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Chemistry

डायमंड लाइट सोर्स में XChem सुविधा में कुशल टुकड़ा स्क्रीनिंग प्राप्त करना

Published: May 29, 2021 doi: 10.3791/62414
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2, 1,2,3, 3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,3, 3,5, 1, 1,2,3,4,6
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus, 3Structural Genomics Consortium, University of Oxford, 4Centre for Medicines Discovery, University of Oxford, 5Oxford Protein Informatics Group, Department of Statistics, Oxford University, 6Department of Biochemistry, University of Johannesburg
* These authors contributed equally

Summary

यह पेपर क्रिस्टल-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए पूर्ण XChem प्रक्रिया का वर्णन करता है, जो पहुंच के लिए आवेदन करने और डेटा प्रसार के बाद के सभी चरणों से शुरू होता है।

Abstract

टुकड़ा-आधारित दवा की खोज में, ~ 300 दा से छोटे सैकड़ों या अक्सर हजारों यौगिकों को रासायनिक संस्थाओं की पहचान करने के लिए ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ परीक्षण किया जाता है जिन्हें शक्तिशाली दवा उम्मीदवारों में विकसित किया जा सकता है। चूंकि यौगिक छोटे होते हैं, बातचीत कमजोर होती है, और स्क्रीनिंग विधि इसलिए अत्यधिक संवेदनशील होनी चाहिए; इसके अलावा, संरचनात्मक जानकारी इन हिट को सीसा जैसे यौगिकों में विस्तृत करने के लिए महत्वपूर्ण होती है। इसलिए, प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी हमेशा एक स्वर्ण-मानक तकनीक रही है, फिर भी प्राथमिक स्क्रीन के रूप में व्यापक उपयोग खोजने के लिए ऐतिहासिक रूप से बहुत चुनौतीपूर्ण है।

प्रारंभिक XChem प्रयोगों में प्रदर्शन किया गया 2014 और फिर प्रक्रिया को मान्य करने के लिए अकादमिक और औद्योगिक सहयोगियों के साथ परीक्षण किया. तब से, एक बड़े शोध प्रयास और महत्वपूर्ण बीमटाइम ने नमूना तैयार करने को सुव्यवस्थित किया है, तेजी से अनुवर्ती संभावनाओं के साथ एक टुकड़ा पुस्तकालय विकसित किया है, स्वचालित और अप्राप्य डेटा संग्रह के लिए I04-1 बीमलाइन की क्षमता में सुधार किया है, और डेटा प्रबंधन, विश्लेषण और हिट पहचान के लिए नए उपकरण लागू किए हैं।

XChem अब बड़े पैमाने पर क्रिस्टलोग्राफिक टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए एक सुविधा है, जो पूरे क्रिस्टल-टू-डिपोजिशन प्रक्रिया का समर्थन करता है, और दुनिया भर में अकादमिक और औद्योगिक उपयोगकर्ताओं के लिए सुलभ है। सहकर्मी-समीक्षा किए गए अकादमिक उपयोगकर्ता कार्यक्रम को 2016 के बाद से सक्रिय रूप से विकसित किया गया है, ताकि परियोजनाओं को यथासंभव व्यापक वैज्ञानिक दायरे से समायोजित किया जा सके, जिसमें अच्छी तरह से मान्य और साथ ही खोजपूर्ण परियोजनाएं शामिल हैं। सहकर्मी-समीक्षा प्रस्तावों के लिए द्विवार्षिक कॉल के माध्यम से अकादमिक पहुंच आवंटित की जाती है, और डायमंड के औद्योगिक संपर्क समूह द्वारा मालिकाना काम की व्यवस्था की जाती है। यह वर्कफ़्लो पहले से ही विविध चिकित्सीय क्षेत्रों से सौ से अधिक लक्ष्यों पर नियमित रूप से लागू किया गया है, और प्रभावी रूप से कमजोर बाइंडरों (1% -30% हिट दर) की पहचान करता है, जो दोनों यौगिक डिजाइन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले शुरुआती बिंदुओं के रूप में काम करते हैं और बाध्यकारी साइटों पर व्यापक संरचनात्मक जानकारी प्रदान करते हैं। COVID-2 महामारी के दौरान SARS-CoV-19 लक्ष्यों की निरंतर स्क्रीनिंग द्वारा प्रक्रिया के लचीलेपन का प्रदर्शन किया गया था, जिसमें मुख्य प्रोटीज के लिए 3 सप्ताह का टर्न-अराउंड भी शामिल था।

Introduction

फ्रैगमेंट-बेस्ड ड्रग डिस्कवरी (एफबीडीडी) लीड डिस्कवरी के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली रणनीति है, और 25 साल पहले इसके उद्भव के बाद से, इसने नैदानिक उपयोग के लिए चार दवाएं वितरित की हैं और 40 से अधिक अणुओं को नैदानिक परीक्षणों 1,2,3 के लिए उन्नत किया गया है। टुकड़े छोटे रासायनिक निकाय होते हैं जिनका आणविक भार आमतौर पर 300 दा या उससे कम होता है। उन्हें उनकी कम रासायनिक जटिलता के लिए चुना जाता है, जो उत्कृष्ट भौतिक रासायनिक गुणों के साथ अत्यधिक लिगैंड कुशल अवरोधकों के विकास के लिए अच्छे प्रारंभिक बिंदु प्रदान करते हैं। उनके आकार का मतलब है कि वे बड़ी दवा- या सीसा जैसे यौगिकों के पुस्तकालयों की तुलना में प्रोटीन के बाध्यकारी परिदृश्य का अधिक अच्छी तरह से नमूना लेते हैं, और इस प्रकार हॉट स्पॉट और ख्यात एलोस्टेरिक साइटों को भी प्रकट करते हैं। संरचनात्मक जानकारी के साथ संयुक्त, टुकड़े प्रोटीन और लिगैंड के बीच संभावित आणविक बातचीत का एक विस्तृत नक्शा प्रदान करते हैं। फिर भी, मज़बूती से पता लगाने और उन संस्थाओं को मान्य करना, जो लक्ष्य प्रोटीन से कमजोर रूप से बांधते हैं, सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर), परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), या इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी)4,5जैसे मजबूत और संवेदनशील बायोफिजिकल स्क्रीनिंग विधियों की एक सरणी की आवश्यकता होती है।

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी एफबीडीडी टूलकिट का एक अनिवार्य हिस्सा है: यह कमजोर बाइंडरों की पहचान करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है और आणविक स्तर पर बातचीत के बारे में सीधे संरचनात्मक जानकारी देता है। यह अन्य बायोफिज़िक्स स्क्रीन का पूरक है और आमतौर पर यौगिकों का नेतृत्व करने के लिए टुकड़े हिट की प्रगति के लिए आवश्यक है; इसके लिए उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल सिस्टम की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है कि क्रिस्टलीकरण अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और क्रिस्टल आदर्श रूप से 2.8 ए रिज़ॉल्यूशन से बेहतर हैं।

ऐतिहासिक रूप से, क्रिस्टलोग्राफी को प्राथमिक टुकड़ा स्क्रीन 6,7,8 के रूप में उपयोग करना बहुत मुश्किल रहा है, चाहे वह शिक्षा में हो या उद्योग में। इसके विपरीत, सिंक्रोट्रॉन ने रोबोटिक्स, स्वचालन 9,10,11 और डिटेक्टर प्रौद्योगिकी 12,13 में परिमाण सुधार के क्रम को हासिल किया, और समान रूप से त्वरित कंप्यूटिंग शक्ति और डेटा प्रोसेसिंग14,15,16 के एल्गोरिदम के साथ संयुक्त, पूर्ण विवर्तन डेटासेट को सेकंड में मापा जा सकता है और उनमें से बड़ी संख्या पूरी तरह से अप्राप्य है, जैसा कि लिलीकैट7 में अग्रणी है और बाद में MASSIF17,18 (यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा (ESRF))। इसने सिंक्रोट्रॉन को क्रिस्टल-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग को एक व्यापक उपयोगकर्ता समुदाय के लिए सुलभ प्राथमिक स्क्रीन के रूप में बनाने के लिए अत्यधिक सुव्यवस्थित प्लेटफार्मों को विकसित करने के लिए प्रेरित किया (डायमंड में एक्सकेम; ईएमबीएल/ईएसआरएफ19 में क्रिस्टलडायरेक्ट; हेल्महोल्ट्ज़-ज़ेंट्रम बर्लिन20 में बेसी; MaxIV21 पर फ्रैगमैक्स)।

यह पेपर उन प्रोटोकॉल का दस्तावेजीकरण करता है जो एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए एक्सकेम प्लेटफॉर्म का गठन करते हैं, नमूना तैयार करने से लेकर 3 डी-मॉडलिंग हिट के अंतिम संरचनात्मक परिणामों तक। पाइपलाइन (चित्रा 1) क्रिस्टल पहचान22 के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करने की आवश्यकता है,23 भिगोने, और 24 कटाई, साथ ही डेटा प्रबंधन सॉफ्टवेयर25 और टुकड़े 26 है कि अब व्यापक रूप से समुदाय में उपयोग किया जाता है की पहचान करने के लिए एक एल्गोरिथम दृष्टिकोण. क्रिस्टल कटाई तकनीक अब एक विक्रेता द्वारा बेची जाती है (सामग्री की तालिकादेखें), और उपकरणों की खुली उपलब्धता ने अन्य सिंक्रोट्रॉन को समकक्ष प्लेटफॉर्म21 स्थापित करने के लिए उन्हें अनुकूलित करने की अनुमति दी है। चल रही परियोजनाएं फ्रैगलिसिस प्लेटफॉर्म27 के माध्यम से डेटा विश्लेषण, मॉडल पूर्णता और डेटा प्रसार को संबोधित करती हैं। नमूना तैयार करने की प्रयोगशाला बीमलाइन I04-1 के निकट है, सैकड़ों जमे हुए नमूनों को बीमलाइन में स्थानांतरित करने के रसद को सरल बनाती है और I04-1 पर समर्पित बीमटाइम अभियान का मार्गदर्शन करने के लिए तेजी से एक्स-रे प्रतिक्रिया की अनुमति देता है।

XChem डायमंड के उपयोगकर्ता कार्यक्रम का एक अभिन्न अंग है, जिसमें प्रति वर्ष दो कॉल (अप्रैल और अक्टूबर की शुरुआत में) हैं। सहकर्मी-समीक्षा प्रक्रिया को शिक्षाविदों और उद्योग से दवा की खोज में विशेषज्ञों के परामर्श से परिष्कृत किया गया है। एक मजबूत विज्ञान के मामले के साथ, प्रस्ताव प्रक्रिया28 के लिए आवेदकों को न केवल क्रिस्टल प्रणाली की तत्परता का आत्म-मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है, बल्कि जैव रासायनिक और ऑर्थोगोनल बायोफिजिकल तरीकों में उनकी विशेषज्ञता और अनुवर्ती रसायन विज्ञान के माध्यम से स्क्रीनिंग हिट की प्रगति करने की क्षमता भी होती है। बहु-विषयक उपयोगकर्ता समुदाय को समायोजित करने के लिए पहुंच के तरीके भी विकसित हुए हैं:

टियर 1 (एकल परियोजना ) खोजपूर्ण चरण में परियोजनाओं के लिए है और हिट सत्यापन उपकरण (बायोफिज़िक्स या जैव रासायनिक उपकरण) और अनुवर्ती रणनीतियों की आवश्यकता नहीं है। यदि स्वीकार किया जाता है, तो परियोजना को कम संख्या में बीमटाइम शिफ्ट दी जाती है, जो अवधारणा के प्रमाण के लिए पर्याप्त है।

टियर 2 (एकल परियोजना) अच्छी तरह से मान्य परियोजनाओं के लिए है और इसके लिए डाउनस्ट्रीम टूल और अनुवर्ती रणनीतियों की आवश्यकता होती है। यदि स्वीकार किया जाता है, तो परियोजना को पूर्ण टुकड़ा स्क्रीनिंग अभियान के लिए पर्याप्त बीमटाइम आवंटित किया जाता है। एकल परियोजनाएं (टियर 1 या टियर 2) आवंटन अवधि के 6 महीने (अप्रैल से सितंबर या अक्टूबर से मार्च) के भीतर पूरी की जानी हैं।

ब्लॉक आवंटन समूह ( बीएजी) समूहों और परियोजनाओं के एक संघ के लिए है, जहां एक स्पष्ट अनुवर्ती पाइपलाइन के साथ-साथ बीएजी के भीतर एक मजबूत लक्ष्य चयन और प्राथमिकता प्रक्रिया है। बीएजी में कम से कम एक पूरी तरह से एक्सकेम प्रशिक्षित विशेषज्ञ (सुपरयूज़र) होना चाहिए, जो डायमंड कर्मचारियों के साथ उनकी गतिविधियों का समन्वय करता है और बीएजी सदस्यों को प्रशिक्षित करता है। बीमटाइम शिफ्ट की आवंटित संख्या को बीएजी में वैज्ञानिक रूप से मजबूत परियोजनाओं की संख्या से परिभाषित किया गया है और बीएजी की रिपोर्ट के आधार पर प्रति आवंटन अवधि का पुनर्मूल्यांकन किया जाता है। प्रवेश 2 साल के लिए उपलब्ध है।

XChem प्रयोग को तीन चरणों में विभाजित किया गया है, उनमें से प्रत्येक के लिए एक निर्णय बिंदु के साथ: विलायक सहिष्णुता परीक्षण, प्री-स्क्रीन और मुख्य स्क्रीन (चित्रा 2)। विलायक सहिष्णुता परीक्षण भिगोने वाले मापदंडों को परिभाषित करने में मदद करता है, विलायक की मात्रा (डीएमएसओ, एथिलीन ग्लाइकॉल, या यदि आवश्यक हो तो अन्य क्रायोप्रोटेक्टेंट) क्रिस्टल सिस्टम सहन कर सकता है और कितने समय तक। विलायक सांद्रता आमतौर पर कम से कम दो समय बिंदुओं पर 5% -30% से होती है। विवर्तन डेटा एकत्र किया जाता है और क्रिस्टल प्रणाली के आधार विवर्तन की तुलना में; यह निम्नलिखित चरण के लिए भिगोने वाले मापदंडों का निर्धारण करेगा। प्री-स्क्रीन के लिए, विलायक परीक्षण में निर्धारित शर्तों का उपयोग करके 100-150 यौगिकों को भिगोया जाता है, और इसका उद्देश्य यह पुष्टि करना है कि क्रिस्टल उन स्थितियों में यौगिकों को सहन कर सकते हैं। यदि आवश्यक हो, तो क्रायोप्रोटेक्टेंट को बाद में पहले से ही टुकड़ों वाली बूंदों में जोड़ा जाता है। सफलता का मानदंड यह है कि 80% या अधिक क्रिस्टल अच्छी और सुसंगत गुणवत्ता के विवर्तन डेटा प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रूप से जीवित रहते हैं; यदि यह विफल रहता है, तो भिगोने की स्थिति को आमतौर पर सोखने के समय या विलायक एकाग्रता को बदलकर संशोधित किया जाता है। एक सफल पूर्व स्क्रीन के बाद, प्रयोग के लिए चुना यौगिकों के बाकी अंतिम मापदंडों का उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है.

डीएसआई-तैयार लाइब्रेरी ( सामग्री की तालिकादेखें) को जानबूझकर तैयार रसायन विज्ञान29 का उपयोग करके तेजी से अनुवर्ती प्रगति की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया था और यह सुविधा का वर्कहॉर्स लाइब्रेरी रहा है। यह डीएमएसओ में 500 एमएम की एकाग्रता पर उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध है। अकादमिक उपयोगकर्ता डीएमएसओ में 100-500 एमएम की सांद्रता पर सहयोगियों (कुल 2,000 से अधिक यौगिकों) द्वारा प्रदान किए गए अन्य पुस्तकालयों तक भी पहुंच सकते हैं (एक पूरी सूची वेबसाइट28 पर पाई जा सकती है)। समग्र संग्रह का अधिकांश हिस्सा एथिलीन ग्लाइकॉल में भी उपलब्ध है, क्रिस्टल सिस्टम के लिए जो डीएमएसओ को बर्दाश्त नहीं करते हैं। उपयोगकर्ता अपने स्वयं के पुस्तकालय भी ला सकते हैं, बशर्ते वे ध्वनिक तरल हैंडलिंग सिस्टम के साथ संगत प्लेटों में हों ( सामग्री की तालिकादेखें)।

प्रयोग के सभी तीन चरणों (विलायक लक्षण वर्णन, पूर्व स्क्रीन या पूर्ण स्क्रीन) के लिए, निम्नलिखित नमूना तैयार करने की प्रक्रियाओं (चित्रा 3) समान हैं: इमेजिंग और TeXRank22 के साथ क्रिस्टलीकरण बूँदें के लक्ष्यीकरण के माध्यम से यौगिक वितरण स्थान का चयन; विलायक और यौगिकों दोनों के लिए ध्वनिक तरल वितरण प्रणाली का उपयोग करके बूंदों में वितरण23; क्रिस्टल शिफ्टर24 का उपयोग करके क्रिस्टल की कुशल कटाई; और बीमलाइन डेटाबेस (ISPyB) में नमूना जानकारी अपलोड करना। प्रयोग डिजाइन और निष्पादन के लिए वर्तमान इंटरफ़ेस एक एक्सेल-आधारित एप्लिकेशन (SoakDB) है, जो प्लेटफ़ॉर्म के विभिन्न उपकरणों के लिए आवश्यक इनपुट फ़ाइलें उत्पन्न करता है, और SQLite डेटाबेस में सभी परिणामों को ट्रैक और रिकॉर्ड करता है। नमूनों को ट्रैक करने में मदद करने के लिए पूरी प्रक्रिया में विभिन्न चरणों में बारकोड स्कैनर का उपयोग किया जाता है और इस डेटा को डेटाबेस में जोड़ा जाता है।

विवर्तन डेटा बीमलाइन I04-1 पर समर्पित बीमटाइम का उपयोग करके अनअटेंडेड मोड में एकत्र किए जाते हैं। दो केन्द्रित मोड उपलब्ध हैं, अर्थात्, ऑप्टिकल और एक्स-रे आधारित17. सुई और रॉड के आकार के क्रिस्टल के लिए, एक्स-रे केंद्रित करने की सलाह दी जाती है, जबकि चंकियर क्रिस्टल आमतौर पर ऑप्टिकल मोड का समर्थन करते हैं, जो तेज है और इसलिए, आवंटित बीमटाइम में अधिक नमूने एकत्र करने की अनुमति देता है। क्रिस्टल के रिज़ॉल्यूशन के आधार पर (प्लेटफ़ॉर्म में प्रवेश करने से पहले स्थापित) डेटा संग्रह या तो 60 s या 15 s कुल एक्सपोज़र हो सकता है। विलायक परीक्षण चरण के दौरान डेटा संग्रह आमतौर पर सूचित करता है कि कौन सा संयोजन बीमलाइन I04-1 के प्रदर्शन के साथ सबसे अच्छा काम करेगा।

डेटा विश्लेषण की बड़ी मात्रा को XChemExplorer (XCE)25 के माध्यम से प्रबंधित किया जाता है, जिसका उपयोग PanDDA26 का उपयोग करके हिट पहचान चरण को लॉन्च करने के लिए भी किया जा सकता है। एक्ससीई एक डेटा प्रबंधन और वर्कफ़्लो टूल है जो प्रोटीन-लिगैंड संरचनाओं (चित्रा 4) के बड़े पैमाने पर विश्लेषण का समर्थन करता है; यह डायमंड लाइट सोर्स (DIALS16, Xia214, AutoPROC30, और STARANISO31) पर एकत्र किए गए डेटा से किसी भी ऑटो-प्रोसेसिंग परिणाम को पढ़ता है और डेटा गुणवत्ता और संदर्भ मॉडल की समानता के आधार पर परिणामों में से एक का स्वतः चयन करता है। यह महत्वपूर्ण है कि मॉडल XChem स्क्रीनिंग के लिए उपयोग की जाने वाली क्रिस्टल प्रणाली का प्रतिनिधि है, और इसमें सभी पानी या अन्य विलायक अणुओं, साथ ही सभी सह-कारक, लिगैंड और केवल विलायक से लथपथ क्रिस्टल में दिखाई देने वाले वैकल्पिक अनुरूपताओं को शामिल करना चाहिए। इस संदर्भ मॉडल की गुणवत्ता मॉडल निर्माण और शोधन चरण के दौरान आवश्यक कार्य की मात्रा को सीधे प्रभावित करेगी। PanDDA का उपयोग सभी डेटा का विश्लेषण करने और बाध्यकारी साइटों की पहचान करने के लिए किया जाता है। यह एक संदर्भ संरचना के लिए संरचनाओं संरेखित, सांख्यिकीय नक्शे की गणना, घटनाओं की पहचान करता है, और घटना नक्शे 26,32 की गणना करता है. पांवड़ा प्रतिमान में, पूर्ण क्रिस्टलोग्राफिक मॉडल का निर्माण करना न तो आवश्यक है और न ही वांछनीय; क्या मॉडलिंग की जानी चाहिए केवल प्रोटीन जहां एक टुकड़ा बाध्य है (बाउंड-स्टेट मॉडल) का दृश्य है, इसलिए ध्यान केवल घटना मानचित्र32 के अनुसार लिगैंड और आसपास के अवशेषों / विलायक अणुओं के निर्माण पर होना चाहिए।

Protocol

1. परियोजना प्रस्ताव प्रस्तुत करना

  1. प्रस्ताव सामग्री: चूंकि XChem कार्यक्रम ओवरसब्सक्राइब किया गया है, इसलिए सहकर्मी-समीक्षा पास करने के लिए प्रस्ताव में पूरी तरह से और पूरी जानकारी महत्वपूर्ण है।
    1. मामला बनाओ! लक्ष्य के महत्व को प्रस्तुत करें और इसे व्यापक संदर्भ में रखें।
      1. टुकड़ा स्क्रीनिंग अभियान के बाद रणनीति को स्पष्ट करें: हिट को मान्य करने के लिए ऑर्थोगोनल तरीके और उन्हें कैसे प्रगति करें। यदि आवश्यक हो, तो सहयोग को पंक्तिबद्ध करें।
      2. गहन प्रयोगशाला और डेटा विश्लेषण भाग के कारण, अग्रिम में एक अनुभवी क्रिस्टलोग्राफर को असाइन करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
      3. तकनीकी भिन्नता को खत्म करने के लिए एक मजबूत क्रिस्टल प्रणाली महत्वपूर्ण है और उपयोगकर्ताओं को उन आवश्यक बिंदुओं को संबोधित करना चाहिए।
        1. सुनिश्चित करें कि क्रिस्टलीकरण की स्थिति 30 माइक्रोन (या उससे कम) की जलाशय मात्रा और 200-500 एनएल के बीच एक बूंद आकार के साथ मंच पर उपयोग के लिए उपयुक्त प्लेटों में समान विवर्तनीय गुणवत्ता वाले क्रिस्टल के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बूंदों का उत्पादन करती है। आदर्श रूप से, एक प्लेट में 50% से अधिक बूंदों में कम से कम 35 माइक्रोन आकार33 के क्रिस्टल होंगे।
        2. क्रिस्टल (2.6 Å या बेहतर) की लगातार विवर्तन गुणवत्ता सुनिश्चित करें।
        3. टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए क्रिस्टल प्रणाली की उपयुक्तता की जांच करें, जिसमें क्रिस्टल पैकिंग और ज्ञात साइटों की पहुंच शामिल है। उन साइटों में बंधे अणु के पिछले सबूत अक्सर आश्वस्त होते हैं।

2. यात्रा की तैयारी

  1. साइट पर क्रिस्टलीकरण के लिए क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल का स्थानांतरण।
    1. जलाशय समाधान के 2 x 50 एमएल प्रदान करें, उपयोग के लिए तैयार।
    2. क्रिस्टलीकरण के लिए आवश्यक एकाग्रता पर प्रोटीन समाधान प्रदान करें, 30-50 माइक्रोन के विभाज्य में उपयोग करने के लिए तैयार।
    3. प्रोटीन बफर समाधान के 10 एमएल प्रदान करें।
    4. बीज स्टॉक प्रदान करें (भले ही क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल में आवश्यक न हो)।
      नोट: सीडिंग क्रिस्टलीकरण प्रजनन क्षमता का पक्षधर है और न्यूक्लियेशन समय33 को गति देता है।
    5. XChem वेबसाइट28 पर उपलब्ध क्रिस्टलीकरण सूचना प्रपत्र को पूरा करें।
    6. XChem वेबसाइट पर उपलब्ध शिपिंग फॉर्म में भंडारण जानकारी प्रदान करें28.
  2. NoMachine स्थापित करें और डायमंड (https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html) के लिए एक दूरस्थ डेस्कटॉप सेट करें।
  3. एक विशेषज्ञ क्रिस्टलोग्राफर या XChem सपोर्ट स्टाफ के परामर्श से एक अच्छा संदर्भ मॉडल उत्पन्न और स्थानांतरित करें।

3. टुकड़ा स्क्रीनिंग प्रयोग

  1. यौगिक वितरण स्थान को परिभाषित करना।
    1. इमेजिंग क्रिस्टलीकरण प्लेटें।
      1. क्रिस्टल प्लेट इमेजर्स में प्रयोग के लिए आवश्यक सभी क्रिस्टल प्लेटों (सामग्री की तालिकादेखें) की छवि बनाएं ( सामग्री की तालिकादेखें)। इमेजर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, प्लेट प्रकार के लिए सही निर्देशिका में प्लेट नाम (ओं) को निम्नलिखित प्रारूप में उत्पन्न करें प्रस्ताव Number_Plate संख्या।
      2. बारकोड प्रिंट करें (प्लेट नाम पर राइट क्लिक करें और मेनू से चुनें), उन्हें पंक्ति अक्षरों से प्लेट के विपरीत दिशा में रखें, प्लेट को लोड पोर्ट में रखें जिसमें बारकोड उपयोगकर्ता से दूर हो।
      3. इमेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, लोड पोर्ट को स्कैन करें, प्लेटों पर राइट क्लिक करें और फिर छवि प्लेट्स का चयन करें।
      4. एक बार इमेजिंग पूरा हो गया है, इमेजर से प्लेटों को हटा दें.
    2. क्रिस्टल और यौगिक स्थान चुनना
      नोट: क्रिस्टलीकरण बूंदों की छवियों को क्रिस्टल22 की संभावित उपस्थिति से बूंदों को रैंक करने के लिए टेक्सरैंक के टेक्स्टन-आधारित एल्गोरिथ्म रैंकर का उपयोग करके लुइगी पाइपलाइन के भीतर संसाधित किया जाता है। यह लगभग 10 मिनट लगते हैं और छवियों तो TexRank में उपलब्ध हो जाएगा.
      1. पीसी से TeXRank खोलें और नीचे दाईं ओर सूची से या ऊपर बाईं ओर बॉक्स में बारकोड टाइप करके क्रिस्टल ट्रे का चयन करें।
      2. सही इमेजर प्रारूप और एकल अच्छी तरह से दृश्य का चयन करें। ड्रॉप छवियों के माध्यम से ले जाएँ और जब वहाँ एक क्रिस्टल है कि एक प्रयोग में उपयोग करने के लिए उपयुक्त है, सही क्रिस्टल से दूर क्लिक करें, लेकिन ड्रॉप के अंदर-उद्देश्य विलायक / यौगिकों को जोड़ने के लिए ड्रॉप में जहां लक्षित करने के लिए है, तो सीधे क्रिस्टल23 हिट करने के लिए नहीं करना चाहते हैं.
      3. पूरी प्लेट के माध्यम से जारी रखें और एक बार समाप्त होने के बाद इको 1 लक्ष्य बटन का चयन करें; प्रासंगिक यात्रा के तहत क्रिस्टल लक्ष्य निर्देशिका में सहेजें। फ़ाइल का नाम न बदलें।
      4. किसी भी अतिरिक्त प्लेटों के लिए दोहराएं।
  2. यौगिक वितरण
    1. यौगिक वितरण के लिए फ़ाइलें बनाना
      1. SoakDB में, लाइब्रेरी/सॉल्वेंट टेबल में लाइब्रेरी चयन या विलायक जानकारी दर्ज करें।
      2. लक्षित क्रिस्टल की सूची में ड्रॉप वॉल्यूम और लोड दर्ज करें।
      3. आवश्यक बैच जनरेट करें।
      4. सोख पैरामीटर दर्ज करें। Calculate पर क्लिक करें और फिर Export Pending बटन पर क्लिक करें। विलायक के लिए, तालिका में विभिन्न सांद्रता जोड़ें। यह ध्वनिक डिस्पेंसर में उपयोग के लिए फ़ाइलें उत्पन्न करता है।
      5. यदि क्रायोप्रोटेक्टेंट का उपयोग कर रहे हैं, तो एकाग्रता दर्ज करें और उसी तरह फाइलें बनाएं।
    2. ध्वनिक डिस्पेंसर का उपयोग करके समाधान वितरित करना ( सामग्री की तालिकादेखें)
      1. स्रोत प्लेट (यौगिकों या विलायक / क्रायोप्रोटेक्टेंट) लें और 1,000 x ग्राम पर 2 मिन के लिए अपकेंद्रित्र में प्लेट स्पिन।
      2. यदि विलायक या क्रायोप्रोटेक्टेंट का वितरण करते हैं, तो 384PP प्लेट पर प्रासंगिक कुएं में पिपेट 30 माइक्रोन; एक माइक्रोसील फिल्म के साथ कवर करें और फिर ऊपर के रूप में अपकेंद्रित्र।
      3. सॉफ्टवेयर खोलें; नया चुनें और सही स्रोत वेल प्लेट (384PP, 384LDV, या 1536LDV) और लिक्विड क्लास (DMSO, CP, BP या GP) चुनें। सुनिश्चित करें कि सही प्लेट प्रकार गंतव्य प्लेट के रूप में चुना गया है। फिर कस्टम बॉक्स को चेक करें और जारी रखें।
      4. आयात का चयन करें और प्रासंगिक बैच फ़ाइल चुनें। सॉफ़्टवेयर द्वारा बताए गए अनुसार आयात चरणों को पूरा करें।
      5. वितरण और गंतव्य स्थानों के समाधान की जांच करने के लिए प्लेट मानचित्रों का उपयोग करें।
      6. प्रोटोकॉल चलाएं, संकेतों का पालन करते हुए वे ऊपर आते हैं। स्रोत प्लेट से समाधान (ओं) चुने हुए क्रिस्टल बूंदों में बांटना होगा.
      7. आवश्यक समय के लिए इनक्यूबेटर में थाली स्टोर.
        नोट: इन मापदंडों को विलायक लक्षण वर्णन चरण में निर्धारित किया जाता है, क्रिस्टल विकास तापमान के आधार पर तापमान या तो 4 डिग्री सेल्सियस या 20 डिग्री सेल्सियस होगा और समय आमतौर पर 1 घंटे और 3 घंटे के बीच होता है।
  3. अर्ध-स्वचालित क्रिस्टल कटाई उपकरण का उपयोग करके क्रिस्टल की कटाई (देखें सामग्री की तालिका).
    नोट: यदि क्रायोप्रोटेक्शन की आवश्यकता है, तो नमूनों की कटाई से पहले क्रिस्टल बूंदों पर क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान जोड़ने के लिए चरण 3.2.2 दोहराएं।
    1. कटाई की तैयारी
      1. SoakDB में कटाई के लिए आवश्यक फाइलें तैयार करें। पूछे जाने पर, पुष्टि करें कि भिगोना हो गया है, और बैच पूरा हो गया है।
      2. सही प्रस्ताव संख्या के तहत प्रयोग के लिए आवश्यक पक की संख्या को स्कैन करें।
      3. क्रिस्टल (35 माइक्रोन, 75 माइक्रोन, या 150 माइक्रोन) के लिए उचित आकार छोरों की एक ट्रे का चयन करें. महत्वपूर्ण रूप से, एक लूप आकार चुनें जो क्रिस्टल के आकार से यथासंभव निकटता से मेल खाता हो ताकि बीमलाइन पर स्वचालित केंद्रीकरण को अधिक सटीक बनाया जा सके, पृष्ठभूमि को कम करके डेटा की गुणवत्ता में सुधार किया जा सके और क्रायोप्रोटेक्टेंट की आवश्यकता को समाप्त किया जा सके।
      4. संबंधित सॉफ़्टवेयर खोलें और वर्कफ़्लो टैब खोलें।
      5. सॉफ्टवेयर में पक को स्कैन करें और पहले पक को हाइलाइट करते हुए सूची के शीर्ष पर वापस स्क्रॉल करें।
      6. पक को फोम देवर में रखें और उन्हें तरल नाइट्रोजन से ठंडा करें।
      7. SoakDB से फ़ाइल आयात करें चुनें और फसल के लिए बैच का चयन करें; यह देखने के लिए जांचें कि बैच बाएं हाथ के धारक को सौंपा गया है या नहीं। एक कार्यसूची प्रकट होती है।
      8. क्रिस्टल प्लेट लें, सील हटा दें, और बाएं हाथ के धारक में डालें; प्लेट को पार्किंग की स्थिति में ले जाएं।
    2. कटाई क्रिस्टल
      1. सहज हो जाओ और पहले चयनित अच्छी स्थिति में जाने के लिए वर्कफ़्लो बटन (स्क्रीन एक टच स्क्रीन है) दबाएं।
      2. यदि क्रिस्टल बच गया है, तो क्रिस्टल को लूप में माउंट करें और तरल नाइट्रोजन में डुबकी लगाएं, इसे सूची में पहले पक में 1 स्थान पर रखें।
      3. इंटरफ़ेस से क्रिस्टल के लिए उपयुक्त विवरण का चयन करें (सामान्य, पिघला हुआ, फटा, जेली, या रंगीन)।
      4. यदि ड्रॉप एक यौगिक सोख है, तो यौगिक अवस्था (स्पष्ट, क्रिस्टलीय, अवक्षेपित, खराब वितरण, या चरण पृथक्करण) का विवरण रिकॉर्ड करें।
      5. यदि क्रिस्टल को सफलतापूर्वक माउंट किया गया है, तो माउंटेड का चयन करें अन्यथा विफल चुनें।
      6. प्लेट अगले चयनित कुएं में चली जाएगी। सभी पक पदों को लगातार भरें (यदि क्रिस्टल विफल हो गया है तो एक अंतर न छोड़ें)। वर्कफ़्लो के अंत तक जारी रखें।
      7. वर्कफ़्लो के अंत में, किसी भी अतिरिक्त बैच को लोड करें और क्रम में पक भरना जारी रखें। नए बैच के लिए नया पक शुरू करने की आवश्यकता नहीं है।
    3. कटाई के परिणामों की बारकोड-ट्रैकिंग
      1. एक बार सभी क्रिस्टल काटे जाने के बाद, पक को बारकोड स्कैनर पर ले जाएं, पक और पिन बारकोड को स्कैन करने के लिए धारक में एक-एक करके रखें।
      2. जब यह पूरा हो जाए, तो ढक्कन को पक पर रखें और तरल नाइट्रोजन भंडारण देवर में स्टोर करें।
      3. आउटपुट लोड करा file SoakDB इंटरफेसमध्ये
    4. ISPyB34,35,36 में नमूना जानकारी रिकॉर्ड करना
      1. ISPyB में नमूना डेटा अपलोड करें
        1. SoakDB में, ISPyB के लिए बीमलाइन विज़िट अपडेट को अपडेट करें और ISPyB में अपलोड करने के लिए फ़ाइल बनाने के लिए एक्सपोर्ट पर क्लिक करें।
        2. पोटीन खोलें। लॉगिन करें और निम्नलिखित निर्देशिका dls/labxchem/data/year/lbXXXX-1/processing/lab36/ispyb पर ब्राउज़ करें।
        3. स्क्रिप्ट चलाएँ csv2ispyb (csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv)
          नोट: नमूने अब ISPyB में लोड कर रहे हैं.
      2. पक स्थान और डेटा संग्रह रणनीति रिकॉर्ड करें।
        1. विवरण और पक के स्थान को रिकॉर्ड करें
          नोट: पक के विवरण और स्थान को रिकॉर्ड करना महत्वपूर्ण है ताकि उन्हें स्थित किया जा सके और बीमलाइन पर लोड किया जा सके।
          1. SoakDB में, Pucks लेबल वाला दूसरा टैब खोलें।
          2. शीर्ष के साथ बक्से में विवरण भरें। विशेष रूप से, पक का स्थान (भंडारण देवर और बेंत), अपेक्षित संकल्प और प्रस्ताव संख्या सहित डेटा संग्रह पैरामीटर।
          3. सहेजें बटन पर क्लिक करें और तालिका में सभी पक की एक सूची दिखाई देगी। हाल ही में भरे हुए पक को कॉपी करें।
          4. XChem कतार स्प्रेडशीट (डेस्कटॉप पर शॉर्टकट) खोलें और जानकारी में पेस्ट करें। कोई भी अतिरिक्त प्रासंगिक जानकारी भरें।

4. डेटा संग्रह

नोट: डेटा एक अनअटेंडेड मोड में एकत्र किया जाता है और XChem/beamline टीम द्वारा प्रबंधित किया जाता है।

  1. गलत केंद्रित नमूनों को याद करना।
    नोट: ये आवश्यक हैं जब कुछ नमूनों के लिए डेटा संग्रह के साथ समस्याएँ हुई हैं, सबसे अधिक संभावना तब होती है जब पिन सही ढंग से केंद्रित नहीं होते हैं।
    1. ISPyB में नमूना परिवर्तक दृश्य को देखें, हरे से लाल रंग के स्नातक स्तर की पढ़ाई में ऑटो-संसाधित रिज़ॉल्यूशन द्वारा नमूनों को ग्रेड करने के लिए AP द्वारा रैंक का चयन करें।
    2. किसी भी लाल या पीले नमूने के लिए जाँच करने के लिए नमूने पर क्लिक करें.
      नोट: यह डेटा संग्रह लाएगा।
    3. क्रिस्टल स्नैपशॉट की जांच करें कि क्रिस्टल केंद्रित है या नहीं।
    4. उन सभी को नोट करें जिन्होंने ध्यान केंद्रित नहीं किया है और स्थानीय संपर्क को भेजें जो लापता नमूनों को याद करेंगे।

5. डेटा विश्लेषण

  1. XChemExplorer (XCE)25के माध्यम से डायमंड के ऑटो-प्रोसेसिंग परिणामों को पुनः प्राप्त करना और उनका विश्लेषण करना।
    1. टर्मिनल में, सबफ़ोल्डर प्रोसेसिंग पर जाएं: सीडी /डीएलएस / लैबएक्सकेम / डेटा / वर्ष / विज़िट / प्रोसेसिंग या एक्सकैम बैग के लिए: सीडी /डीएलएस / लैबक्स केम / डेटा / वर्ष / यात्रा / प्रसंस्करण / परियोजना / प्रसंस्करण/।
    2. XChemExplorer खोलने के लिए उपनाम xce का उपयोग करें।
    3. डेटा स्रोत से अद्यतन तालिकाएँ बटन का चयन करें।
    4. अवलोकन टैब के तहत, प्रयोगात्मक डेटा का सारांश है। डेटास्रोत मेनू में दिखाने के लिए कॉलम चुनें विकल्प के साथ अतिरिक्त श्रेणियां जोड़ें।
    5. सेटिंग्स टैब के तहत, डेटा संग्रह निर्देशिका (/dls/i04-1/data/year/visit/visit/) चुनें।
    6. डेटासेट टैब खोलें, लक्ष्य चुनें ड्रॉप-डाउन मेनू चुनें, Get New Results from Auto processing from Datasets ड्रॉप-डाउन मेनू चुनें, और Run पर क्लिक करें।
      नोट: XCE अब ऑटो-प्रोसेसिंग परिणामों के लिए डेटा संग्रह विज़िट को पार्स करेगा। इसे पहली बार चलाए जाने में कुछ समय लग सकता है, जो पार्स किए जा रहे डेटासेट/निर्देशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है।
    7. रिज़ॉल्यूशन, स्पेस ग्रुप और Rmerge की जाँच करके डेटा की स्थिरता और गुणवत्ता की जाँच करें। 2.8 Å रिज़ॉल्यूशन से कम डेटा को शामिल न करें।
      नोट: डिफ़ॉल्ट रूप से, डेटासेट चयन I/sigI, पूर्णता और अद्वितीय प्रतिबिंबों की संख्या से गणना किए गए स्कोर पर आधारित होता है लेकिन अन्य प्रसंस्करण परिणामों को25 के उपयोग के लिए चुना जा सकता है।
    8. अलग-अलग डेटासेट के लिए एक अलग प्रसंस्करण परिणाम का चयन करने के लिए, यदि पसंद किया जाता है, तो नमूना आईडी पर क्लिक करें और वांछित प्रोग्राम/रन चुनें। सभी डेटासेट के लिए प्रोसेसिंग पाइपलाइन बदलने के लिए, प्राथमिकताएं मेनू से प्राथमिकताएं संपादित करें चुनें और डेटासेट चयन तंत्र बदलें।
    9. यदि आवश्यक हो, तो ISPyB37 के माध्यम से डेटा को पुन: संसाधित करें।
    10. यदि किसी नमूने के लिए कोई संसाधित डेटा स्वीकार्य नहीं है, तो आगे के विश्लेषण से बाहर करने में विफल के रूप में लेबल करें।
    11. पूर्ण होने पर, बाद की तालिकाओं में डेटा जोड़ने के लिए डेटासोर्स से अपडेट टेबल्स पर क्लिक करें।
  2. डिंपल38 का उपयोग करके प्रारंभिक मानचित्रों की गणना।
    1. मैप्स टैब खोलें, ड्रॉप-डाउन मेनू से संदर्भ मॉडल चुनें और वांछित डेटासेट का चयन करें और उसके बाद चयनित MTZ फ़ाइलों पर रन डिंपल का चयन करें।
    2. एक्ससीई डायमंड में क्लस्टर पर एक साथ कई डिंपल नौकरियां चलाता है। डिंपल स्टेटस कॉलम के तहत इन नौकरियों की स्थिति का पता लगाएं और डेटासोर्स बटन से अपडेट टेबल्स का उपयोग करके या लिनक्स में क्यूस्टैट कमांड का उपयोग करके रीफ्रेश करें।
    3. एक बार पूरा हो जाने पर, जांचें कि डिंपल रिक्रिस्ट, डिंपल आरफ्री और स्पेस ग्रुप वैल्यू स्वीकार्य हैं या नहीं। यदि आवश्यक हो (उच्च Rfree/गलत स्थान समूह/यूनिट सेल वॉल्यूम में बड़ा अंतर), ऑटो प्रोसेसिंग परिणामों को पहले वर्णित अनुसार बदलें और इन डेटासेट के लिए मानचित्र पीढ़ी दोहराएं।
  3. ग्रेड39, AceDRG40, या phenix.eLBOW41 का उपयोग करके लिगैंड संयम उत्पन्न करना।
    1. वांछित प्रोग्राम (प्राथमिकताएं, प्राथमिकताएं संपादित करें, संयम पीढ़ी कार्यक्रम) का चयन करें और फिर मानचित्र टैब के तहत डेटासेट का चयन करें और उसके बाद मानचित्र और संयम ड्रॉपडाउन से चयनित यौगिकों की सीआईएफ/पीडीबी/पीएनजी फ़ाइल बनाएं।
    2. डेटा स्रोत से अद्यतन तालिकाएँ बटन का उपयोग करके यौगिक स्थिति स्तंभ के अंतर्गत पाए गए इन कार्यों की स्थिति ताज़ा करें.
  4. ग्राउंड स्टेट मॉडल का निर्माण (प्री-रन)
    नोट: ग्राउंड-स्टेट मॉडल शब्द प्रोटीन की संरचना को उसके लिगैंड-मुक्त रूप में दर्शाता है, जैसा कि 100 डेटासेट में देखा गया है (यह संख्या मनमाने ढंग से चुनी गई है)। चूंकि ग्राउंड-स्टेट मॉडल का उपयोग लिगैंड-बाउंड स्टेट के निर्माण के संदर्भ के रूप में किया जाता है, इसलिए पूरे फ्रैगमेंट स्क्रीनिंग अभियान के विश्लेषण से पहले, सभी विलायक और पानी के अणुओं सहित एक सटीक ग्राउंड स्टेट मॉडल बनाना महत्वपूर्ण है। इस चरण में, डीडीए द्वारा चिह्नित सौ पहले उच्चतम रिज़ॉल्यूशन डेटासेट को दिलचस्प घटनाओं (और इस प्रकार संभवतः लिगैंड-मुक्त) की कमी के रूप में चिह्नित किया जाता है, जिसका उपयोग ग्राउंड-स्टेट मीन मैप उत्पन्न करने के लिए किया जाता है, जबकि सबसे कम आरफ्री वाले डेटासेट को शोधन के लिए चुना जाता है। ग्राउंड-स्टेट मीन मैप एक क्रिस्टलोग्राफिक मैप नहीं है, हालांकि, ग्राउंड-स्टेट मॉडल के निर्माण के लिए केवल इस मैप का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।
    1. PanDDAs टैब खोलें और यदि आवश्यक हो तो डेटासोर्स से तालिकाओं को अपडेट करें।
    2. आउटपुट निर्देशिका (/dls/labxchem/data/year/visit/processing/analysis/panddas) को परिभाषित करें।
    3. Pre-run for Ground State Model चुनें और Run पर क्लिक करें।
      नोट: उच्च Rfree और अप्रत्याशित स्थान समूहों वाले डेटासेट को स्वचालित रूप से विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।
    4. उच्च Rfree और अनपेक्षित स्थान समूहों वाले डेटासेट को मैन्युअल रूप से बहिष्कृत करने के लिए, पूरी तरह से अनदेखा करें चुनें.
    5. टर्मिनल विंडो में qstat का उपयोग करके प्री-रन जॉब की स्थिति की जाँच करें।
    6. एक बार पूरा हो जाने पर, बिल्ड ग्राउंड स्टेट मॉडल चुनें और रन पर क्लिक करें।
      नोट: यह कूट को PanDDA माध्य मानचित्र और कूट का उपयोग करके पुन: मॉडलिंग और शोधन के लिए सर्वोत्तम गुणवत्ता वाले डेटासेट से एक संदर्भ मॉडल/2Fo-Fc/Fo-Fc मानचित्रों के साथ खोलेगा। यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि मॉडलिंग के लिए केवल पांडडा माध्य मानचित्र का उपयोग किया जाता है।
  5. PanDDA26 का उपयोग करके हिट की पहचान करना
    1. PanDDA विश्लेषण
      नोट: क्लस्टर पर चलने में कुछ समय लग सकता है यदि बहुत सारे डेटासेट हैं, यूनिट सेल बड़ा है, और असममित इकाई में प्रोटीन की कई प्रतियां हैं।
      1. DLS ऑटो-प्रोसेसिंग परिणामों और प्रारंभिक मानचित्र गणना का विश्लेषण करें के लिए पहले वर्णित चरणों को दोहराएं। मानचित्र गणना के लिए, संदर्भ के रूप में ग्राउंड-स्टेट मॉडल का उपयोग करें: संदर्भ फ़ाइल सूची ताज़ा करें > नया संदर्भ सेट करें और नए डेटा (चरण 6.1-6.3) के लिए आवश्यक लिगैंड संयम उत्पन्न करें।
      2. PanDDAs टैब के अंतर्गत सुनिश्चित करें कि आउटपुट डायरेक्टरी पहले की तरह सेट है और हिट आइडेंटिफिकेशन ड्रॉप-डाउन मेनू से pandda.analyse चलाएँ।
      3. qstat कमांड का उपयोग करके Linux टर्मिनल में कार्य की स्थिति की जाँच करें।
    2. पंडीडीए निरीक्षण - चेकिंग/बिल्डिंग बाइंडिंग इवेंट
      1. XCE में PanDDAs टैब के तहत, PanDDA कंट्रोल पैनल के साथ Coot42 खोलने के लिए हिट आइडेंटिफिकेशन ड्रॉप-डाउन मेनू से pandda.inspect चलाएं।
        नोट: pandda.inspect नियंत्रण कक्ष PanDDA आँकड़ों का सारांश प्रदान करता है और उपयोगकर्ताओं को बाध्यकारी घटनाओं/साइटों के माध्यम से नेविगेट करने की अनुमति देता है। परिणामों की एक सारांश HTML फ़ाइल भी उत्पन्न होती है और अद्यतन HTML का चयन करके निरीक्षण के दौरान अद्यतन किया जा सकता है।
      2. लिगैंड को मॉडल करने के लिए, बाउंड-स्टेट मॉडल में किसी भी बदलाव को खोने से बचने के लिए किसी अन्य ईवेंट पर नेविगेट करने से पहले मर्ज लिगैंड विद मॉडल और सेव मॉडल पर क्लिक करें।
        नोट: केवल अद्यतन और सहेजे गए मॉडल बाद के चरण में शोधन के लिए निर्यात किए जाएंगे।
      3. बाइंडिंग ईवेंट को एनोटेट करने के लिए ईवेंट टिप्पणी फ़ील्ड और बाइंडिंग साइट्स को एनोटेट करने के लिए रिकॉर्ड साइट जानकारी का उपयोग करें.
      4. इवेंट मैप और मॉडल की तुलना के लिए औसत और 2mFo-DFc मैप्स (DIMPLE से) लोड करें।
        1. एक बार जब सभी व्यवहार्य लिगेंड को घटना मानचित्र के आधार पर मॉडल, विलय और सहेजा जाता है, तो pandda.inspect बंद करें।
    3. PanDDA निर्यात और शोधन
      नोट: निम्नलिखित PanDDA निरीक्षण मॉडल को परियोजना निर्देशिका में वापस निर्यात किया जाता है और शोधन का एक प्रारंभिक दौर शुरू किया जाता है। वर्तमान में XCE में PANDDAs टैब के तहत ऐसा करने के लिए दो उपलब्ध पाइपलाइन हैं।
      1. निर्यात नया/सभी/चयनित PANDDA मॉडल शोधन के लिए बाध्य और अनबाउंड मॉडल का एक पहनावा उत्पन्न करता है और Refmac43 के लिए अधिभोग संयम पैरामीटर उत्पन्न करता है।
        नोट: पहनावा मॉडल का उपयोग शोधन के लिए किया जाएगा लेकिन केवल बाउंड-स्टेट मॉडल को कूट में अपडेट किया जाएगा और पीडीबी में जमा किया जाएगा। इस पाइपलाइन का उपयोग कम अधिभोग के टुकड़ों और प्रोटीन मॉडल में महत्वपूर्ण परिवर्तनों वाले डेटासेट के लिए सबसे अच्छा किया जाता है।
      2. BUSTER के साथ NEW/ALL बाउंड-स्टेट मॉडल को परिष्कृत करें, केवल बस्टर44 के साथ बाउंड-स्टेट को परिष्कृत करता है।
        नोट: यह प्रोटीन मॉडल में न्यूनतम परिवर्तन के साथ उच्च अधिभोग लिगैंड/डेटासेट के साथ सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है।
  6. हिट को परिष्कृत करना (परिशोधन के लिए चुने गए सभी डेटासेट अब शोधन टैब में दिखाई देंगे). XCE रिफाइनमेंट कंट्रोल पैनल के साथ Coot खोलने के लिए रिफाइनमेंट ड्रॉप डाउन मेनू से Open COOT - BUSTER Refinement या Open COOT - REFMAC रिफाइनमेंट चुनें।
    1. चुनिंदा नमूने ड्रॉप डाउन (आमतौर पर 3 - शोधन में) से परिष्कृत किए जाने वाले नमूनों की स्थिति का चयन करें और GO पर क्लिक करें।
      नोट: XCE नियंत्रण कक्ष उस श्रेणी के लिए डेटासेट की संख्या का सारांश प्रदान करता है और शोधन आँकड़ों का सारांश प्रदान करते हुए डेटासेट के बीच नेविगेशन की अनुमति देता है।
    2. XCE नियंत्रण कक्ष में लिगैंड विश्वास को एनोटेट करें: 0 - कोई लिगैंड मौजूद नहीं है- टुकड़ा बाध्य नहीं है; 1 - कम आत्मविश्वास- टुकड़ा संभवतः बाध्य है लेकिन विशेष रूप से आश्वस्त नहीं है; 2 - सही लिगैंड, कमजोर घनत्व- उपयोगकर्ता को विश्वास है कि टुकड़ा बाध्य है लेकिन यह कम अधिभोग है / नक्शे के साथ कुछ मुद्दे हैं; 3 - स्पष्ट घनत्व, अप्रत्याशित लिगैंड- मानचित्र स्पष्ट रूप से लिगैंड बाइंडिंग को इंगित करते हैं जो प्रदान की गई रासायनिक संरचना से संबंधित नहीं है; 4 - उच्च आत्मविश्वास- लिगैंड स्पष्ट रूप से बाध्य है।
    3. इस स्तर पर मॉडल में कोई भी आवश्यक परिवर्तन करें और परिष्कृत करें बटन का उपयोग करके आगे शोधन शुरू करें।
    4. सभी शोधन चक्रों पर चलने वाले MolProbity45 विश्लेषण तक पहुँचने के लिए Show MolProbity To-Do List बटन का उपयोग करें।
    5. यदि आवश्यक हो, तो शोधन पैरामीटर जोड़ें, उदाहरण के लिए, अनिसोट्रोपिक तापमान कारकों, जुड़वां डेटा, या अधिभोग शोधन के लिए शोधन पैरामीटर बटन का चयन करके।
      नोट: डेटा प्रोसेसिंग आँकड़े भी शोधन टैब के तहत XCE में प्रदान की जाती हैं और यदि शोधन बस्टर पाइपलाइन के साथ किया जाता है, तो MOGUL विश्लेषण46 सहित बस्टर-रिपोर्ट प्रदान की जाती है।
    6. डेटासेट की स्थिति बदलें क्योंकि यह शोधन टैब के तहत या कूट XCE नियंत्रण कक्ष में मुख्य XCE विंडो दोनों में शोधन के माध्यम से आगे बढ़ता है। जब संतुष्ट हो कि मॉडल लिगैंड के चारों ओर सटीक है और आगे के विश्लेषण के लिए साझा करने के लिए उपयुक्त है, तो स्थिति को कॉम्पकेम रेडी में बदलें। जब शोधन पूरा हो जाए और मॉडल पीडीबी में अपलोड के लिए तैयार हो, तो स्थिति को बदलकर जमा तैयार करें।

6. डेटा जमा करना

नोट: एक टुकड़ा स्क्रीन से सभी डेटासेट और PanDDA इवेंट मैप उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्राउंड-स्टेट मॉडल को समूह जमाओं का उपयोग करके PDB में जमा किया जा सकता है।

  1. हिट पहचान मेनू से इवेंट मैप ->SF चलाकर सभी PanDDA इवेंट मैप्स को MTZ फॉर्मेट में बदलें।
  2. विवरण > संपादन जानकारी का चयन करके लेखकों और विधियों जैसे अतिरिक्त मेटाडेटा प्रदान करें। सभी आवश्यक वस्तुओं को भरें और Save to Database पर क्लिक करें और फिर इस जानकारी को ग्राउंड-स्टेट मॉडल के जमाव के लिए सहेजें। मॉडल की स्थिति को जमा तैयार करने के लिए बदल दिए जाने के बाद ऐसा करें।
  3. डिपोजिशन टैब में, सभी डिपोजिशन रेडी डेटासेट के लिए स्ट्रक्चर फैक्टर mmcif फाइलें जनरेट करने के लिए Prepare mmcif बटन चुनें। यह पूरा होने पर टर्मिनल विंडो में निम्न संदेश दिखाई देगा: wwPDB जमाव के लिए mmcif फ़ाइलें तैयार करना समाप्त हो गया।
  4. इन सभी फ़ाइलों को विज़िट की ग्रुप डिपोजिशन डायरेक्टरी में एक एकल bzipped tar संग्रह में कॉपी करने के लिए कॉपी mmcif बटन का चयन करें।
  5. https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit पर जाएं; उपयोगकर्ता नाम के साथ लॉगिन करें: GroupTester और पासवर्ड: !2016RCSBPDB। एक सत्र बनाएं और समूह जमाव निर्देशिका से ligand-bound.tar.bz2 फ़ाइल अपलोड करें।
  6. लिगैंड-बाउंड संरचनाओं को सफलतापूर्वक जमा करने के बाद, पीडीबी कोड के साथ एक ई-मेल भेजा जाता है। जमाव मेनू से पीडीबी कोड के साथ अद्यतन डीबी का चयन करें; इस ई-मेल से जानकारी को पॉप-अप विंडो में कॉपी और पेस्ट करें और पीडीबी आईडी जोड़ने के लिए अपडेट डेटाबेस पर क्लिक करें।
  7. PanDDA द्वारा उपयोग किए जाने वाले ग्राउंड-स्टेट मॉडल को जमा करने के लिए, XCE में प्रासंगिक PanDDA निर्देशिका का चयन करें और हिट आइडेंटिफिकेशन मेनू से apo->mmcif चलाएं।
    नोट: XCE मनमाने ढंग से जमाव बंडल के लिए मॉडल के रूप में कम Rfree के साथ एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना का चयन करेगा और फिर सभी संरचना कारक mmcif फ़ाइलों को एक फ़ाइल में संकलित करेगा।
  8. जमा टैब में, का चयन करें डेटाबेस में जोड़ें ग्राउंड-स्टेट मॉडल अनुभाग के समूह जमाव के नीचे बटन।
  9. ग्राउंड स्टेट मॉडल के लिए मेटाडेटा दर्ज करें (फिर से डिपोजिशन > एडिट इंफॉर्मेशन का चयन करके), पिछली फाइल लोड करें और डेटाबेस में सेव करें।
  10. ग्राउंड-स्टेट एमएमसीआईएफ फ़ाइल को ग्राउंड-स्टेट मॉडल के ग्रुप डिपोजिशन सेक्शन से एमएमसीआईएफ तैयार करें और पूरा होने पर, उसी सेक्शन से कॉपी एमएमसीआईएफ बटन का चयन करके एमएमसीआईएफ को ग्रुप डिपोजिशन डायरेक्टरी में कॉपी करें।
  11. पहले की तरह, https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit पर जाएं; उपयोगकर्ता नाम के साथ लॉगिन करें: GroupTester और पासवर्ड: !2016RCSBPDB। एक सत्र बनाएं और समूह जमाव निर्देशिका से ground_state_structures.tar.bz2 फ़ाइल अपलोड करें।

Representative Results

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए एक्सकेम पाइपलाइन को बड़े पैमाने पर सुव्यवस्थित किया गया है, जिससे वैज्ञानिक समुदाय (चित्रा 5) द्वारा इसके उत्थान को सक्षम किया जा सकता है। इस प्रक्रिया को 150% और 30% 47,48,49,50,51,52 के बीच और कई दोहराने वाले उपयोगकर्ताओं द्वारा अलग-अलग हिट दर के साथ 150 से अधिक स्क्रीनिंग अभियानों पर मान्य किया गया है। क्रिस्टल सिस्टम जो उपयुक्त नहीं हैं (कम रिज़ॉल्यूशन, क्रिस्टलीकरण में असंगत या विवर्तन गुणवत्ता में) या डीएमएसओ या एथिलीन ग्लाइकॉल को बर्दाश्त नहीं कर सकते हैं, इस प्रक्रिया में जल्दी समाप्त हो जाते हैं, जिससे समय, प्रयास और संसाधन की बचत होती है। सफल अभियान लक्ष्य प्रोटीन पर संभावित इंटरैक्शन साइटों का त्रि-आयामी मानचित्र प्रदान करते हैं; एक विशिष्ट परिणाम SARS-CoV-2 (चित्र 6) के मुख्य प्रोटीज की XChem स्क्रीन है। आमतौर पर, टुकड़ा हिट में पाए जाते हैं: (ए) ब्याज की ज्ञात साइटें, जैसे एंजाइम सक्रिय साइटें और उप-जेब48; (बी) ख्यात एलोस्टेरिक साइटें, उदाहरण के लिए, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन में53; (ग) क्रिस्टल पैकिंग इंटरफेस, आम तौर पर झूठी सकारात्मक (चित्रा 6) के रूप में माना जाता है। यह संरचनात्मक डेटा आम तौर पर विलय, लिंकिंग, या सीसा की तरह छोटे अणुओं 1,3 में बढ़ती टुकड़ा हिट के लिए एक आधार प्रदान करता है.

Figure 1
चित्र 1: XChem पाइपलाइन। मंच नमूना तैयारी, डेटा संग्रह, और हिट पहचान के माध्यम से परियोजना प्रस्ताव से योजनाबद्ध रूप से प्रतिनिधित्व किया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्क्रीनिंग रणनीति। वर्कफ़्लो प्रत्येक मील के पत्थर के उद्देश्य, प्रयोग की आवश्यकताओं और निर्णय बिंदुओं को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नमूना तैयारी वर्कफ़्लो। नमूना तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों को SQLite डेटाबेस में दर्ज किए जा रहे प्रत्येक चरण की जानकारी के साथ दर्शाया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक्ससीई का उपयोग कर डेटा विश्लेषण। डेटा विश्लेषण में महत्वपूर्ण चरणों को प्रासंगिक सॉफ़्टवेयर पैकेजों के साथ वर्कफ़्लो आरेख द्वारा दर्शाया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: XChem उपयोगकर्ता कार्यक्रम का विकास: चार्ट 2015 में BAGs के निर्माण और 2019 में BAGs के निर्माण और 2020 में COVID-19 महामारी के माध्यम से मंच के लचीलेपन के साथ 2019 से 2020 तक उपयोगकर्ता कार्यक्रम के उत्थान और समेकन को प्रदर्शित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: XChem टुकड़ा स्क्रीन के प्रतिनिधि परिणाम। SARS-CoV2 मुख्य प्रोटीज (Mप्रो) डिमर को सतह में पीले रंग में दिखाए गए सक्रिय साइट हिट, मैजेंटा में दिखाए गए ख्यात एलोस्टेरिक हिट और हरे रंग में दिखाए गए सतह/क्रिस्टल-पैकिंग कलाकृतियों के साथ दर्शाया गया है। यह आंकड़ा समूह जमाव G_1002156 से चिमेरा और एमप्रो पीडीबी प्रविष्टियों का उपयोग करके बनाया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस पत्र में उल्लिखित प्रक्रिया को उपयोगकर्ता समुदाय द्वारा बड़े पैमाने पर परीक्षण किया गया है और यहां वर्णित प्रोटोकॉल की अनुकूलन क्षमता आमतौर पर मंच पर सामना की जाने वाली विभिन्न प्रकार की परियोजनाओं को संभालने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, क्रिस्टल प्रणाली की कुछ पूर्व-आवश्यकताएं आवश्यक हैं।

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग करके किए गए किसी भी टुकड़े स्क्रीनिंग अभियान के लिए, एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत क्रिस्टल प्रणाली महत्वपूर्ण है। चूंकि मानक XChem प्रोटोकॉल में सीधे क्रिस्टल ड्रॉप में टुकड़े को जोड़ना शामिल है, अनुकूलन को क्रिस्टल की कुल संख्या के बजाय उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल युक्त बूंदों की संख्या पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए। यदि बूंदों में कई क्रिस्टल होते हैं, तो वे प्रभावी रूप से बेमानी होते हैं, हालांकि कटाई प्रक्रिया को कम कर सकते हैं। इसके अलावा, क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल को गृह संस्थान से ऑनसाइट सुविधाओं में स्थानांतरित करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह आम तौर पर सबसे अच्छा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य न्यूक्लियेशन54 को बढ़ावा देने के लिए क्रिस्टल बोने का उपयोग कर हासिल की है, और, इसलिए, एक अच्छा अभ्यास उपयोगकर्ताओं को उनके प्रोटीन और क्रिस्टलीकरण समाधान के साथ बीज स्टॉक प्रदान करने के लिए है.

अच्छा यौगिक घुलनशीलता और समर्थन सुनिश्चित करने के लिए, कमजोर टुकड़ों के बंधन को चलाने के उद्देश्य से उच्च भिगोने वाली सांद्रता, कार्बनिक सॉल्वैंट्स, विशेष रूप से डीएमएसओ और एथिलीन ग्लाइकॉल में टुकड़े पुस्तकालय प्रदान किए जाते हैं। दो अलग-अलग सॉल्वैंट्स का प्रावधान उपयोगकर्ताओं को क्रिस्टल के लिए एक विकल्प देता है जो डीएमएसओ को बिल्कुल भी बर्दाश्त नहीं करते हैं, या जहां यह ब्याज की साइट में टुकड़ों के बंधन को रोकता है। उपयोगकर्ता जलीय बफर में वैकल्पिक पुस्तकालयों की आपूर्ति कर सकते हैं: यौगिक अच्छी तरह से वितरित होंगे बशर्ते वे पूरी तरह से भंग हो जाएं और तरल वितरण रोबोट के साथ संगत प्लेटों में स्वरूपित हों।

उन परियोजनाओं के लिए जहां एक उपयुक्त कार्बनिक विलायक ढूंढना संभव नहीं है जो पुस्तकालय को घुलनशील करेगा और क्रिस्टल प्रणाली द्वारा सहन किया जाएगा, एक वैकल्पिक प्रक्रिया सूखे यौगिकों का उपयोग करना है जैसा कि BESSY55 में स्थापित किया गया है।

समुदाय में, उच्च नमक सांद्रता वाले क्रिस्टलीकरण स्थितियों में उगाए गए क्रिस्टल में यौगिकों को भिगोने में सक्षम होने के बारे में एक लंबे समय से सवाल है। व्यावहारिक रूप से, कटाई के चरण में यौगिकों की अधिक वर्षा और नमक क्रिस्टल का तेजी से गठन देखा जाता है, जो कटाई क्षेत्र के आसपास आर्द्र वातावरण को लागू करके कम हो जाता है। आम तौर पर, उच्च नमक क्रिस्टलीकरण स्थितियों से क्रिस्टल सिस्टम में स्क्रीनिंग अभियान कम नमक की स्थिति के लिए एक तुलनीय हिट दर देते हैं।

XChem प्रक्रिया के प्रारंभिक चरण (विलायक सहिष्णुता परीक्षण और प्री-स्क्रीन) अपेक्षाकृत छोटे पैमाने पर और त्वरित प्रयोग हैं, लेकिन परियोजना के लिए स्पष्ट जाने / सबसे दर्दनाक रूप से, वैकल्पिक क्रिस्टल सिस्टम को खोजने की आवश्यकता होगी यदि न तो विलायक को सहन किया जाता है, या प्री-स्क्रीन परिणाम बहुत कम हिट दर में होता है। इसके विपरीत, यदि वे सफल होते हैं, तो परिणाम सीधे स्क्रीनिंग प्रयोग के लिए उपयोग करने के लिए भिगोने की स्थिति और डेटा संग्रह के लिए सर्वोत्तम रणनीति को सूचित करते हैं। चूंकि डेटा की गुणवत्ता, विशेष रूप से रिज़ॉल्यूशन, हिट पहचान और विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रॉन घनत्व की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा, इसका उद्देश्य उच्चतम संभव यौगिक एकाग्रता पर सोखना है जिसका विवर्तन गुणवत्ता पर हानिकारक प्रभाव नहीं पड़ता है (अधिकांश डेटासेट (~ 80%) 2.8 ए या बेहतर के संकल्प के लिए विवर्तन)।

डेटा विश्लेषण प्रक्रिया को XChemExplorer के भीतर सुव्यवस्थित किया गया है, जो कमजोर बाइंडरों का पता लगाने के लिए PanDDA सॉफ़्टवेयर पर निर्भर करता है और उपयोगकर्ताओं को स्क्रीनिंग अभियान के परिणामों की शीघ्रता से कल्पना और समीक्षा करने की अनुमति देता है। XChemExplorer प्रत्येक पैकेज (यानी, CC1/2 = 0.3) के लिए मानक विधि द्वारा निर्धारित रिज़ॉल्यूशन सीमाओं के साथ डायमंड (DIALS16, autoPROC30, STARANISO31, और Xia214) पर उपलब्ध पैकेज से डेटा प्रोसेसिंग परिणाम आयात करता है। डिफ़ॉल्ट रूप से, डेटासेट चयन I/sigI, पूर्णता, और कई अद्वितीय प्रतिबिंबों से गणना किए गए स्कोर पर आधारित होता है, लेकिन विशिष्ट प्रसंस्करण परिणामों को विश्व स्तर पर या व्यक्तिगत नमूनों के लिए उपयोग के लिए चुना जा सकता है25. डेटा को पंडडा द्वारा विश्लेषण से भी बाहर रखा गया है, जिसमें रिज़ॉल्यूशन, आरफ्री, और संदर्भ और लक्ष्य डेटा के बीच यूनिट सेल वॉल्यूम में अंतर (डिफ़ॉल्ट क्रमशः 3.5 ए, 0.4 और 12% हैं) शामिल हैं, ताकि खराब विवर्तन, गलत केंद्रित, या गलत अनुक्रमित क्रिस्टल विश्लेषण को प्रभावित न करें।

PanDDA एल्गोरिथ्म आंशिक अधिभोग लिगेंड का पता लगाने के लिए एक टुकड़ा अभियान के दौरान एकत्र किए गए डेटासेट की पर्याप्त संख्या का लाभ उठाता है जो मानक क्रिस्टलोग्राफिक मानचित्रों में दिखाई नहीं देते हैं। प्रारंभ में, PanDDA एक औसत घनत्व मानचित्र तैयार करने के लिए विलायक सहिष्णुता परीक्षण और पूर्व-स्क्रीन चरणों के दौरान एकत्र किए गए डेटा का उपयोग करता है जिसका उपयोग तब ग्राउंड-स्टेट मॉडल बनाने के लिए किया जाता है। चूंकि इस मॉडल का उपयोग बाद के सभी विश्लेषण चरणों के लिए किया जाएगा, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि यह फ्रैगमेंट स्क्रीन के लिए उपयोग की जाने वाली शर्तों के तहत अन-लिगैंड प्रोटीन का सटीक प्रतिनिधित्व करता है। PanDDA तब बाध्य लिगेंड की पहचान करने के लिए एक सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग करता है, जो क्रिस्टल की बाध्य स्थिति के लिए एक घटना मानचित्र तैयार करता है। आंशिक-अधिभोग डेटासेट से क्रिस्टल के अनबाउंड अंश को घटाकर एक घटना मानचित्र उत्पन्न किया जाता है और प्रस्तुत करता है कि यदि लिगैंड पूर्ण अधिभोग पर बाध्य था तो क्या देखा जाएगा। यहां तक कि पारंपरिक 2 एमएफओ-डीएफ सी मानचित्रों में स्पष्ट दिखाई देने वाले टुकड़ों को गलत तरीके से तैयार किया जा सकता है यदि घटना के नक्शे32 से परामर्श नहीं किया जाता है। जबकि PanDDA डेटासेट की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है जो औसत मानचित्रों से भिन्न होता है (जो आमतौर पर टुकड़ा बंधन का संकेत होता है) और शोधन के दौरान RSCC, RSZD, B-कारक अनुपात और RMSD जैसे मैट्रिक्स उपयोगकर्ताओं के लाभ के लिए प्रदान किए जाते हैं, उपयोगकर्ता अंततः यह तय करने के लिए जिम्मेदार है कि क्या मनाया गया घनत्व अपेक्षित लिगैंड और सबसे उपयुक्त रचना को सटीक रूप से दर्शाता है।

डेटा विश्लेषण और शोधन के बाद, सभी उपयोगकर्ताओं के लिए XChemExplorer का उपयोग करके प्रोटीन डेटा बैंक (PDB) में एक साथ कई संरचनाओं को जमा करना संभव है। प्रत्येक टुकड़े-स्क्रीन के लिए, दो समूह जमा किए जाते हैं। पहले बयान में सभी खंड-बाध्य मॉडल शामिल हैं, जिसमें एमएमसीआईएफ फाइलों में शामिल पीएडीडीए इवेंट मैप्स की गणना के लिए गुणांक हैं। दूसरा बयान प्रयोग के सभी डेटासेट के मापा संरचना कारकों के साथ ग्राउंड-स्टेट मॉडल प्रदान करता है: इस डेटा का उपयोग पीडीडीए विश्लेषण को पुन: पेश करने और भविष्य के एल्गोरिदम विकसित करने के लिए किया जा सकता है। हिट की संरचनाओं के लिए, जब टुकड़ा अधिभोग कम होता है, तो शोधन बेहतर व्यवहार किया जाता है यदि मॉडल लिगैंड-बाउंड और भ्रमित जमीन-राज्य संरचनाओं का एक समग्र है32; फिर भी, अभ्यास केवल सीमा-राज्य अंशों को जमा करना है, क्योंकि पूर्ण समग्र मॉडल सामान्य रूप से जटिल हैं और व्याख्या करना मुश्किल है। नतीजतन, पीडीबी (विशेष रूप से, आर / ज़ेनोडो56 जैसे प्लेटफार्मों का उपयोग करके सभी कच्चे डेटा प्रदान करना भी संभव है, हालांकि यह वर्तमान में एक्सकेम पाइपलाइन द्वारा समर्थित नहीं है।

कुल मिलाकर, 2016 में इसके संचालन के बाद से, इस प्रक्रिया का उपयोग करके 95% से अधिक लक्ष्यों में फ्रैगमेंट लिगेंड की पहचान की जा सकती है। XChem समर्थित कई परियोजनाओं से अनुभव क्रिस्टल तैयारी33 के लिए सर्वोत्तम अभ्यास में आसुत किया गया था, जबकि एक टुकड़ा पुस्तकालय विकसित किया गया था जिसने टुकड़ा प्रगति29 की सहायता के लिए तैयार अवधारणा को लागू किया था, जिससे पुस्तकालय रचना को सार्वजनिक करने की प्रथा को स्थापित करने में भी मदद मिली। मंच ने अच्छी तरह से बनाए रखा बुनियादी ढांचे और प्रलेखित प्रक्रियाओं के महत्व का प्रदर्शन किया है, यहां विस्तृत है, और पुस्तकालयों48 की तुलना करने के लिए अन्य टुकड़ा पुस्तकालयों57,58 का मूल्यांकन करना संभव है, और सहयोगी EUOpenscreen-DRIVE लाइब्रेरी 59,60 के डिजाइन को सूचित करना संभव है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम डायमंड लाइट सोर्स और स्ट्रक्चर जीनोमिक कंसोर्टियम के बीच एक बड़े संयुक्त प्रयास का प्रतिनिधित्व करता है। लेखक डायमंड के विभिन्न सहायता समूहों और एमएक्स समूह को i04-1 बीमलाइन के स्वचालन में उनके योगदान के लिए और सुव्यवस्थित डेटा संग्रह और ऑटो-प्रोसेसिंग पाइपलाइन प्रदान करने के लिए स्वीकार करना चाहते हैं, जो आमतौर पर सभी एमएक्स बीमलाइन में चलाए जाते हैं। वे SGC PX समूह को उनके लचीलेपन के लिए भी धन्यवाद देना चाहेंगे, जो सेटअप का परीक्षण करने वाले पहले उपयोगकर्ता हैं और Evotec पहले गंभीर औद्योगिक उपयोगकर्ता हैं। इस काम को iNEXT-डिस्कवरी (ग्रांट 871037) द्वारा समर्थित किया गया था, जो यूरोपीय आयोग के क्षितिज 2020 कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSI-poised library Enamine DSI-896 fragment library
Echo 550 and 650 series Beckman-Coulter acoustic dispensing system
Echo microplates Beckman-Coulter 001-12380; 001-8768; 001-6025 1536-well and 384-well microplates
Shifter Oxford Lab Technology harvesting device
Microplate centrifuge with a swing-out rotor Sigma model 11121 microplate centrifuge
3-drops crystallisation plates Swissci 3W96T-UVP Crystallisation plates
Formulatrix plate imager and Rockmaker software Formulatrix Crystallisation plates imaging device

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कुशल टुकड़ा स्क्रीनिंग XChem सुविधा डायमंड लाइट सोर्स फ्रैगमेंट-आधारित ड्रग डिस्कवरी प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी प्राथमिक स्क्रीन प्रारंभिक XChem प्रयोग नमूना तैयारी टुकड़ा पुस्तकालय I04-1 बीमलाइन डेटा संग्रह डेटा प्रबंधन हिट पहचान बड़े पैमाने पर क्रिस्टलोग्राफिक टुकड़ा स्क्रीनिंग शैक्षणिक और औद्योगिक उपयोगकर्ता सहकर्मी-समीक्षित शैक्षणिक उपयोगकर्ता कार्यक्रम
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Douangamath, A., Powell, A., Fearon, D., Collins, P. M., Talon, R., Krojer, T., Skyner, R., Brandao-Neto, J., Dunnett, L., Dias, A., Aimon, A., Pearce, N. M., Wild, C., Gorrie-Stone, T., von Delft, F. Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (171), e62414, doi:10.3791/62414 (2021).

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