 60 °C e adicione ácido propiônico a uma concentração final de 0,01%. Deixe a garrafa ficar de pé até que a gelatina seja formada.
- Para otimizar a cultura das larvas 3o instar, primeiro colete adultos idosos de 5 a 10 dias e coloque 50 (25 machos e 25 fêmeas) em uma garrafa de pescoço largo de mídia padrão.
- Coloque a garrafa com as moscas em uma incubadora de temperatura controlada a 25 °C até que o número de ovos colocados seja de 50 (aproximadamente 12 horas para a cepa do tipo selvagem).
- Após o fim do tempo de incubação, remova os adultos e transfira-os para uma nova garrafa para repetir o procedimento. Deixe os embriões crescerem a 18 °C por 72 horas
NOTA: Para mais informações sobre as condições de manutenção do estoque de Drosophila, consulte Tennessen & Thymmel13.
2. Coleta de larvas
- Para a coleta de larvas escolha as larvas errantes que não têm espirros sempre. Após a eversão dos espirros, a larva entra no estágio prepupal, mantendo excelentes cromossomos de politenso adequados para análise. Somente após 12 horas as células da glândula salivar começam a se preparar para a morte celular programada14,15.
- Pegue 15 3° larvas instar e coloque-as em um copo de relógio para lavá-las. Em seguida, transfira-os para uma solução salina gelada ou PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, ajuste pH para 7,4).
- Disseca de 15 a 30 pares de glândulas salivares (ou o máximo possível em 30 minutos) em PBS frio com inibidores de protease sob o microscópio estereoscópico. Transfira as glândulas salivares para um tubo de 1,5 mL com PBS gelado.
- Lave uma vez com 1 mL de PBS mais inibidores de protease. Espere o tecido chegar ao fundo do tubo.
- Após a lavagem, remova o PBS com uma pipeta de 1000 μL. Tome cuidado para não tocar no tecido.
- Alternativamente, disseque as glândulas salivares em 5 mL de PBS para eliminar a necessidade desta etapa de lavagem e prossiga para o passo 3, transferindo as glândulas salivares para 0,5 mL do tampão de fixação Ruvkun descrito abaixo.
3. Fixação do tecido das glândulas salivares
- Depois de remover o PBS da última etapa, adicione diretamente 0,5 mL de 1x Ruvkun fixando buffer, com 50% de metanol (adicione 0,5 mL de metanol) e 2% de formaldeído.
NOTA: 2x Solução Ruvkun é 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES no pH 7.4. - Incubar por 2 horas a 4 °C com rotação suave.
4. Lavagem do tecido das glândulas salivares
- Realize uma lavagem de rotação de 5 minutos com 1 mL de tampão Tris/Triton (100 mM Tris pH 7.4, 1% Triton X-100 e 1 mM EDTA).
NOTA: Aguarde que o tecido chegue ao fundo do tubo.
5. Permeabilização
- Incubar as glândulas salivares em 1 mL de Tris/Triton X-100 (o mesmo acima). Para algumas proteínas pode ser necessário adicionar 1% β-mercaptoetanol.
- Incubar por 2 horas a 37° C com leve agitação (300 rpm).
6. Etapa de preservação (opcional)
NOTA: Se não prosseguir imediatamente para a incubação com o anticorpo, preserve o tecido da seguinte forma.
- Lave com 1 mL de tampão BO3 (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) e depois incubar em BO3/10 mM DTT a 37° C com leve agitação (300 rpm) por 15 minutos.
- Ao final do período de incubação, realize uma lavagem com 1 mL de tampão BO3 sozinho.
NOTA: Aguarde que o tecido chegue ao fundo do tubo. - Adicione 1 mL de PBS. Preserve o tecido nesta solução a 4 °C por até 72 horas e, em seguida, proceda com o próximo passo. Esta etapa é particularmente útil ao trabalhar com diferentes cepas mutantes que podem apresentar um ciclo de vida atrasado, de modo que a imunodeseção pode ser realizada ao mesmo tempo junto com os controles.
7. Bloqueio de tecidos
- Incubar as glândulas salivares em 1 mL de Tampão B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) por 2 horas em temperatura ambiente com rotação.
8. Imunostaining
- Remova todo o buffer B e adicione o buffer A (PBS + 0,1% BSA) mais anticorpo de interesse.
NOTA: Usamos o HP1a C1A9c (anticorpo concentrado) do Hybridoma Bank até 1:3000. Ao usar o C1A9s (supernante) tentamos de 1:100 a uma diluição de 1:500 e qualquer diluição entre esta classificação funciona bem) durante a noite a 4 oC com rotação. Neste ponto é importante que o tremor não levante bolhas que possam danificar o anticorpo.
9. Lavagem imunossante
- Realize lavagens de 3 x 15 minutos com tampão B em movimento à temperatura ambiente usando 1 mL cada vez.
- Transfira as glândulas para o buffer B juntamente com o anticorpo secundário acoplado a um fluoróforo por 2 horas em rotação a 4 oC (anticorpo secundário Alexa fluor 568 Invitrogen foram usados 1:3000).
- Cubra o tubo com papel alumínio para proteger o anticorpo secundário da luz.
- Realizar lavagens de 2 x 15 minutos à temperatura ambiente enquanto estiver em rotação com 1 mL de Buffer B.
- Incubar com um marcador de DNA como Otox (tomar 2 μL de estoque de 5 mM e dissolver em 1 mL de Buffer B) ou Hoechst (tomar 1 μL de 10 mg/mL de estoque e dissolver em 1 mL de Buffer B) por 10 minutos em temperatura ambiente com rotação.
- Realize uma lavagem com tampão B e uma vez com PBS, cada lavagem com duração de 10 minutos enquanto gira à temperatura ambiente.
NOTA: Lembre-se de protegê-lo da luz.
10. Imagem
- Monte as glândulas salivares em um escorregador, fazendo uma piscina com uma mancha de cobertura.
- Coloque as glândulas salivares no meio da piscina e cubra com o citifluor AF1 para evitar a formação de bolhas que estendem o líquido viscoso por todo o lugar. Em seguida, sele todos os lados com esmalte claro.
- Observe sob uma fluorescência ou microscópio confocal. Se a amostra não for observada no mesmo dia, armazene-se longe da luz a 4 °C.
- Use o GraphPad Prism 6 para gerar todos os gráficos e análises estatísticas.
- Analise os dados da distribuição HP1a em glândulas salivares usando o teste Kruskal-Wallis. A significância estatística foi definida em (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultados representativos da imunostaining HP1A nas glândulas salivares de Drosophila são mostrados na Figura 1. Um resultado positivo é observar um ponto focal (Figura 1a) (agregado heterocromático ou condensado). Um resultado negativo não é sinal ou sinal disperso. Às vezes, um sinal duplo pode ser observado, ou seja, com um ponto duplo(Figura 1c),mas geralmente ocorre em quantidades menores.
A análise de dados pode ser representada como gráficos de barras, comparando a distribuição do HP1a em diferentes origens mutantes. Por exemplo, na Figura 2 podemos ver que 98% dos núcleos do tipo selvagem apresentam uma distribuição de um ponto focal e 2% dos núcleos apresentam dois focos, enquanto no mutante, a proporção muda, e a presença de dois focos aumenta para 40%.
A Figura 3 mostra resultados representativos de imunostaining H3k9me3 nas glândulas salivares de Drosophila. Podemos observar um ponto focal (Figura 3b) que se assemelha à imunostaining HP1a, (agregado heterocromático ou condensado). Um sinal duplo ou triplo(Figura 3c) pode ser visto em raras ocasiões nas cepas do tipo selvagem.
Figura 1. Imagem de microscopia confocal representativa da glândula salivar imunostaining com anticorpo HP1a do tipo selvagem (wt). a) DNA (sinal de ciano), HP1a (sinal magenta) e barra de escala de fusão de 100 μm. Na imunostaining para HP1a, um núcleo com ponto focal é marcado com uma seta branca e um núcleo com dois focos com uma caixa de linha pontilhada. A coluna direita mostra uma imagem ampliada de um único núcleo com uma barra de escala de 5 μm. b) distribuição focal. c) distribuição de dois focos. Ambos os núcleos estão marcados com uma linha branca tracejada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplos resultam da contagem da distribuição de focos de núcleos de imunostainingHP1a. A primeira barra representa a contagem dos núcleos do tipo selvagem (wt), como na Figura 1. A segunda barra representa uma cepa mutante que afeta essa distribuição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagem de microscopia confocal representativa da imunostaining da glândula salivar com anticorpoS H3K9me3 do tipo selvagem (wt). a) DNA (sinal de ciano), H3K9me3 (sinal magenta) e barra de escala de fusão de 100 μm. Em imunostaining para H3K9me3.A coluna direita mostra uma imagem ampliada de um único núcleo com uma barra de escala de 5 μm. b) um núcleo com distribuição focal. c) distribuição de três focos. Ambos os núcleos estão marcados com uma linha branca tracejada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A função celular dos organismos eucarióticos pode definir a estrutura 3D dentro do núcleo, que é suportada por interações entre diferentes proteínas com cromatina e várias moléculas, incluindo RNA. Nos últimos três anos, os condensados biológicos que tiveram relevância, incluindo a heterocromatina, assumiram um papel fundamental na determinação da separação de fases promovendo a distinta organização espacial nuclear da cromatina ativa e repressiva 16,17,18.
A heterocromatina é essencial para preservar as funções celulares e a identidade. Anteriormente, pensava-se que essas áreas densas não estavam transcritas. No entanto, agora que temos tecnologias mais poderosas, podemos ver que a heterocromatina não é apenas transcrita, mas também um processo fundamental para manter o andaime do núcleo e é sensível aos processos de desenvolvimento oupatológicos 12,19. Além disso, certos genes incorporados na heterocromatina pericêntrica precisam de um ambiente heterocromático para funcionar corretamente. Mutações HP1a reduzem a expressão da luz e dos genes laminados, que foram os primeiros a serem descobertos19. Esses genes são essenciais para a sobrevivência do organismo e são encontrados em blocos de heterocromatina. Como resultado, apesar de sua capacidade de induzir o silenciamento, este componente genoma peculiar tem o potencial de ser muito dinâmico20. Em um complexo equilíbrio entre tipos de cromatina e difusa que podem ser controlados por vários contextos biológicos, também existem proteínas associadas à heterocromatina, como o HP1a. Também foi recentemente sugerido que as propriedades de separação de fases são mostradas pela montagem dos condensados heterocromatinas21,22.
Há uma série de artigos em que os autores realizaram imunostaining integral de núcleos de glândulas salivares Drosophila usando protocolos diferentes e às vezes mais simples23,24. Neste caso, adaptamos um protocolo descrito pela primeira vez em C. elegans25, e posteriormente usado em glândulas salivares de Drosophila por vários grupos26,27,28,29 e combinado com o uso de microscopia confocal e organismos mutantes. Este protocolo também permite a visualização de diferentes tipos de proteínas, incluindo fatores de transcrição como XPD, XPB e TBP27,mas também proteínas ligadas à heterocromatina, como hp1a e marcas de histona como H3K9me3, que a posiciona como um protocolo para uso amplo neste tecido. Também tem a vantagem de que o tecido pode ser armazenado em um passo intermediário sem afetar a banda cromossomo de politeno.
Este protocolo é confiável e econômico devido ao uso de um anticorpo específico para visualizar a proteína HP1a. O passo crítico neste protocolo é evitar perder as glândulas durante as lavagens e esperar que o tecido se desenteresse. A vantagem do uso das glândulas salivares é que uma visão 3D do núcleo e sua conformação pode ser obtida facilmente, em contraste com a técnica cromossomo politene que requer uma ruptura mecânica da célula e pode danificar a cromatina. Durante a execução deste protocolo, deve-se tomar cuidado especial durante as etapas de lavagem. Se não for cuidadosamente realizado, o tecido quebrará, e não seria possível obter imagens de alta qualidade.
Para avaliar a importância da falta de vinculação do RNA às regiões ou proteínas que estão sendo observadas, é necessário adicionar uma lavagem com buffer C (Buffer B sem EDTA) e adicionar 100 μM de RNase. Esta lavagem deve ser realizada por 1 h a 37 °C, como descrito anteriormente. A lavagem deve ser feita antes da etapa em que as moléculas são adicionadas para observar o DNA (entre as etapas 9.3 e 9.4).
A microscopia confocal pode não parecer uma metodologia muito nova para abordar questões de condensados heterocromatinas25,30, mas tem sido extremamente útil para identificar a deslocalização da proteína HP1a nos núcleos de Dphilrosoa, o que sugere graves problemas na estrutura da cromatina que podem ser avaliados com outras técnicas mais detalhadamente. Apesar de sua limitação, pode ser usado em combinação com microscopia de alta resolução como primeira abordagem para aplicar novas técnicas para esclarecer a atividade biológica que modula o conjunto, controle e funções de condensado heterocromatina31. Algumas dessas novas metodologias que se concentram nas interações moleculares e biofísicas entre heterocromatina, RNA e proteínas associadas à heterocromatina são coletadas a partir deste conjunto de métodos para testar condensados heterocromatinas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Marco Antonio Rosales Vega e Abel Segura por levarem algumas das imagens confocal, Carmen Muñoz para a preparação da mídia e dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui, e Dr. Chris Wood, do LMNA, para aconselhamento sobre o uso dos microscópios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
| 16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
| Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22x22, brand not critical |
| DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
| EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
| EGTA | brand not critical | ||
| Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
| Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
| NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
| NaOH | brand not critical | ||
| PIPES | brand not critical | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |
References
- Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).
- Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
- Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
- Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
- Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
- Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
- Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
- Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039 (2002).
- Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).
- Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
- Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
- Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
- Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
- Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).
- Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
- Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).
- Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
- Strom, A. R., et al.
- Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
- Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
- Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
- Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
- Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
- Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
- Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
- Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).
- Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).
