Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62416
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic Cancer Center

Summary

מאמר זה מציג את השיטה של פיתוח, אפיון ומעקב בזמן אמת של גרורות הגידול במודל דגי הזברה של נוירובלסטומה, במיוחד בקו דגי הזברה הטרנסגניים עם ביטוי יתר של MYCN ו- LMO1, המפתח גרורות באופן ספונטני.

Abstract

דגי זברה התפתחו כמודל חשוב לבעלי חיים לחקר מחלות אנושיות, במיוחד סרטן. יחד עם טכנולוגיות עריכת הטרנסגניות והגנום החזקות המיושמות במודלים של דגי זברה, קלות התחזוקה, הפרודוקטיביות בתפוקה גבוהה והדמיה חיה רבת עוצמה הופכים את דג הזברה למערכת מודל בעלת ערך לחקר גרורות ובסיסים תאיים ומולקולריים העומדים בבסיס תהליך זה ב- vivo. הדגם הראשון של דגי זברה נוירובלסטומה (NB) של גרורות פותח על ידי ביטוי יתר של שני אונקוגנים, MYCN ו - LMO1, תחת שליטה של מקדם הדופמין-בטא-הידרוקסילאז (dβh). MYCN ו- LMO1 המחושבים יתר על המידה הובילו להשהיה מופחתת ולחדירה מוגברת של נוירובלסטומגנסיס, כמו גם גרורות רחוקות מואצות של תאים סרטניים. מודל חדש זה חוזר על תכונות מרכזיות רבות של NB גרורתי אנושי, כולל מעורבות של שינויים גנטיים רלוונטיים מבחינה קלינית וגרורות; התפתחות טבעית וספונטנית של גרורות ב vivo; ואתרים שמורים של גרורות. לכן, למודל דגי הזברה יש יתרונות ייחודיים לנתח את התהליך המורכב של גרורות הגידול ב- vivo.

Introduction

דגי זברה כבר בשימוש נרחב ויושם על מספר תחומי מחקר, במיוחד בסרטן. מודל זה מספק יתרונות רבים - כגון הרבייה החזקה שלו, תחזוקה חסכונית, והדמיה רב-תכליתית של גידול גידול וגרורות - כל אלה הופכים את דגי הזברה לכלי רב עוצמה לחקור ולחקור את הבסיסים התאיים והמולקולריים של גידולים וגרורות. טכניקות חדשות למיפוי גנום בקנה מידה גדול, טרנסגנזה, ביטוי יתר של גנים או נוקאאוט, השתלת תאים ומסכים כימיים הגדילו מאוד את כוחו של דג הזברה מודל1. במהלך השנים האחרונות, קווי דגי זברה רבים פותחו כדי לחקור גידולים וגרורות של מגוון סוגי סרטן אנושיים, כולל אך לא מוגבל ללוקמיה, מלנומה, rhabdomyosarcoma, קרצינומה hepatocellular2,3,4,5. בנוסף, מודל דג הזברה הראשון של נוירובלסטומה (NB) נוצר על ידי ביטוי יתר MYCN, אונקוגן, במערכת העצבים הסימפתטית ההיקפית (PSNS) תחת שליטה של מקדם דופמין-בטא-הידרוקסילאז (dβh). עם מודל זה, הוכח עוד כי ALK מופעל יכול להתמזג עם MYCN כדי להאיץ את הופעת הגידול ולהגדיל את החדירות הגידול ב vivo6.

NB נגזר מן השושלת הסימפתודואדרנלית של תאי הסמל העצבי, והוא סרטן גרורתי מאוד אצל ילדים7. הוא אחראי ל -10% ממקרי המוות הקשורים לסרטן ילדים8. גרורות נרחבות באבחון, NB יכול להיות מוצג קלינית כגידולים שמקורם בעיקר לאורך השרשרת של הגרעינים האוהדים ואת המדולה יותרת הכליה של PSNS9,10. הגברה MYCN קשורה בדרך כלל עם תוצאות גרועות בחולי NB11,12. יתר על כן, LMO1 זוהה כגן רגישות NB קריטי במקרים בסיכון גבוה13,14. מחקרים מצאו כי דו-אופן הפעולה מהונדס של MYCN ו- LMO1 ב- PSNS של מודל דגי הזברה לא רק מקדם התחלה מוקדמת יותר של NB, אלא גם גורם גרורות נרחבות לרקמות ולאיברים הדומים לאתרים הנפוצים בחולים עם NB13 בסיכון גבוה. לאחרונה, פנוטיפ גרורתי נוסף של NB נצפתה גם במודל חדש יותר של דגי זברה של NB, שבו הן MYCN ו- Lin28B, קידוד חלבון מחייב RNA, מתבטאים יתר על המידה תחת שליטה של מקדם dβh16.

הגישה הטרנסגנית היציבה בדגי זברה משמשת לעתים קרובות כדי לחקור אם ביטוי יתר של גן עניין יכול לתרום להתפתחות נורמלית ומחלות pathogenesis14,15. טכניקה זו שימשה בהצלחה כדי להדגים את החשיבות של גנים מרובים ומסלולים לגידול NB6,16,17,18,19,20. מאמר זה יציג כיצד קו הדגים הטרנסגני שמבטא יתר על המידה הן את MYCN והן את LMO1 ב- PSNS נוצר וכיצד הוכח כי שיתוף הפעולה של שני האונקוגנים האלה מאיץ את הופעת הגידול של NB וגרורות13. ראשית, הקו הטרנסגני המבטא יתר על המידה EGFP-MYCN תחת שליטה של מקדם dβh (קו MYCN ייעודי) פותח על ידי הזרקת dβh-EGFP-MYCN לבנות לשלב תא אחד של עוברי AB מסוג בר (WT), כפי שתואר בעבר 6,17. קו מהונדסי נפרד המבטא יתר על המידה את LMO1 ב- PSNS (קו LMO1 ייעודי) פותח על ידי חפיפה בין שני מבני DNA, dβh-LMO1 ו- dβh-mCherry, לעוברי WT בשלב תא אחד13. בעבר הוכח כי ניתן לחפוף למבני דנ"א כפולים חופפים לגנום הדגים; לכן, LMO1 ו mCherry הם coexpressed בתאי PSNS של בעלי חיים מהונדסים. ברגע שהעוברים המוזרקים F0 הגיעו לבגרות מינית, הם אז היו מחוץ לחצות עם דגי WT לזיהוי של דגים חיוביים עם שילוב של טרנסג'נים. בקצרה, צאצאי F1 נבדקו לראשונה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לביטוי mCherry בתאי PSNS. שילוב נבטים של LMO1 בדגים mCherry-חיובי אושרה עוד יותר על ידי PCR גנומי ורצף. לאחר זיהוי מוצלח של כל קו מהונדס, הצאצאים של דג הטרוזיגוס MYCN ו- LMO1 מהונדסים היו שזורים כדי ליצור קו דגים מורכב המבטא הן את MYCN והן את LMO1 (המכונה MYCN; קו LMO1). MYCN נושא גידול; דגי LMO1 היו במעקב על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית דו-שבועית לראיות לגידולים גרורתיים באזורים המרוחקים לאתר הראשי, אזור בלוטת יותרת הכליה הבין-יותרת הכליה (IRG, שווה ערך לדגי זברה של בלוטת יותרת הכליה האנושית)13. כדי לאשר את גרורות של גידולים MYCN; דגי LMO1, ניתוחים היסטולוגיים ואימונוהיסטוכימיים יושמו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל שיטות המחקר באמצעות דגי זברה וטיפול בבעלי חיים / תחזוקה בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות במרפאת מאיו.

1. הכנה ומיקרו-הפעלה של מבני טרנסג'ן לפיתוח קו דגי זברה מהונדסים LMO1 עם ביטוי יתר ב- PSNS

  1. כדי לפתח את שיבוט הכניסה LMO1-pDONR221 , הגבר את אזור הקידוד של LMO1 האנושי מ- cDNA המתקבל מקו התא האנושי באמצעות PCR.
    1. בצע תגובה 25 μL כמפורט כאן: 2.5 μL של 10x רגיל Taq תגובה חוצץ, 0.125 μL של Taq DNA פולימראז, 0.5 μL של 10 mM dNTPs, 2 μL של תבנית cDNA, 0.5 μL של 10 μM קדימה LMO1 ATTB1 פריימר, 0.5 μL של 10 μM הפוך LMO1 ATTB2 פריימר, ו 18.875 μL של מים.
      הערה: השתמש בפריימר LMO1 ATTB1 קדימה: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' והפוך LMO1 ATTB2 פריימר: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
    2. הגבר באמצעות התוכנית הבאה: 1 מחזור של 94 °C (94 °F), 2 דקות; ואחריו 30 מחזורים של (94 °C ,30 s, 55 °C (55 °F), 30 s, 72 °C (1 °F, 1 דקות) ו 72 °C (72 °F, 7 דקות).
  2. שכפל מוצר PCR LMO1 לתוך וקטור תורם השער pDONR221 על ידי תגובת רקומבינאז BP6,13 (קטע PCR + וקטור תורם = שיבוט כניסה).
    1. לתגובה של 10 μL, ערבבו 1 μL של מוצר LMO1 PCR מטוהר (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) וקטור התורם pDONR221 , ו-6 μL של מאגר TE (pH 8.0) עם 2 מיקרומטר של תערובת אנזימי BP, דגירה למשך שעה אחת ב-25 °C, ולהפוך ל- TOP10 מוסמך E. coli באמצעות פרוטוקול היצרן.
    2. לאחר מכן, להפיץ 50-200 μL מבקבוקון טרנספורמציה על צלחת אגר מרק לוריא (LB) המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל קנאמיצין ודגרה ב 37 °C (57 °F) לילה.
    3. בחר שיבוטים על ידי חיסון מושבה אחת לתוך 2-5 מ"ל של LB עם 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin ו culturing לילה (16-18 שעות) ב 37 °C (37 °F).
    4. השתמש 2 מ"ל של תרבית חיידקים לילה לבידוד פלסמיד על פי פרוטוקול היצרן. כדי לאמת את פלסמיד LMO1, שלח דגימת פלסמיד לרצף עם פריימר M13-F (5- GTAAAACGACGGCCAG-3').
  3. כדי ליצור שיבוט ערך dβh-pDONRP4-P1R, השג את מוצר dβh PCR6,13 על-ידי הגברת אזור הקדם של 5.2 kb באמצעות שיבוט CH211-270H11 BAC כתבנית להכנת תגובת 20 μL כפי שתואר בעבר בשלב 1.1.1. השתמש בפרמטרים הבאים של תוכנית PCR: 94 °C (65 °F), 2 דקות; 10 מחזורים של 94 °C (6 °F), 15 s, 50 °C (50 °F), 30 s, 68 °C (8 °F), 8 דקות; 30 מחזורים של 94 °C (6 °F), 15 s, 53 °C (53 °F), 30 s, 68 °C (8 °F), 8 דקות; 68 °C ,4 דקות (עם פריימר קדימה 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTTTGGCGTACTC
    CCCCTTTTTTTAGG-3' ופריימר הפוך 5'-GGGGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTT
    TCGTCTTTTGA-3').
    הערה: בשל תבניות ה- DNA הארוכות בשלב זה, ודאו שימוש במערכת PCR מתאימה להגברת PCR מדויקת.
  4. שכפל dβh מוצר PCR לתוך וקטור תורם שער pDONRP4-P1R על ידי תגובת רקומבינאז BP6,13 (קטע PCR + וקטור תורם = שיבוט כניסה).
    1. ערבבו 1 μL של מוצר Dβh PCR מטוהר (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) של וקטור התורם pDONRP4-P1R, ו-6 μL של מאגר TE (pH 8.0) עם 2 μL של תערובת אנזימי BP בסך הכל 10 μL תגובה, דגירה למשך שעה אחת ב-25 °C( 25 °C).
    2. הפוך ל- TOP10 E. coli מוסמך בהתאם לפרוטוקול היצרן. בודד את הפלסמיד כמתואר בשלבים 1.2.2-1.2.2.4 ואמת פלסמיד על-ידי רצף עם פריימרים M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') ו- M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3').
  5. צור את מבנה הביטוי dβh:LMO1 .
    1. שלב 1 μL של כל שיבוט ערך (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 ו- p3E-polyA11) (20 fmole כל אחד), 1 μL (60 ng/μL) של וקטור יעד שונה עם אתרי זיהוי I-SceI, ו-4 μL של מאגר TE (pH 8.0) המכיל 2 μL של תערובת אנזימי רקומבינאז LR. לדגור תערובת זו במשך 1 שעה ב 25 °C (50 °F).
    2. תוך כדי ביצוע הפרוטוקול של היצרן, להפוך חיידקים ל TOP10 E. coli מוסמך כימית. בודד פלסמיד כמתואר בשלבים 1.2.2-1.2.2.4 ואמת פלסמיד על-ידי רצף עם פריימרים של DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGTTGTGTG-3') ו- LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3').
  6. צור dβh:mCherry DNA לבנות עם מערכת שער על ידי שילוב שיבוטי כניסה של מקדם dβh 5.2 kb, pME-mCherry, ו p3E-polyA לתוך וקטור היעד שונה המכיל אתרי זיהוי I-SceI כאמור בשלב 1.5.16. בודד פלסמיד כמתואר בשלבים 1.2.2-1.2.2.4 ואמת פלסמיד על-ידי רצף עם פריימר DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTGTG-3').
  7. מבנה DNA ליניארי dβh:LMO1 ומבנה DNA dβh:mCherry (ביחס של 3:1, בהתאמה) בסך הכל נפח תגובה של 15 μL עם 1 μL של אנזים I-SceI (5 U/ μL) ו 0.75 μL של חיץ (10x), ודגר בטמפרטורת החדר למינימום של 4 שעות או לילה. ודא שריכוז ה- DNA אינו עולה על 750 ננוגרם בתגובה.
  8. למחרת ואחרי ליניאריזציה של מבנים, להוסיף 0.5 μL של אנזים I-SceI טרי (5 U/ μL) ו 0.5 μL של 0.5% פנול אדום לתוך 5 μL של תערובת DNA הכוללת מהשלב הקודם של 1.7. מיקרו-הצמד את התמיסה הכוללת (של 50-80 pg של DNA ליניארי) לתוך עוברי AB מסוג תא אחד (ועד 500 עוברים) באמצעות מחט מיקרופיפט זכוכית בקוטר 1.0 מ"מ כפי שתואר בעבר17. יש לאחסן את תערובת הדנ"א הנותרת בטמפרטורה של -20°C לזריקות עתידיות.

2. לסנן ולאמת קו דגים מהונדס LMO1 להעברת נבטים של LMO1 ו mCherry

  1. ב 3-4 ימים לאחר ההפריה (dpf), מרדים מוזרק עוברים עם 0.02% tricaine ולהקרין אותם עבור ביטוי mCherry פלורסנט, אשר מציג בכל מקום בכל מקום בכל רחבי גוף הדג בשל טרנסגנזה פסיפס. מעבירים עוברים חיוביים לצלחת פטרי עם מי ביצים טריות ומעלים עוברים לבגרות מינית בהתאם לספר דגי הזברה21.
    הערה: צפו שהיחס בין דגים חיוביים ישתנה בהתאם למומחיות ולניסיון של אנשי המחקר. לדוגמה, חובבנים מתחילים עשוי להיות שיעור שילוב נמוך של 10%, לעומת מומחה של ≥50%.
  2. כדי לקבוע את הדגים המייסדים עם dβh:LMO1 ו dβh:mCherry transgenes משולבים בתאי נבט, outcross זוגות בודדים של דגים מוזרקים mCherry חיובי F0 התבגר מינית מהשלב הקודם (2.1) עם דגי WT AB. הסר את דור ה- F1 עבור עוברים חיוביים mCherry ב- 3-4 dpf.
  3. כדי לאשר כי הדגים mCherry-positive לשאת LMO1 transgene, לבודד את gDNA מ F1 mCherry חיובי עובר יחיד באמצעות מאגר החילוץ gDNA, אשר מכיל: 12.5 μL של חיץ תמוגה 4x (500 μL של 1 M Tris עם pH של 8.4, 2.5 מ"ל של 1 M אשלגן כלורי, ו 47 מ"ל של מים מטוהרים), 35 μL של מים מטוהרים, ו 2.5 μL של חלבון K ב 10 מ"ג / מ"ל. דגירה המדגם עבור 16 שעות ב 55 °C (55 °F), ואחריו 10 דקות ב 98 °C (88 °F).
  4. השתמש gDNA שחולץ (2 μL) כתבנית עבור PCR genotyping עם פריימרים: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGTGGACAAGTACTGGCA -3' ו LMO1 קרוואן: 5'-CGAAGGCTCTGGGGGATCAGCTTG -3', ואת תוכנית PCR הבאה: מחזור אחד של 94 °C,10 דקות; 35 מחזורים של (94 °C (94 °F עבור 30 s, 60 °C (60 °F) עבור 30 s; 68 °C (68 °F, 30 s); ו-68 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. אשר את הקטע המוגבר של 182 bp על-ידי רצף.
  5. לאחר אישור הגנוטיפ, העלו את העוברים הנותרים של MCherry-חיובי F1 לבגרות בהתאם להנחיות הסטנדרטיות של ספר דגי הזברה21. קליפ סנפיר וגנוטיפ אותם בגיל 2-3 חודשים באמצעות שלבים 2.3-2.4 מהפרוטוקול לעיל כדי לאשר עוד יותר את השילוב של טרנסג'ן LMO1 בדגים.
    הערה: דג F1 חיובי LMO1 יהיה הדג הטרנסגני היציב [Tg(dβh:LMO1), Tg(dβh:mCherry)] (מיועד כקו LMO1 ).
  6. לגדל F1 LMO1 דגים מהונדסים יציבים עם דגי WT ולחזור על הפעולה לפי הצורך כדי להפיץ קו זה.

3. Outcross של קווים מהונדסים LMO1 ו - MYCN ליצירת מודל גרורתי

  1. לאחר שנוצר קו דגי הזברה הטרנסגניים LMO1, הוא נקשר עם קו MYCN 6,17 כדי לפתח קו דגים מהונדס הטרוזיגוס שמבטא יתר על המידה הן את MYCN והן את LMO1.
  2. ב- 1 dpf, מיין את הצאצאים של outcross עבור ביטוי EGFP עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי, המציג כנקודות חיוביות EGFP באזור המוח האחורי.
    הערה: לחלופין, אם לא כל העוברים ממוינים עבור MYCN ב 1 dpf, להעלות את העוברים לבגרות וגנוטיפ על ידי חיתוך סנפיר באמצעות חיתוך סנפיר ושימוש בהנחיות שצוינו בעבר משלבים 2.3-2.4 עבור בידוד gDNA ו genotyping PCR, עם פריימרים: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', והתוכנית הבאה עם טאק פולימראז סטנדרטי: מחזור אחד של 94 °C במשך 3 דקות, 35 מחזורים של (94 °C עבור 30 s, 60 °C (60 °C) עבור 30 s, ו 68 °C (68 °C) במשך 7 דקות עם גודל אמפלייקון צפוי של 145 bp.
  3. לאחר מיון עבור EGFP ב 1 dpf, לבודד עוברים מוקרן לתוך מנות פטרי נפרדות ומנות תווית כמו: MYCN + (EGFP-חיובי) או MYCN- (EGFP-שלילי).
  4. ב 3-4 dpf, לדמיין ולמיין עוברים של שתי הקבוצות (שלב 3.3) עבור ביטוי LMO1 עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי. חפש ביטוי חלבון פלואורסצנטי אדום כתמים הן גנגליון צוואר הרחם מעולה והן תאים עצביים דופאמין שאינם PSNS באזור הראש, במיוחד במדולה oblongata של hindbrain6,13.
    הערה: מסך עבור mCherry / LMO1 לפני העוברים להגיע 5 dpf, כי שלפוחיות שחייה מלאות באוויר לפתח באופן מלא עד אז יגרום העוברים לצוף, וכתוצאה מכך מיקוד מיקרוסקופי קשה של תאי PSNS במהלך תהליך המיון.
  5. לאחר השלמת המיון, בודדו דגים ממוינים לארבע קבוצות של גנוטיפים שונים ותוויתו כמפורט להלן. הרימו את הדגים הממוינים בתנאים זהים בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים מספר דגי הזברה21.
    1. MYCN בלבד (EGFP-חיובי),
    2. LMO1 בלבד (mCherry-חיובי),
    3. MYCN; LMO1 (EGFP ו- mCherry חיובי כפול),
    4. WT (EGFP ו mCherry כפול שלילי).

4. הדמיית נטל הגידול בקווים מהונדסים של דגי זברה

  1. ב 4 שבועות לאחר הפריה (wpf), מרדים דגים ממוינים משלב 3.5 עם 0.02% tricaine בצלחת פטרי.
  2. דמיינו גידולים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי על ידי היפוך עדין של דגים עם מרית מתכת לשני הצדדים הצדדים לרוחב כדי להציג גידול. צפו גידולים להציג כמו יחיד EGFP-, יחיד mCherry-, או כפול EGFP-ו-mCherry-חיובי מסות הנובעות מאזור בלוטת יותרת הכליה (ליד הראש והכליות).
    הערה: ייתכן כי הופעת הגידול הראשוני מוצגת בדרך כלל עם מסה חיובית פלואורסצנטית בהירה וגדולה יותר בצד אחד של בלוטת יותרת הכליה, ולכן חשוב לדמיין את שני הצדדים של דגים כדי למנוע החמצת הופעת גידול מוקדם.
  3. לאחר זיהוי הדגים הנושאים גידול אפשרי, בודדו את הדגים למיכל נפרד עם תוויות מתאימות, הכוללות תאריך לידה, תאריך הקרנת הגידול וגנוטיפ.
  4. ב 6 wpf, חזור על שלבים קודמים 4.1-4.3 כדי לסנן דגים נושאי גידול ודגים שאינם נושאי גידולים שוב כדי לאשר את נוכחותם של גידולים עבור דגים נושאי גידולים שנבדקו בעבר או לזהות דגים חדשים הנושאים גידולים אפשריים, בהתאמה. חפשו מסה מתמשכת או מוגברת של פלואורסצנטיות חיובית בדגים מאושרים הנושאים גידולים.
  5. לאחר זיהוי דגים נושאי גידולים, עקוב אחריהם דו-שבועי לקבלת ראיות לנדידת תאי הגידול, המציגה כגושי גידול זעירים של EGFP ו/או mCherry חיוביים הרחק מהאתר העיקרי של tumorgenesis (אזור בלוטת יותרת הכליה). לבודד את הדגים האלה לתוך טנקים נפרדים לפי הצורך ולתייג כראוי כדי להצביע על גרורות אפשריות.
  6. כדי לאשר עוד יותר את הגרורות, המשך לעקוב אחר דגים אלה באופן קבוע (כל שבועיים) עד שמסות הגידול החיוביות לפלואורסצנטיות רחוקות מראות בבירור גודל מוגבר, מה שמצביע על צמיחה של גידולים באתרים גרורתיים.

5. עיבוד רקמות וחתך פרפין של דגים נושאי גידול

הערה: בצע שלב זה כדי לאפיין את הגידולים הראשוניים ו/או גרורתיים שפותחו באופן ספונטני ב - MYCN וב- MYCN; דג מהונדס LMO1 .

  1. לאחר זיהוי ואימות של דגים נושאי גידול, להקריב דגים משלב 4.6 בצלחת פטרי על ידי טבילת דגים ב 0.02% tricaine כדי להרדים הראשון ולאחר מכן להגדיל את המינון tricaine עד דגים כבר לא נושם. חותכים את הדג לשתי חתיכות - עם חתיכה אחת המכילה את הראש וחלק מהחלק האמצעי של הגוף (כולל גידול), וחתיכה נוספת עם שאר החלק האמצעי והזנב של הדג.
  2. תקן את שני חלקי הדגים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר על נדנדה. כדי לשפר את יעילות הקיבעון, החלף את המאגר ב- PFA טרי של 4% כדי להגביר את החיבה לאיברים הפנימיים ביעילות ובמהירות. השאירו דגים עם חיץ תיקון טרי על נדנדה ב 4 °C (65 °F) לילה או עבור 48 שעות.
    זהירות: PFA רעיל. מאז נהלי זהירות וסילוק נאות של ריאגנט תלוי בתקנות של המוסד שלך, לחפש הנחיות נאותות לפני השימוש וסילוק של ריאגנט.
  3. לפני העיבוד, למקם דגימות(ים) ב 100% פתרון decalcifier מהיר במשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר. הקפד להשתמש במיכל שאינו מטאלי ולבדוק דוגמאות במהלך הדגירה כדי למנוע הסרבנות יתר. אם רקמת מדגם נראה מושפל בכבדות, למקם מדגם במים או ב 4 °C (60 °F) כדי להאט את תהליך הסרסרות.
  4. לאחר התיקון וההסרה, יש לשטוף דגימות דגים עם מי ברז זורמים למשך שעה אחת ולהניח אותם בקלטות המעבד. אם יש יותר מדגם אחד, הפרד כל אחד לקלטת משלו.
  5. התייבשו והכינו את הרקמה להטמעת פרפין על ידי הצבת קלטות עם דגים במעבד הרקמות שבו הדגימות שקועות בפתרונות שונים, בהתאמה, כדלקמן: 70% אתנול (60 דקות, 40 °C), 85% אתנול (50 דקות, 40 °C), 95% אתנול (40 דקות, 40 °C) פעמיים, 100% אתנול (30 דקות, 40 °C), פתרון טרי אחר של 100% אתנול (50 דקות, 50 דקות, 40 °C (40 °F) פעמיים, קסילן (30 דקות, 40 °C ),עוד פתרון טרי של קסילן (50 דקות, 40 °C (), עוד קסילן טרי (50 דקות, 45 °C (), פרפין (30 דקות, 45 °C (), פרפין (20 דקות, 58 °C )שלוש פעמים.
  6. לאחר עיבוד הרקמה, פרקו את הקלטות ממכונת המעבד תוך שמירה על הארגון של כל קלטת והקפדו למנוע ערבוב דגימות הדגים.
  7. בחר את התבנית בגודל המתאים בהתבסס על גודל הדג, וודא שהעובש יתאים את כל הקלטת לדגימת הדגים. מכסים את תחתית התבנית בפרפין נוזלי בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.
  8. מניחים מיד את הקסטה עם הדג על גבי עובש (מוודאים שהדגים מונחים על צדו השטוח לרוחב לחלקי קשתות) עם פרפין נוזלי, ומסיימים מילוי בפרפין לראש התבנית כדי להטמיע לחלוטין את הדגים.
  9. מניחים את התבנית שהושלמה על הצלחת הקרה של מיקרוטומיה חתך עד פרפין מתקשה.
  10. ברגע בלוק פרפין קשה, אשר ניתן לשפוט על ידי התבוננות חזותית אטימות גבוהה יותר מגע מוצק לבלוק, להסיר בעדינות את הבלוק מן התבנית. בזהירות לגרד כל פרפין עודף מצדי הקלטת.
  11. חלקו את גוש הדגים המוטבע בפרפין ב-4 מיקרון במיקרוטום וצפו את החלקים באמבט מים חמים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס המכילים מים מזוקקים.
  12. מעבירים בזהירות את החלקים למגלשות טעונות חיובית ואופים בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני ההכתמה לפני שממשיכים לשלב 6, 7 או 8.

6. המטוקסילין ואאוזין (H&E) מכתימים מקטעי פרפין לסקירה פתולוגית

  1. מקם שקופיות המכילות מקטעי פרפין משלב 5.12 למחזיק שקופית. בתוך מכסה מנוע אדים כימי, deparaffinize עם קסילן 3 פעמים, 5 דקות כל אחד. יש למחוק את הפתרון לאחר כל שימוש.
  2. חלקים rehydrate עם 100% אתנול במשך 3 דקות, ולחזור פעמיים עם 100% אתנול טרי. החלף 100% אתנול עם 95% אתנול במשך 3 דקות ולאחר מכן, 80% אתנול במשך 3 דקות.
  3. יש לשטוף חלקים במים מזוקקים למשך 5 דקות. בעוד החלקים שוטפים במים, הקפד להסיר חלקיקים מחומצנים מן המטוקסילין על ידי סינון או רפרוף משטח של המטוקסילין עם מגבון ללא מוך.
  4. יש להכתים את עודפי המים ממחזיק השקופיות עם מגבוני כיתה מקצועיים ללא מוך, ולהכתים שקופיות ב-50% המטוקסילין (דילול 1:1 במים מזוקקים) למשך 2-5 דקות, בהתאם להעדפת הכתמים הרצויה והידרדרות ריאגנט. יש להשליך את המטוקסילין כאשר צבע התמיסה משתנה משזיף לכחול/חום או כאשר זמן ההכתמה הופך מוגזם. שוטפים את השקופיות במי ברז זורמים במשך 20 דקות.
  5. הפוך את החלקים ל-1% חומצה אתנול (3.3 מ"ל של חומצה הידרוכלורית עם 50 מ"ל של 70% אתנול) על ידי טבילה מהירה של השקופיות מספר פעמים. ניתן לטבול שקופיות עד 3 שניות, אך ככל שהשקופיות טבולות זמן רב יותר, כך המקטעים הופכים לקלים יותר.
  6. יש לשטוף את המגלשות במי ברז פעמיים למשך דקה אחת כל אחת, ופעם אחת במים שעברו דה-יוניזציה. כאופציה, ניתן להשאיר שקופיות למשך הלילה בשלב זה, ספוגות במים.
  7. טבול את החלקים בתמיסת ליתיום קרבונט של 1.36% (47 גר' ליתיום קרבונט, 3,500 מ"ל מים) למשך 3 שניות. הקפידו לא לדגור יתר על המידה על החלקים מכיוון שככל שהזמן בתמיסת ליתיום קרבונט ארוך יותר, כך גדל הסיכוי שהרקמה תצוף.
  8. שוטפים את החלקים במי ברז במשך 5 דקות, ומכתימים את עודפי המים ממחזיק המגלשה במגבונים מקצועיים ללא מוך.
  9. נגד השקופיות ב 100% אאוזין מוכן לשימוש עבור 15-30 שניות, ומיד להתייבש עם 95% אתנול פעמיים במשך 5 דקות כל אחד. יש להחליף ב-100% אתנול פעמיים למשך 5 דקות כל אחד, תוך ביטול הפתרונות לאחר כל שימוש.
  10. נקה את החלקים בקסילן במשך 15 דקות ולחזור פעמיים במשך 3 פעמים בסך הכל. לחלופין, ניתן להשאיר את השקופיות בקסילן לילה בטמפרטורת החדר כדי לנקות טוב יותר מים עודפים.
  11. אפשר למגלשות להתייבש באוויר במכסה המנוע של האדים הכימיים ולאחר מכן התקן תלוש כיסוי באמצעות מדיום הרכבה כדי לאטום דגימת רקמה.
  12. דמיינו ודמו את מקטעי הרקמה המוכתמת תחת מיקרוסקופיה. בחן בזהירות את הגידולים באתר העיקרי (אזור בלוטת יותרת הכליה בכליות הראש) ואת הגרורות הלא סדירות הרחוקות ברקמות ובאיברים אחרים של הדגים. שלח שקופיות מוכתמות עבור מקטעי רקמות להיבדק על ידי פתולוגים. בהתבסס על המאפיינים הפתולוגיים הדומים של מודל הדגים לנוירבלסטומה אנושית, צפו לגידולים שהתעוררו ב- MYCN בלבד או MYCN; דגי LMO1 שאובחנו לראשונה כנוירובלסטומה על ידי פתולוגים.

7. ניתוח אימונוהיסטוכימי (IHC) עם נוגדנים נגד סמן NB וטרנסג'ים מבוטאים יתר על המידה כדי לאשר עוד יותר את התפשטות הגידול ואת מאפיין השושלת הסימפתואדרנלית שלהם

  1. מכתים עם מערכת הכתמה אוטומטית לחלוטין
    1. כדי להשוות טוב יותר את תוצאת IHC לזו של כתמי H&E, בחר שקופיות סמוכות משלב 5.12 להכתמת IHC.
      הערה: למרות שמערכת כתמים אוטומטית מאפשרת תוצאות מהירות יותר ופחות מייגעות, ניתן להשתמש בפרוטוקול ידני להכתמת IHC בהיעדרם של כאלה על-ידי התייחסות לשלבים של סעיף קטן 7.2.
    2. לדלל את הנוגדן העיקרי נגד טירוזין הידרוקסילאז (TH) (1:500), סמן נוירובלסטומה, המבוסס על הריכוז הרצוי ואת הכמות הכוללת הדרושה עם דילול הנוגדנים העיקרי המתאים של המערכת האוטומטית.
      הערה: ריכוזי הנוגדנים האופטימליים עשויים להשתנות בהתאם לנוגדנים ולרקמות.
    3. מכיוון שהמערכת האוטומטית משתמשת באחזור אנטיגן המושרה בחום עם פתרון אחזור אפיטופ במשך 20 דקות וראיאגנט הזיהוי המתאים של המערכת, ודא שהפרמטרים עבור המכונה מוגדרים כ: חסימת פרוקסידאז, 5 דקות; נוגדן ראשוני עם ריכוז הרצוי, 15 דקות; נוגדן משני אנטי ארנב IgG biotinylated (1:500), 8 דקות; Streptavidin HRP, 8 דקות; מצע אינטנסיבי DAB מעורב, 5 דקות; והמטוקסילין, 5 דקות.
    4. לאחר קביעת ההגדרות, הנח את מגש הנוגדנים במכונה. הגדר את השקופיות על-ידי יצירת אירוע חדש, אשר יסמן את השקופיות בתווית. המכונה כעת טעונה ומוכנה להפעלה (dewaxing, כתמים, ו counterstaining).
    5. לאחר שהשקופיות מתרוקנות, מוכתמות ומוכתמות באמצעות המכונה האוטומטית, מייבשים את השקופיות בשיפועי אתנול של 70%, 95% ו-100% למשך 5 דקות כל אחת. שקוע שקופיות של קטעים ב 100% אתנול טרי שוב במשך 5 דקות.
    6. נקה את החלקים בקסילן במשך 5 דקות, פעמיים, או השאר שקופיות בקסילן לילה כדי לנקות טוב יותר עודפי מים.
    7. אפשר למגלשות להתייבש באוויר במכסה המנוע של האדים הכימיים ולאחר מכן התקן תלוש כיסוי באמצעות מדיום הרכבה. דמיינו ודמו את מקטעי הרקמה המוכתמת במיקרוסקופיה.
    8. כדי לאשר היטב גרורות במודל הדגים, השווה את השקופיות המוכתמות בנוגדנים נגד סמן נוירובלסטומה משלב 7 לאלו המוכתמות על ידי H&E משלב 6.
      הערה: צפו לראות כתמים חיוביים עבור סמן נוירובלסטומה, TH, בכל תאי הגידול שזוהו על ידי כתמי H&E. כמו כן, אל תצפו להכתמה חיובית עבור TH ברקמות סמוכות שבהן זוהו הגידולים גרורתיים ב - LMO1; דג MYCN . הקפד לבחור שליטה WT ודגים MYCN בלבד כי הם בגיל דומה MYCN; דגי LMO1 לניתוח זה כדי לשלול את האפשרות שהגידולים גרורתיים הם גידולים ראשוניים רב מוקדיים.
  2. הכתמה ידנית ללא מערכת כתמים אוטומטית של IHC
    1. לאחר איסוף השקופיות, בחר שקופיות סמוכות משלב 5.12 כדי לאפשר השוואה טובה יותר בין כתמי H&E ו- IHC כדי להסיר את ההתאמה. בתוך מכסה המנוע אדים כימיים, dewax ו rehydrate השקופיות עם קסילן באמצעות שלבים קודמים 6.1 ו 6.2.2., בהתאמה.
    2. לאחר deparaffinization ו rehydration, להשרות שקופיות בתמיסת חסימת מי חמצן אנדוגני (1x PBS המכיל 0.1% נתרן אזיד ו 0.3% מי חמצן) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף שקופיות טרי 1x PBS במשך 3 דקות ולחזור פעמיים על סך של 3 פעמים.
      זהירות: נתרן אזיד רעיל מאוד. הקפד לתרגל נהלי זהירות וסילוק נאות של ריאגנט בהתאם לתקנות המוסד שלך.
    3. אחזר אנטיגן על ידי הדגירה שקופיות בתמיסה עם proteinase K (1:500 ב 1x PBS) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף שקופיות 3 פעמים עם 1x PBS במשך 3 דקות כל אחד.
    4. חסום שקופיות על ידי דגירה עם סרום עזים 5% ב 1x PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על רוקר. לשטוף שקופיות עם PBS 1x טרי פעמיים במשך 3 דקות כל אחד.
    5. הוסיפו 4 טיפות של תמיסת חסימת Avidin ישירות למגלשה ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת מגלשות עם PBS טרי 1x פעמיים במשך 3 דקות כל אחד, להוסיף 4 טיפות של פתרון חסימת ביוטין ודגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
    6. לאחר חסימת שקופיות, דגירה בנוגדן העיקרי של טירוזין הידרוקסילאז (TH) (1:500) במשך 45-60 דקות בטמפרטורת החדר, או לילה ב 4 °C (60 °F).
      הערה: כתם עם נוגדנים נוספים נגד טרנסגנים וסמנים רלוונטיים אחרים לטיפול בפיזיולוגיה ובפעילות של גידול ראשוני ואתרים גרורתיים אחרים. ריכוזי הנוגדנים האופטימליים עשויים להשתנות בהתאם לנוגדנים ולרקמות.
    7. לשטוף שקופיות עם PBS 1x טרי במשך 3 דקות, חוזר פעמיים עם סך של 3 פעמים.
    8. מגלשות דגירה בנוגדן משני של נוגדן משני נגד ארנבות IgG (1:500) מדולל בתמיסת חסימה במשך 45-60 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב הכביסה הקודם 7.2.7.
    9. הוסף HRP מצומד Avidin (1:300 ב 1x PBS), ודגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף שקופיות 3 פעמים עם PBS 1x טרי במשך 5 דקות כל אחד.
    10. הכן פתרון 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) (2.5 מ"ל מים מזוקקים, 1 טיפה של מאגר ערכה, 1 טיפה של מי חמצן, ו 2 טיפות של DAB מהערכה), ולהניח טיפות של DAB ישירות על שקופיות ליד מיקרוסקופ. לאחר הוספת DAB, שים לב לתגובת שינוי הצבע בשקופיות תחת מיקרוסקופ. לאחר הגעה לעוצמת ההכתמה הרצויה, הפסק את התגובה על-ידי הצבת מקטעי שקופיות במים מזוקקים קרים.
    11. Counterstain השקופיות עם 50% המטוקסילן טרי על ידי טבילה או טבילה דגימות במשך כמה שניות קצרות והחזרה למים מזוקקים. חזור על הפעולה כרצונך, אבל בדרך כלל, פעם אחת צריך להיות מספיק מאז קטעי רקמות דקים.
    12. ייבש דגימות רקמה על שקופיות בשיפוע אלכוהול כפי שתואר בעבר בשלב 7.1.5 ולהמשיך בשלבים הנותרים (עם השלב האחרון כמו 7.1.8) כדי לסיים את ניתוח IHC.

8. כתמים אדומים של Picrosirius של שקופיות פרפין להצטברות קולגן בגידולים כמחקר מנגנון

  1. חזור על שלבים 6.1-6.3 כדי להסיר שעווה, לחות ולשטוף מקטעי פרפין במגלשות.
  2. לאחר הכתמת עודפי המים ממחזיק השקופיות עם מגבונים מקצועיים ללא מוך, מכתימים ב-50% המטוקסילין במשך 10 דקות. שוטפים את השקופיות במי ברז זורמים במשך 10 דקות.
  3. מעבירים את השקופיות לאדום פיקרוסיריוס ודגורים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  4. לשטוף את השקופיות במים חומציים (5 מ"ל חומצה אצטית קרחונית ב 1 L של ברז או מים מזוקקים) פעמיים, דגירה במשך 5 דקות על שייקר.
  5. Decant רוב המים מן השקופיות הראשון לפני ניעור פיזי ו bloting קטעים על שקופיות כדי להסיר מים רבים ככל האפשר.
  6. מניחים במהירות שקופיות לשלושה שינויים של 100% אתנול כדי לייבש מקטעי פרפין.
  7. חזור על שלבים 6.10 ו- 6.11 כדי לנקות שקופיות בקסילן ולהרכיב דגימה. לאחר מכן, תמונה עם מיקרוסקופ מורכב המצויד במצלמה.
  8. באמצעות ImageJ, ספרו את סיבי הקולגן האדומים-חיוביים של picrosirius בשלושה שדות אקראיים לפחות עבור כל מקטע. השווה בין שקופיות של MYCN ו- MYCN; מדורי דגים LMO1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לקבוע אם LMO1 מתמזג עם MYCN כדי להשפיע על פתוגנזה NB, מבנים מהונדסים המניעים ביטוי של LMO1 (dβh:LMO1 ו dβh:mCherry) או MYCN (dβh:EGFP-MYCN) בתאי PSNS בשליטה של מקדם dβh הוזרקו לעוברים של דגי זברה13. כפי שמודגם באיור 1A, לאחר פיתוח קווים מהונדסים יציבים ואימות הגנוטיפים שלהם, דגי הטרוזיגוס MYCN ו-LMO1 התערבבו זה בזה. הצאצאים שלהם היו ממוינים עבור MYCN (EGFP +) או LMO1 (mCherry +) ביטוי ב 1 dpf או 3-4 dpf, בהתאמה. הוכח כי ביטוי יתר של MYCN מדכא את התפתחות PSNS6. לכן, הביטוי EGFP-MYCN בולט יותר בתאים העצביים הדופאמין שאינם PSNS ב 1 dpf6, כגון הגרעינים הגולגולתיים (CA), נוירונים catecholaminergic הקשורים לקשת (AAC), ו medulla oblongata (MO). בשל חוסר היציבות של חלבון EGFP-MYCN, האות EGFP הופך עמום יותר לאחר יומיים. לעומת זאת, הביטוי mCherry בולט בשני תאי PSNS, כגון גנגליון צוואר הרחם העליון ותאי עצב דופאמין שאינם PSNS, הכולל CA, AAC, ו- MO, מ 3 dpf ואילך6. לפיכך, הצאצאים של MYCN והזדווגות LMO1 ממוינים ב 1 dpf עבור MYCN (EGFP +) וב 3 dpf עבור LMO1 (mCherry +). הדגים הממוינים הופרדו לקבוצות גנוטיפיות שונות, כדלקמן: i) MYCN, ii) LMO1, iii) MYCN; LMO1, ו- iv) WT, וגדל בתנאים זהים. החל מ 4 wpf, הצאצאים נבדקו דו שבועי לראיות של גידולים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. גושי גידול חיוביים פלואורסצנטיים התגלו ברקמות ובאיברים המרוחקים מאתר הגידול העיקרי בדגים מהונדסים מורכבים עם ביטוי יתר של MYCN ו- LMO1, אך לא בדגים מהונדסים עם ביטוי של MYCN בלבד (איור 1B).

כדי לאמת עוד יותר את הגרורות בבעלי חיים מהונדסים אלה, גידול נושא MYCN ו MYCN; דגים מהונדסים LMO1 בגיל 5 עד 9 חודשים היו נתונים לחתך פרפין וניתוחים אימונוהיסטוכימיקלים עם נוגדן נגד סמן נוירובלסטומה, TH. התוצאות הייצוגיות עבור MYCN; דגי LMO1 מוצגים באיור 2. כתמי H&E של החלקים הקשתים הראו כי הגידול העיקרי נבע מאזור בלוטת יותרת הכליה הבין-יותרת הכליה, המקבילה לדגי הזברה של בלוטת יותרת הכליה האנושית, שהיא האתר הנפוץ ביותר של מחלה ראשונית בחולה נוירובלסטומה 12,22 (איורים 2A,B). הגידול, המורכב מתאים סרטניים זעירים, לא מובחנים ועגולים עם גרעינים היפרכרומטיים, יצר לעתים קרובות שכבות דומות מבחינה היסטולוגית לנוירבלסטומות האנושיות כפי שתואר קודם לכן6 (איורים 2A,B). בהתאם לתצפית על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (איור 1B), זוהו גושי גידול נרחבים הרחוקים מבלוטת הכליות הבין-כליות באזורים רבים, ביניהם: חלק דיסטלי של הכליה (הנישה ההמטופובית הבוגרת העיקרית של דגי זברה ודומה למח העצם של היונקים23) (איור 2A,C), מסלול (איורים 2A,D), גיל (מקביל לריאה היונקית24) (איורים 2A, E), טחול (מקביל לקשרית הלימפה של היונקים25) (איור 2A ו-2F) והקיר הפנימי של תא הפרוזדורים של הלב (איורים 2G). רבים של גרורות אלה recapitulate האתרים הנפוצים של גרורות לראות בחולים עם נוירובלסטומה בסיכון גבוה, הכוללים את מוח העצם, בלוטות הלימפה, אזור המסלול ו lung13,23,24,25. אימונוהיסטוכימיה נוספת עם הנוגדן נגד TH אישרה את השושלת הנוירובלסטית PSNS של תאי הגידול בגידול העיקרי ובכל האתרים גרורתיים (איורים 2H-M).

במאמץ להבין טוב יותר את המנגנונים העומדים בבסיס הסינרגיה בין MYCN ל- LMO1 בהאצת התפשטות גרורתית של הגידול, התגלה כי רמות הביטוי של פאנל של גנים המעורבים בתא הגידול לאינטראקציה מטריצה חוץ-תאית היו גבוהות באופן משמעותי בגידולי הדגים עם ביטוי יתר של MYCN ו- LMO113. כדי לבחון אם המטריצה החוץ-תאית אכן הושפעה מביטוי הגנים שהשתנה בגידולים LMO1-overexpressing המובילים להפצת גידולים או הגירה משופרת, מקטעי הפרפין מ- MYCN בלבד ו- MYCN; גידולי LMO1 היו מוכתמים באדום Picrosirius (PSR), כתם סלקטיבי מאוד לסיבי קולגן, להערכת תצהיר קולגן ונוקשות מטריצה חוץ-תאית (ECM)26,27. כפי שהודגם באיור 3A-E, נמצאו ב-MYCN כמויות מוגברות משמעותית ועובי מוגבר של סיבי קולגן מוכתמים ב-PSR; גידולי LMO1, בהשוואה לגידולים רק מבטא MYCN לבד. יחד, תוצאות אלה ממחישות כי ביטוי יתר של LMO1 יכול לשפץ את הגידול ECM כדי להגדיל את קשיחותו, ולכן, להקל על הפצת תאי הגידול.

Figure 1
איור 1: איור של בדיקת הקרנת הגידול על צאצאים מהתרבות של קווי דגי הזברה הטרנסגניים MYCN ו- LMO1. (א) המחשה סכמטית של מיון והקרנת גידולים של MYCN ו/או LMO1-overexpressing דגים מהונדסים יציבים למחקר נוירובלסטומה. לוחות עליונים: תמונות מייצגות של עוברים EGFP-MYCN+ ביום אחד לאחר ההפריה (dpf) (תצוגה גבית בתצוגה השמאלית והרוחבית מימין). לוחות תחתונים יותר: תמונות מייצגות של עוברים mCherry-LMO1+ ב- 3 dpf (תצוגה לרוחב בצד שמאל ותצוגה גחונית מימין). AAC, נוירונים catecholaminergic הקשורים קשת; CA, גרעינים גולגולתיים; ו MO, מדולה אובלונגטה. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. נוצר עם BioRender.com (B) Coexpression של LMO1 ו- MYCN מקדם גרורות נוירובלסטומה. משמאל: דג טראנסגני מבטא יתר על המידה את MYCN לבדו (MYCN) עם גידול מבטא EGFP (חץ לבן) בגיל 36 חודשים. מימין: דגים מהונדסים מבטאים יתר על המידה הן את MYCN והן את LMO1 (MYCN; LMO1) עם מסת גידול mCherry חיובי באתר הראשי (IRG, חץ לבן) ואתרים גרורתיים מרובים (ראשי חץ מוצק) בגיל 36 חודשים. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הבעת יתר משותפת של MYCN ו-LMO1 מקדמת גרורות רחוקות של נוירובלסטומה במודל של דגי זברה מהונדסים. (א-ג'י) חלקים קשתיים מוכתמים H&E של MYCN; דג מהונדס LMO1 בגיל 6 חודשים. (ח-מ) תצוגות מוגדלות של ניתוחים אימונוהיסטוכימיים של MYCN; דג מהונדס LMO1 בחלקי רקמת קשת, באמצעות טירוזין הידרוקסילאז (TH) נוגדן. תיבה לבנה מתארת את בלוטת יותרת הכליה (b, h), עם תצוגות מוגדלות בחלוניות B ו- H. תאים סרטניים מופצים נמצאו במח כליות (c, i, C, ואני עם ראשי חץ שחורים מוצקים), הסקלרה של העין (d, j, D ו - J עם חצים פתוחים שחורים עם קווי מתאר ולבנים מלאים), הזימים (e, k, E ו - K עם ראשי חץ פתוחים מלאים בשחור ולבן), הטחול (f, l, F ו - L עם חצים שחורים מוצקים), ותא הלב (G ו - M עם קווי מתאר שחורים ולבנים מלאים ראשי חץ כפולים). סרגלי קנה מידה, 100 מיקרומטר (A) ו 50 מיקרומטר (B-M). נתון זה שונה מ Zhu, S. et al. LMO1 סינרגטיזציה עם MYCN כדי לקדם ייזום נוירובלסטומה גרורות. תא סרטן. 32, 310-323 (2017)13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ביטוי LMO1 מוגבר מקדם תצהיר קולגן ונוקשות ECM המובילה להפצת תאי הגידול במודלים של דגי זברה. (א-ד) תמונות מיקרוסקופיות אור מייצגות של סיבי קולגן מוכתמים באדום פיקרוזיריוס (PSR) ב- MYCN בלבד (A,B) או MYCN; דגי זברה מהונדסים מסוג LMO1 (C,D) מהונדסים. (B) ו- (D) מוגדלים מהאזורים בקופסאות של (A) ו- (C), תוך שימוש בחצים (A ו- B) ובראשי חץ (C ו- D) כדי לציין את סיבי הקולגן החיוביים ל- PSR, בהתאמה. סרגלי קנה מידה, 100 מיקרומטר (A ו- C) ו 50 מיקרומטר (B ו- D). (ה) כימות של אזורים מוכתמים PSR על מקטעי הגידול של MYCN בלבד או MYCN; דג מהונדס LMO1. התוצאות היו מנורמלות לממוצע של אזורים מוכתמים PSR בגידולים MYCN בלבד. הסטטיסטיקה המוצגת כממוצע ± SD של שלושה MYCN בלבד או שלושה MYCN; גידולי LMO1; p = 0.02 על ידי מבחן t דו-זנבי. נתון זה שונה מ Zhu, S. et al. LMO1 סינרגטיזציה עם MYCN כדי לקדם ייזום נוירובלסטומה גרורות. תא סרטן. 32, 310-323 (2017)13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דגי זברה משמשים בדרך כלל במחקר בעשורים האחרונים, במיוחד בחקר הסרטן, מסיבות ברורות, כגון קלות התחזוקה שלו, רבייה חזקה, ויתרונות ברורים להדמיית vivo1,28. מודל דגי הזברה יכול להיות מניפולציה בקלות עוברית בשל ההפריה החיצונית שלהם והתפתחות, אשר משלים היטב אורגניזמים מודל יונקים, כגון חולדות ועכברים, למחקרים גנטיים בקנה מידה גדול1,2,3. יתר על כן, לגנום דגי הזברה יש דמיון ברמה גבוהה לגנום האנושי. בהשוואת הביאורים המפורטים של הגנום של דגי הזברה לגנום הייחוס האנושי, כ -70% מהגנים האנושיים הוכחו כמקבלים אורתולוג של דגי זברה29. בנוסף, שימושים אחרים של דגי זברה במחקר הורחבו לגילוי תרופות ואווטארים של מטופלים לטיפול פרטני בסרטן30,31. מחקרים מצטברים הראו כי גידולים הנגרמים בדגי זברה דומים לגידולים אנושיים ברמות ההיסטולוגיות והמולקולריות, אשר יכולים לסייע בניתוח של ייזום הגידול, התקדמות והטרוגניות32,33. יחד, דגי הזברה מדגימים פוטנציאל עצום כמודל בעלי חיים בעל ערך שניתן להשתמש בו כדי לחקור גרורות ולהבהיר מסלולים אונקוגניים אפשריים המעורבים בפתוגנזה של מחלות.

באמצעות מודל דגי הזברה מהונדסים עם ביטוי יתר של LMO1 ו- MYCN, שיתוף הפעולה בין שני האונקוגנים האלה בגידול NB וגרורות הוכח בבירור. עם הזמינות של היום של טכניקות הדמיה חיה רבת עוצמה, מסכי גידול יכולים להתבצע בקלות דו שבועי גרורות ניתן לעקוב אחר לאורך זמן. הגרורות הנרחבות יכולות להיות מאושרות עוד יותר על ידי חתך פרפין וכתמי נוגדנים. באופן בולט, הגרורות שזוהו ב- MYCN; דגי זברה LMO1 מתואמים היטב עם האתרים הנפוצים של גרורות שנראו במקרים בסיכון גבוה של NB, כגון במח העצם, בלוטות הלימפה, המסלול והריאות34,35, ותמיכה נוספת בדגי זברה כמודל ריאלי ומועיל למחקר גרורות.

יתר על כן, בשל גודל הגוף הקטן יחסית, ניתן לחלק את כל דגי הזברה אם כי לחלוטין, וזה עוד יתרון ברור של מודל זה, המאפשר אפיון יסודי של הגידול העיקרי יחד עם הגרורות באזורים אחרים של הגוף. הכתם האדום של פיקרוזיריוס של חלקי הגידול הדגיש בבירור את רשתות הקולגן בגידולי דגים ומדגים את הנוקשות המוגברת של מטריצה חוץ-תאית בגידולים עם ביטוי יתר של LMO1 . למרות שטכניקה זו אינה ייחודית לדגי זברה, היישום שלה יחד עם הקרנת תרכובת תפוקה גבוהה על עוברים דגי זברה כי הם מהונדסים גנטית או מושתלים עם תאים סרטניים עשוי לספק אמצעי חדשני בסינון עבור תרכובות יעילות שיכולות למקד שיפוץ מטריצה חוץ תאית, שהוא תהליך קריטי המעורב גרורות תאי הגידול.

מודלים יציבים של דגי זברה מהונדסים מועילים לנו מאוד להבין את תרומתם של אונקוגנים מועמדים להתפתחות הגידול ב- vivo, אם כי זה יכול להיות מאתגר ומייגע לפתח קווים אלה. יצירת קו מהונדס יציב דורשת פרק זמן ארוך מכיוון שיש לרכוש דורות רבים לפני התפשטות הקו. יתר על כן, הפצת קווים אלה יכולה להיות מייגעת, וייתכן שיהיה צורך בתוכניות הזדווגות אסטרטגיות. לדוגמה, הפרודוקטיביות של דג מהונדס MYCN מצטמצמת לעתים קרובות באופן משמעותי לאחר שהגידול התפתח, ודגים מהומזיגוס MYCN מהונדסים אינם שורדים היטב עד לבגרות. לכן, כדי לשמור טוב יותר על קו הדגים המהונדסים MYCN , מומלץ לעקוף את דגי MYCN מהונדסים שאינם נושאי גידולים בגיל צעיר יותר עם WT או קווי דגים מהונדסים גנטית אחרים, כגון קו הדגים הטרנסגני LMO1 . כדי להתגבר על האתגרים בפיתוח ושמירה על קווי דגים מהונדסים יציבים, טרנסגנזה חולפת פסיפס עשויה להיות גישה חלופית להערכה מהירה ויעילה של תרומתו של גן יחיד או שילוב של גנים לתחילת הגידול והתקדמות בדגים מוזרקים בעיקר. בנוסף, דפוס הפסיפס של שילוב טרנסג'ן בדגים המוזרקים העיקריים עשוי לחקות טוב יותר את המחלה פתוגנזה, במיוחד אלה הנגרמים על ידי אירועים סומטיים36.

עם זאת, כמו כל מודל אחר של בעלי חיים המשמש במחקר לחקר הסרטן, לדג הזברה יש גם את החסרונות שלו. לדוגמה, נוגדנים במיוחד נגד חלבונים דגי זברה נשארים במידה רבה מפותחים, אם כי כמה נוגדנים נגד גנים סמן נוירובלסטומה - כגון טירוזין הידרוקסילאז, סינפטופיזין, ו HuC-הם למרבה המזל עובד היטב דגי זברה6,13. כדי להילחם בבעיה זו, ספקים רבים החלו לבדוק את המוצרים שלהם ולחזות את הפוטנציאל של הנוגדנים שלהם בתגובה צולבת עם חלבונים דגי זברה. מידע נוסף על נוגדנים מאומתים ניתן למצוא גם ברשת המידע של דגי הזברה (ZFIN). עם מאמצים אלה, יותר ויותר נוגדנים שיכולים לזהות באופן ספציפי חלבוני דגי זברה בקרוב יהפכו לזמינים לקהילת דגי הזברה. אתגר נוסף של שימוש בדגי זברה כמודל גנטי לניתוח יחסי הגומלין של מסלולי איתות מורכבים בפתוגנזה של NB הוא הגנום המשוכפל חלקית שלו. שכפול גנום כזה, שהתרחש במוצא הטבעי של דגי זברה37,38, יכול לעתים קרובות להוביל ליותר מגרסה אחת של הומולוגים של דגי זברה לבני אדם. זה יכול לגרום לרווח מפותח של פונקציות גנים חדשניות או דפוסי ביטוי ייחודיים במודל החי39. לכן, כאשר לומדים גנים עם תפקידים פוטנציאליים בדיכוי הגידולים, ייתכן שיהיה צורך באללים מרובים של הגנים המשוכפלים להיות בנוקאאוט בו זמנית כדי להדגים את תפקוד דיכוי הגידול שלהם, אשר יכול להיות פוטנציאל זמן רב ומאמץ מאתגר מבחינה טכנית.

עם זאת, מודל דגי הזברה הטרנסגניים יכול לשחזר בנאמנות את כל שלבי גרורות הגידול ב- vivo, ויש לו יתרונות ברורים לניתוח גנטי והדמיה בזמן אמת של הפצת הגידול. מערכת מודל זו, אם כן, מציעה לנו כלי ייחודי לטיפול בשאלות מרתיעות רבות בתחום, כגון מה האירועים המולקולריים והתאיים שבבסיס התהליך הרב-שלבי של הפצת גידול וגרורות ב- vivo , כאשר תאי ה- NB מופצים מגידולים ראשוניים, וכיצד מיקרו-סביבה של הגידול תורם לגרורות NB. עם החוסן של דגי זברה להקרנה ובדיקה של סמים, מודל הדגים יספק גם אמצעי בעל ערך להערכת היעילות של סוכנים ומעכבים חדשניים כדי למנוע או לטפל NB גרורתי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 CA240323 (S.Z. ) מהמכון הלאומי לסרטן; מענק W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) ממשרד ההגנה של ארצות הברית (DoD); פרס V Scholar מטעם קרן V לחקר הסרטן (S.Z.) ומענק פלטפורמה ממרכז מאיו לגילוי ביו-רפואי (S.Z.); ותומכים ממרכז מאיו קליניק לסרטן והמרכז לרפואה אישית (ש.ז.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit Vector SK-4100
Acetic Acid Fisher Scientific / Acros Organic 64-19-7
Agarose GP2 Midwest Scientific 009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody Pel-Freez P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit Vector SP-2001
BOND Intense R Detection Leica Biosystems DS9263
BOND primary antibody diluent Leica Biosystems Newcastle, Ltd. AR9352
BOND-MAX IHC instrument Leica Biosystems Newcastle, Ltd. N/A fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone BACPAC resources center (BRFC) N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera Olympus AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) Richard-Allan Scientific 8312-4
Eosin Leica 3801601 ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol Carolina 86-1263
Expand Long Template PCR System Roche Applied Science, IN 11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) Dako E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC HHS-32-1L
HRP Avidin D Vector A-2004
Hydrochloric Acid Aqua Solutions 4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3% Fisher Scientific H324-500
I-SceI enzyme New England Biolabs, MA R0694L
Kanamycin sulfate Teknova, Inc. K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 34133
Lithium Carbonate Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC 554-13-2
Microtome for sectioning Leica Biosystems RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404006
p3E-polyA  Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah N/A a generous gift
(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax Surgipath Paraplast 39603002 Parrafin to parafin
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany N/A a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector Thermo Fisher Scientific 12536-017
pDONRP4-P1R donor vector  Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah N/A a generous gift
Phenol red, 0.5% Sigma Aldrich  P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X BioRad 1610780
Picrosirrius red stain kit Polysciences 24901-250
pME-mCherry Addgene 26028
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Roche 21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit Qiagen 27104
RDO Rapid Decalcifier Apex Enginerring RDO04
Sodium Azide (NaN3) Sigma Aldrich 26628-22-8
Stereo fluorescence microscope Leica MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging Nikon SMZ-1500
Taq DNA Polymerase New England Biolabs, MA M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor Sakura N/A Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S Western Chemical Incorporated 20513
Xylene Thermo Fisher Scientific X3P1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
  2. Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
  3. Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
  4. Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
  5. Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
  6. Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  7. Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), London, England. 2106-2120 (2007).
  8. Park, J. R., et al. Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
  9. Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
  10. Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
  11. Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
  12. Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
  13. Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
  14. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
  15. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  16. Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
  17. Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
  18. Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
  19. Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
  20. Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  22. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  23. Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
  24. Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
  25. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  26. Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
  27. Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
  28. Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
  29. Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  30. Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
  31. Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
  32. Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
  33. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
  34. Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), London, England. 466-470 (2006).
  35. Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
  36. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  37. Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), New York, N.Y. 1711-1714 (1998).
  38. Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
  39. Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).

Tags

חקר הסרטן גיליון 169
מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Her, Z. P., Yeo, K. S., Howe, C.,… More

Her, Z. P., Yeo, K. S., Howe, C., Levee, T., Zhu, S. Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis. J. Vis. Exp. (169), e62416, doi:10.3791/62416 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter