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Biology

Isolement de cellules valvulaires primaires humaines pour la modélisation in vitro de maladies

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62439
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3
1Division of Cardiology, Department of Medicine, and the Pittsburgh Heart, Lung, and Blood Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Cardiothoracic Surgery, University of Pittsburgh and Heart and Vascular Institute, University of Pittsburgh Medical Center, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

Summary

Ce protocole décrit la collecte de valves aortiques humaines extraites au cours de procédures chirurgicales de remplacement de valve aortique ou de tissu cadavérique, ainsi que l’isolement, l’expansion et la caractérisation ultérieurs de cellules endothéliales et interstitielles valvulaires primaires spécifiques au patient. Sont inclus des détails importants concernant les processus nécessaires pour assurer la viabilité cellulaire et la spécificité du phénotype.

Abstract

La valvulopathie aortique calcifiée (CAVD) est présente chez près d’un tiers de la population âgée. L’épaississement, le raidissement et la calcification de la valve aortique provoquent une sténose aortique et contribuent à l’insuffisance cardiaque et aux accidents vasculaires cérébraux. La pathogenèse de la maladie est multifactorielle et les stress tels que l’inflammation, le remodelage de la matrice extracellulaire, l’écoulement turbulent et le stress et la tension mécaniques contribuent à la différenciation ostéogénique des cellules endothéliales valvulaires et interstitielles valvulaires. Cependant, les facteurs initiateurs précis qui conduisent la transition ostéogénique d’une cellule saine dans une cellule calcifiante ne sont pas entièrement définis. De plus, le seul traitement actuel pour la sténose aortique induite par la CAVD est le remplacement valvulaire aortique, par lequel la valve native est retirée (remplacement chirurgical de la valve aortique, SAVR) ou une valve de remplacement entièrement repliable est insérée via un cathéter (remplacement transcathéter de la valve aortique, TAVR). Ces interventions chirurgicales ont un coût élevé et comportent des risques graves; Il est donc impératif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la découverte de médicaments. À cette fin, la présente étude développe un flux de travail où les tissus prélevés chirurgicalement sur les patients et les tissus de cadavres de donneurs sont utilisés pour créer des lignées primaires de cellules valvulaires spécifiques au patient pour la modélisation in vitro de la maladie. Ce protocole introduit l’utilisation d’une solution de stockage frigorifique, couramment utilisée dans la transplantation d’organes, pour réduire les dommages causés par le temps d’approvisionnement souvent long entre l’excision tissulaire et le traitement en laboratoire avec l’avantage de stabiliser considérablement les cellules du tissu excisé. Les résultats de la présente étude démontrent que les cellules valvulaires isolées conservent leur capacité proliférative et leurs phénotypes endothéliaux et interstitiels en culture jusqu’à plusieurs jours après le retrait de la valve du donneur. L’utilisation de ces matériaux permet la collecte de cellules témoins et de cellules CAVD, à partir desquelles les lignées cellulaires de contrôle et de maladie sont établies.

Introduction

La valvulopathie aortique calcifiée (CAVD) est une pathologie chronique caractérisée par une inflammation, une fibrose et une macrocalcification des feuillets valviques aortiques. Le remodelage progressif et la calcification des feuillets (appelé sclérose aortique) peuvent entraîner une obstruction du flux sanguin (sténose aortique) qui contribue à un accident vasculaire cérébral et conduit à une insuffisance cardiaque. Actuellement, le seul traitement de la CAVD est le remplacement chirurgical ou transcathéter de la valve aortique (SAVR et TAVR, respectivement). Il n’y a pas d’option non chirurgicale pour arrêter ou inverser la progression de la CAVD, et sans remplacement valvulaire, les taux de mortalité approchent 50% dans les 2-3 ans 1,2,3. La définition des mécanismes sous-jacents à l’origine de cette pathologie permettra d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques potentielles.

Chez un adulte en bonne santé, les feuillets valviques aortiques ont une épaisseur d’environ un millimètre et leur fonction principale est de maintenir le flux sanguin unidirectionnel hors du ventricule gauche4. Chacun des trois feuillets est composé d’une couche de cellules endothéliales valvulaires (CVE) qui tapisse la surface externe du feuillet et fonctionne comme une barrière. Les CVE maintiennent l’homéostasie valvulaire en régulant la perméabilité, l’adhésion cellulaire inflammatoire et la signalisation paracrine 5,6,7. Les cellules interstitielles valvulaires (CIV) constituent la majorité des cellules de la notice valvulaire8. Les CIV sont disposés en trois couches distinctes dans la notice. Ces couches sont connues sous le nom de ventricularis, de spongiosa et de fibrosa9. Le ventricule fait face au ventricule gauche et contient des fibres de collagène et d’élastine. La couche intermédiaire, la spongiose, contient une teneur élevée en protéoglycane qui offre une flexibilité de cisaillement pendant le cycle cardiaque. La couche externe de fibrose est située près de la surface d’écoulement du côté aortique et est riche en collagène fibrillaire de type I et de type III qui fournit la force nécessaire pour maintenir la coaptation pendant la diastole10,11,12. Les CIV résident dans un état de repos, cependant, des facteurs tels que l’inflammation, le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) et le stress mécanique peuvent perturber l’homéostasie VIC 8,9,13,14,15,16. Avec la perte d’homéostasie, les CIV activent et acquièrent un phénotype de type myofibroblaste capable de prolifération, de contraction et de sécrétion de protéines qui remodèlent le millieuextracellulaire 17. Les CIV activés peuvent se transformer en cellules calcifiantes, ce qui rappelle la différenciation d’une cellule souche mésenchymateuse (CSM) en un ostéoblaste 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

La calcification semble s’initier dans la couche de fibrose riche en collagène à partir des contributions des CVÉ et des VIC, mais se dilate et envahit les autres couches de la foliole8. Ainsi, il est clair que les CVÉ et les CIV répondent aux stimuli pour réguler positivement l’expression des gènes ostéogéniques, mais les événements précis conduisant à l’activation des gènes ostéogéniques, ainsi que l’interaction complexe entre les cellules et la matrice extracellulaire du feuillet, restent mal définis. Les modèles murins ne sont pas une source idéale pour étudier les facteurs non génétiques de la pathogenèse de la CAVD, car les souris ne développent pas de CAVDde novo 26,27, d’où la nécessité d’utiliser des tissus humains primaires et des lignées cellulaires primaires isolées de ces tissus. En particulier, l’obtention de ces cellules en grand nombre et de bonne qualité est impérative, car le domaine des cultures cellulaires 3D et de la modélisation organoïde est en pleine expansion et est susceptible de devenir une alternative humaine ex vivo aux modèles murins.

Le but de la présente méthode est de partager un flux de travail qui a établi les conditions pour isoler et cultiver efficacement les CVÉ et les CIV obtenus à partir de valves prélevées chirurgicalement de donneurs humains. Des études antérieures ont montré l’isolement réussi des CVÉ et des CIV à partir de valves porcines28 et murines29, à notre connaissance, c’est la première à décrire l’isolement de ces cellules dans les tissus humains. Le protocole décrit ici est applicable aux valves excisées humaines et contourne et améliore considérablement les dommages causés par le temps d’approvisionnement souvent long entre l’excision tissulaire et le traitement en laboratoire en introduisant l’utilisation d’une solution de stockage frigorifique, une solution tamponnée cliniquement utilisée dans les transplantations d’organes qui stabilise considérablement les cellules du tissu excisé. Le protocole décrit ici montre également comment déterminer le phénotype cellulaire et garantir une efficacité élevée de la survie cellulaire avec une contamination croisée cellulaire minimale.

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Protocol

Tous les échantillons de patients sont prélevés auprès de personnes inscrites à des études approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Pittsburgh conformément à la Déclaration d’Helsinki. Les tissus cadavériques obtenus par l’intermédiaire du Center for Organ Recovery and Education (CORE) ont été approuvés par le Comité de surveillance de la recherche et de la formation clinique impliquant des défunts (CORID) de l’Université de Pittsburgh.

1. Homologation et sécurité

  1. Obtenir l’approbation du Comité d’examen institutionnel (CISR) ou une note de service exemptée pour toute collecte d’échantillons de patients ou de tissus cadavériques conformément à la Déclaration d’Helsinki.
  2. Suivre la formation institutionnelle requise pour travailler avec les tissus humains, comme la formation sur les pathogènes transmissibles par le sang, la recherche biomédicale sur des sujets humains, la protection de la vie privée et la sécurité de l’information, ainsi que le transport et l’expédition de matériel biologique.

2. Logistique et préparation

  1. Échantillons chirurgicaux
    1. Assurez-vous qu’un réfrigérateur est disponible et situé près de la salle d’opération. Conservez dans ce réfrigérateur des tubes coniques préétiquetés de 50 mL avec une nomenclature anonymisée contenant 40 mL d’aliquotes stériles de solution d’entreposage frigorifique à l’usage du personnel chirurgical. Ces tubes sont stables à 4 °C jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’emballage d’origine.
    2. Lors de l’extraction, placez le tissu valvulaire dans ces tubes. Placez les tubes dans un contenant secondaire scellé, comme un sac de plastique étanche ou un contenant en plastique étiqueté avec une étiquette de risque biologique. Les tissus sont ramassés et transportés sur la glace conformément aux protocoles institutionnels de transport des risques biologiques.
  2. Échantillons cadavériques
    1. Immerger les organes récupérés dans une solution frigorifique, les placer dans une enceinte de confinement secondaire scellée et les transporter sur la glace conformément aux protocoles institutionnels de transport des risques biologiques.

3. Préparation des réactifs

  1. Faites des assiettes enduites de collagène au moins la veille.
    1. Dans un tube conique de 50 mL, mélanger 5 mL d’alcool isopropylique, 8,7 mL d’acide acétique et 0,5 μg de poudre de collagène I. Porter jusqu’à 50 ml avec de l’eau stérile. Mélanger et filtrer à travers un filtre de 0,45 μm.
    2. Sous une hotte de culture cellulaire stérile, ajouter suffisamment de solution de collagène dans les assiettes de 6 puits et les boîtes de 10 cm pour couvrir tout le fond. Couvrir la plaque et laisser reposer pendant 4-6 h à température ambiante. Retirer l’excès de solution à l’aide d’une pipette stérile, placer dans un nouveau tube conique stérile de 50 ml et conserver à 4 °C pour faire des plaques supplémentaires. La solution peut être conservée à 4 °C pendant plusieurs mois.
    3. Sécher les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant une nuit, puis les conserver dans un sac refermable à 4 °C. Les assiettes et les plats enduits de collagène peuvent être conservés pendant plusieurs mois.
  2. Autoclaver les articles suivants: pinces à tissu, ciseaux à tissu, cotons-tiges et compresses de gaze.
  3. Milieu de croissance VEC : Préparer et utiliser le milieu de croissance des cellules endothéliales conformément aux protocoles du fabricant. Conserver à l’obscurité à 4 °C. Chauffer à 37 °C juste avant utilisation sur les cellules, ne pas laisser le média dans un bain chauffant plus longtemps que nécessaire (10-15 min suffisent). Utilisez le support dans le mois suivant la préparation.
  4. Milieu de croissance VIC : Supplément DMEM milieu de base (4,5 g/L de glucose, supplément de L-glutamine, 110 mg/L de pyruvate de sodium)30 avec 10 % de FBS inactivé par la chaleur et 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Conserver à l’obscurité à 4 °C jusqu’à 3 mois. Chauffer à 37 °C juste avant utilisation sur les cellules, ne pas laisser le média dans un bain chauffant plus longtemps que nécessaire (10-15 min suffisent).
  5. Préparer une solution de rinçage stérile juste avant utilisation. Complétez le PBS stérile avec 2,5 μg/mL de fongicide, 0,05 mg/mL de gentamicine et 5 μg/mL de bactéricide.
  6. Préparer une solution de collagénase stérile juste avant utilisation. Ajouter 5 mg de collagénase II à 5 mL de milieu de base DMEM frais stérile. Bien mélanger et stériliser la solution en passant à travers un filtre de 0,45 μm. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation.

4. Préparation et traitement des tissus

REMARQUE : L’approbation de l’établissement pour l’utilisation de tissus humains doit être obtenue avant le début des travaux. Lors de la manipulation de mouchoirs, l’équipement de protection individuelle (EPI) suivant doit être porté : une blouse enveloppante jetable à barrière liquide ou une blouse de laboratoire à boutons spéciaux avec un tablier enveloppant à barrière liquide et des trèfles jetables; un écran facial complet ou des lunettes de sécurité avec un masque chirurgical; gants doubles; chaussures fermées; et des vêtements pour couvrir les jambes. Des diagrammes de flux de travail complets de la préparation tissulaire pour l’évaluation de la calcification (section 5) et l’isolement cellulaire (sections 6 et 7) sont illustrés respectivement à la figure 1A, B .

  1. À la réception du spécimen d’organe cadavérique, exciser la racine aortique et l’immerger dans un tube conique de 50 ml de solution de rinçage stérile. À la réception de l’échantillon chirurgical, retirer des récipients de transport et l’immerger dans un tube conique de 50 ml de solution de rinçage stérile. Placer le tube contenant le tissu dans un seau à glace sur la bascule et mélanger pendant 10 minutes à température ambiante (RT).
    REMARQUE : Le traitement des tissus aussi près que possible du moment de l’extraction donnera la meilleure récupération cellulaire, mais les cellules viables peuvent être prélevées plus de 61 heures après l’excision, et les données montrent que les CVI sont plus robustes que les CVÉ à mesure que le temps augmente. Si le tissu ne peut pas être traité immédiatement, si possible, retirez le tissu, effectuez l’étape 4.1, puis remettez le tissu dans une solution fraîche stérile d’entreposage frigorifique et maintenez-le à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à commencer. Les valves recueillies pendant les chirurgies de nuit ou de fin de semaine peuvent être stockées dans une solution d’entreposage frigorifique de 40 ml à 4 °C et peuvent encore produire des cellules viables plus de 2 jours après l’extraction.
  2. Vaporiser des tubes avec de l’éthanol à 70% et passer à une hotte stérile. Retirer les mouchoirs et exciser deux feuillets de valve (figure 2A). Placer une notice dans un flacon cryogénique (ou 2-3 flacons si plusieurs petits morceaux sont nécessaires pour une analyse future) et congeler en laissant tomber de l’azote liquide, puis conserver à -80 °C.
    1. Si la valve est bicuspide, ne couper qu’une seule notice. À l’aide de ciseaux, couper le feuillet en deux du nodule à la charnière. Utilisez la moitié de la notice pour la congélation instantanée et l’autre moitié pour l’étape 4.3.
  3. Traiter la deuxième notice pour l’incorporation de paraffine afin d’évaluer la teneur en calcification en la coupant en deux du nodule à la charnière. Placer les deux morceaux dans une cassette immergée dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 %, puis placer sur une bascule à TA pendant au moins 2 h mais pas plus de 4 h.
    REMARQUE: Des temps de fixation plus longs créent plus de fond avec la coloration immunofluorescente. Une fois les étapes 4.2 et 4.3 effectuées, passez immédiatement à la section 6 et revenez à l’étape 4.4 après l’étape 6.12.
  4. Après la fixation, laver les tissus en les immergeant dans du PBS frais pendant 1 h 3-4 fois. Après ces lavages, les échantillons peuvent rester dans du PBS à 4 °C pendant plusieurs mois si nécessaire. Passez à l’étape suivante juste avant l’intégration.
  5. Passez progressivement du PBS à l’éthanol à 70%. Laver 30-60 min à chaque étape avec 1:4 70% éthanol:PBS; 1:1 70% éthanol:PBS, 4:1 70% éthanol:PBS; 70% d’éthanol.
  6. Encastrer le tissu de manière à ce que les coupes révèlent les trois couches de la notice (figure 1A) conformément aux protocoles établis31. Alternativement, et si disponible, amener le tissu à un noyau pathologique pour l’encastrement et la coupe.
  7. Après avoir manipulé des mouchoirs, jetez ou entreposez l’EPI au besoin et lavez-vous les mains immédiatement. Décontaminez tout l’équipement, les surfaces et les déchets solides et liquides avec une dilution de 1:10 d’eau de Javel ou de désinfectant détergent. Laisser agir 20 min pour la décontamination, puis rincer à 70 % à l’éthanol. Traiter la hotte de culture cellulaire avec un spray de mycoplasme conformément aux instructions du fabricant.

5. Coloration de Von Kossa pour la teneur en calcium

REMARQUE: Cela peut être fait bien après l’isolement cellulaire et l’établissement de la ligne, mais assurez-vous de relier le niveau de calcification du tissu aux documents relatifs à la lignée cellulaire primaire établie.

  1. Couper des tranches de paraffine de 5 ou 10 μm d’épaisseur sur des lames de verre et cuire les lames à 65 °C pendant 1 h, puis laisser refroidir à TA.
  2. À l’aide de solutions fraîches, déparaffiniser les lames en les immergeant comme suit : 100 % xylène pendant 30 min, 2x ; 100% éthanol pendant 3 min, 2x; 90% d’éthanol pendant 3 min; 80% d’éthanol pendant 3 min; 70% d’éthanol pendant 3 min; 50% d’éthanol pendant 3 min; eau ultrapure pendant 3 min; Conserver dans de l’eau ultrapure jusqu’aux prochaines étapes.
    REMARQUE: Les temps ci-dessus sont minimaux, chaque étape peut durer plus longtemps.
  3. Procéder à la coloration Von Kossa selon les protocoles du fabricant.
  4. Évaluer la zone valvulaire complète au microscope et attribuer un tissu témoin (aucun signe de calcification) ou un CAVD (tout signe de calcification, Figure 2B).

6. Isolement, expansion et confirmation des cellules endothéliales valvulaires (CVE)

  1. Dans une hotte de culture cellulaire stérile, ouvrir le tube conique contenant le feuillet valvulaire restant et placer le feuillet dans un nouveau tube conique de 50 ml rempli de PBS glacé. Bouchon tube et retourner doucement ou placer sur une bascule pendant 2 min à TA.
  2. Retirer le mouchoir dans un plat de 60 mm rempli de 5 à 7 ml de solution froide de collagénase. À l’aide de forceps, tremper les deux côtés de la notice dans la solution 3-4 fois. Incuber le tissu pendant 5-10 min dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C, en berçant doucement le tissu toutes les 2 minutes 3-4 fois.
  3. Retirer 2 mL de la solution de la capsule et placer dans un tube conique stérile de 15 mL. Placez une pince sur le nodule et utilisez un coton-tige sec et stérile pour glisser de la pince à la charnière, en faisant tourner l’écouvillon tout en le déplaçant le long de la notice. Entre chaque balayage, agiter l’écouvillon dans la solution dans le tube conique de 15 ml pour enlever les cellules. Répétez l’opération pour frotter complètement la surface du tissu, puis retournez et répétez de l’autre côté.
  4. En tenant le feuillet de la valve avec une pince dans une main et une pipette de 1 ml dans l’autre, rincez les surfaces du feuillet avec la solution dans le plat. Une fois rincé, transférer toute la solution contenant les CVÉ dans la capsule dans le même tube conique de 15 ml avec les cellules de l’écouvillon et passer à l’étape 6.5. Placer le tissu valvulaire restant dans un nouveau tube conique de 15 mL contenant 7 mL de solution de collagénase stérile et passer à l’étape 7.1.
  5. Centrifuger le tube contenant les CVÉ à 180 x g pendant 5 min pour granuler les CVÉ isolés. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 3 mL de milieu de culture CEV. Centrifuger une fois de plus et retirer le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de croissance et déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et du bleu de trypan.
  6. Resuspendre la pastille de CVE dans 2 mL de milieu de croissance de la CVE et plaquer les cellules dans un puits pré-enduit de collagène d’une plaque de 6 puits à environ 5 x 105 cellules/cm2. Laissez les cellules pousser au moins 3-4 jours, puis retirez le milieu et reconstituez-les avec un milieu frais. Répétez le changement de média tous les 4 jours. Les CVÉ pousseront en plaques pavées (figure 3B, panneaux de gauche).
  7. Lorsque les patchs VEC couvrent >80% de la plaque, diviser les cellules à environ 1,3 x 104 cellules/cm 2 selon la vitesse à laquelle elles se développent (si elles atteignent 80% en moins de 1 semaine à un nombre légèrement inférieur de cellules/cm2).
  8. Pour se diviser, laver les cellules deux fois avec 2 ml de DPBS, puis ajouter suffisamment de réactif de dissociation pour couvrir simplement la surface des cellules. Incuber pendant 2-3 min à 37 °C, en vérifiant que les cellules ne sont pas surincubées. Arrêtez la digestion en ajoutant un volume égal de milieu de croissance VEC et transférez le liquide dans un tube de 15 mL. Centrifuger à 180 x g pendant 5 min, enlever le surnageant et remettre en suspension dans le volume approprié de fluide pour le nombre de puits/plaques nécessaires.
    NOTE: Une fois élargis en une plaque de 10 cm, les CVÉ peuvent parfois perdre leur morphologie et changer de phénotype à mesure qu’ils prolifèrent. Cela tend à se produire lorsque les CVÉ sont ensemencés à une faible confluence lors de l’établissement et de l’expansion de la lignée cellulaire.
  9. Pour garantir une culture pure, envisagez d’utiliser des perles superparamagnétiques CD31+ à chaque fractionnement.
  10. Pour 1 x 108 cellules ou moins (une boîte de 10 cm ou moins), préparer 25 μL de billes superparamagnétiques en les lavant selon les protocoles du fabricant.
    REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer l’étape 6.10 avant la trypsinisation des CVÉ.
  11. Détacher les cellules comme à l’étape 6.8, mais remettre en suspension dans 500 μL de PBS avec 0,1% de BSA, pH 7,4, et placer dans un tube à centrifuger de 2 mL. Ajouter 500 μL de billes lavées et remises en suspension dans le tube de 2 mL de cellules et incuber sur un rotateur pendant 20 min à 4 °C.
  12. Placez les tubes sur l’aimant pendant 2 min. Pendant que le tube est encore dans l’aimant, retirez soigneusement le surnageant. Retirer le tube de l’aimant, ajouter 1 mL de PBS frais avec 0,1% de BSA, pipeter doucement 2-3 fois, puis remettre sur l’aimant pendant 2 min. Répétez 2 fois de plus. Après le retrait final du tampon, remettre les cellules en suspension dans le milieu de croissance en volume nécessaire au replatage.
    REMARQUE: Les cellules auront toujours des perles, mais celles-ci n’affecteront pas la croissance et seront éliminées dans les passages suivants.
  13. Une fois que les cellules ont été dilatées, en plus de la morphologie, confirmer le phénotype VEC par coloration positive pour les marqueurs immunofluorescents tels que le facteur von Willebrand (vWF), la cadhérine 5 (CDH5) ou PECAM-1 / CD31, et la coloration négative pour les marqueurs VIC tels que la calponine 1 (CNN) ou l’actine du muscle lisse alpha-2 (αSMA, Figure 4, panneaux de gauche).

7. Isolation, expansion et stockage des cellules interstitielles valvulaires (CIV)

  1. Comme indiqué à l’étape 6.4, après avoir retiré les CVÉ du tissu valvulaire, la notice est placée dans un tube conique de 15 mL avec une solution de collagénase de 7 mL. Incuber pendant 12 h dans l’incubateur de culture cellulaire avec le bouchon légèrement ouvert pour permettre les échanges gazeux. L’isolement réussi des CIV peut encore se produire jusqu’à 18 heures dans une solution de collagénase.
  2. Après l’incubation, dans une hotte de culture cellulaire stérile, mélanger doucement le tissu en le pipetant avec une pipette sérologique pour assurer la libération des CIV du tissu foliole.
  3. Retirer la suspension cellulaire et passer à travers un filtre de 0,70 μm dans un tube conique de 50 mL.
  4. Ajouter 7 mL de milieu de croissance VIC dans le tube de 50 mL et centrifuger à 180 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de croissance VIC et déterminer le nombre de cellules. Plaquer les CIV dans une capsule traitée par culture tissulaire de 60 mm à 1,3 x 104 cellules/cm2.
  5. Laissez les cellules se développer au moins 1-2 jours avant de remplacer le milieu. Retirer le média et laver deux fois le DPBS pour éliminer les débris résiduels et le remplacer par un milieu de croissance frais. Réapprovisionner à moyen tous les 2-3 jours. Les CIV se développeront sous forme de fibroblastes (figure 3B, panneaux de droite).
  6. Lorsque les CIV atteignent une confluence de >90 %, laver deux fois avec du DPBS pour éliminer l’excès de milieu et détacher les cellules en ajoutant un volume approprié de réactif de dissociation préchauffé pour couvrir la plaque (c.-à-d. 2 à 3 mL par boîte de 10 cm). Incuber le plat dans un incubateur à 37 °C. Les VIC se détacheront du plat après 2-3 minutes d’incubation. Ajouter 4 à 6 mL de média préchauffé.
    REMARQUE: Si les cellules prennent plus de 3 minutes pour se soulever de la plaque, le réactif de dissociation peut avoir perdu de sa puissance. Si nécessaire, un grattoir de cellules peut être utilisé pour soulever doucement les cellules.
  7. Transférer la suspension cellulaire dans un tube et centrifuger doucement à 180 x g pendant 5 min. Après avoir retiré le surnageant, remettre doucement en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de croissance VIC préchauffé et déterminer le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et d’un bleu de trypan. Ensemencer les cellules viables à une densité de 1:2 dans le plat d’origine (c.-à-d. ~ 1 × 106 cellules par plat de 10 cm ou 1,3 x 104 cellules/cm2).
  8. Évaluer le phénotype de la CIV par coloration positive pour les marqueurs immunofluorescents tels que αSMA, CNN ou SM22α et par coloration négative pour les marqueurs VEC tels que CD31, CDH5 ou vWF (Figure 4, panneaux de droite).
    REMARQUE: Le flux de travail du protocole présenté ici sélectionne de manière impartiale un dépliant pour l’isolement des CVÉ et des VIC, tandis que les autres dépliants sont utilisés pour la coloration de Von Kossa (section 5) et la congélation instantanée.

8. Stockage cellulaire à long terme

  1. Une fois développées, congelez les cellules pour un stockage à long terme. Lavez les cellules deux fois avec 2-5 mL de DPBS, puis ajoutez suffisamment de réactif de dissociation pour détacher les cellules comme aux étapes 6.8 et 7.6. Arrêtez la digestion en ajoutant un volume égal de milieu de croissance VEC ou VIC et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL.
  2. Déterminer le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et d’un bleu de trypan.
  3. Centrifuger à 180 x g pendant 5 min.
  4. Resuspendre les cellules dans un milieu de croissance conditionné réfrigéré à une densité cellulaire de ~ 3 × 106 cellules/mL.
  5. Doucement en tourbillonnant, ajouter un volume égal de milieu de cryoconservation 2x réfrigéré. Cela portera la concentration cellulaire à ~ 1,5 × 106 cellules / mL.
  6. Aliquote 1 mL dans des flacons de cryoconservation. Placez les flacons dans un contenant de congélation de cellules, fermez et inversez 5 à 6 fois pour vous assurer que les cellules restent suspendues. Placer le récipient à -80 °C pendant 6 à 72 h ou selon le protocole de congélation du contenant. Retirer les flacons de -80 °C et les transférer dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

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Representative Results

Le protocole ci-dessus décrit les étapes nécessaires à la manipulation des tissus valvulaires humains et à l’isolement et à l’établissement de lignées cellulaires viables à partir de ces tissus. Les feuillets de la valve aortique sont traités pour l’incorporation de paraffine, congelés pour un stockage à long terme pour analyse biochimique ou génétique et digérés pour l’isolement des CVÉ et des CIV (Figure 1). Alors que les échantillons chirurgicaux auront probablement un diagnostic clinique de sténose aortique et peuvent présenter de lourds nodules de calcification qui peuvent être visibles à l’œil nu, la calcification valvulaire aortique est présente chez un nombre important de personnes âgées (>65 ans)32, et en raison de cette prévalence, tous les tissus - chirurgicaux et cadavériques - sont soumis à une coloration de Von Kossa ou à une procédure similaire pour évaluer la présence d’une calcification (Figure 2).

Il a été constaté que l’utilisation d’une solution de stockage frigorifique stabilisait considérablement les cellules du tissu valvulaire excisé. La solution de stockage frigorifique est utilisée dans les transplantations d’organes vivants. Il est évacué par les organes avant ou après le retrait du donneur et laissé dans le système vasculaire de cet organe pendant le transport sur la glace. Il a été observé que les lignées de CEV étaient plus facilement établies à partir d’échantillons de donneurs que de tissus chirurgicaux, et que les lignées de donneurs étaient plus susceptibles de conserver leur morphologie de cellules endothéliales pour plus de passages. Cela était déroutant, car les tissus du donneur n’arrivaient souvent pas au laboratoire avant 12 à 24 heures post-mortem, tandis que le tissu chirurgical était obtenu entre 2 et 4 heures. Lors de l’emballage des tubes de l’échantillon chirurgical avec une solution de stockage frigorifique au lieu de PBS, la récupération cellulaire a considérablement augmenté. Comme le montre la figure 3, les CVÉ et les CVI viables peuvent être obtenus plus de 61 heures après l’extraction de la valve. Bien qu’un pourcentage légèrement plus élevé de CVI vivants soit obtenu que de CVÉ lorsque les cellules sont isolées jusqu’à un jour après l’excision valvulaire, les cellules restent viables 48 heures après l’excision. Jusqu’à 40% du total des cellules récupérées correspondent à des cellules vivantes et nous avons observé des chiffres cohérents entre les réplications biologiques. En outre, l’inspection morphologique confirme également l’identité cellulaire; Alors que les CVÉ apparaissent comme des cellules tassées, semblables à des pavés et inhibées par contact de croissance, la morphologie des VIC est similaire à celle des myofibroblastes en forme de fuseau. L’immunomarquage des échantillons a confirmé que 91,8 % ± 1,8 (n = 3) des CVE élargies étaient positives pour le marqueur endothélial vWF, tandis que 92,0 % ± 5,0 (n = 3) des CVI élargies étaient positives pour le marqueur cellulaire interstitiel αSMA (Figure 4). Ces chiffres sont conformes aux résultats rapportés précédemment33.

Figure 1
Figure 1 : Traitement des tissus valvulaires et isolement cellulaire à partir du contrôle humain et des valves CAVD. (A) Représentation schématique du traitement des tissus pour l’évaluation des niveaux de calcification des valves. (B) Représentation schématique de l’évolution temporelle et des étapes pour l’isolement et la caractérisation des cellules endothéliales valviques humaines (CVÉ) et des cellules interstitielles valvulaires (CIV) à partir de tissus témoins et CAVD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Évaluation de la calcification. (A) Image représentative des tissus valvulaires témoins (en haut) et calcifiés (en bas) provenant de donneurs humains. Notez que les nodules de calcification du tissu CAVD peuvent gravement altérer la morphologie et la capacité d’exciser proprement les folioles. (B) Coloration du représentant Von Kossa du tissu valvulaire de contrôle (à gauche) et du tissu valvulaire CAVD (à droite) après fixation et traitement ultérieur du tissu valvulaire humain. Notez que la calcification est révélée par la présence de précipitations sombres dans le tissu foliole. Les images des valves ont été capturées avec une caméra de laboratoire. Les vannes colorées de Von Kossa ont été capturées avec un objectif 10x, barre d’échelle 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Évaluation de la survie cellulaire (A) des CVÉ et des courbes de survie des CIV. Trois folioles ont été obtenues à partir de cinq échantillons de valves. La première notice de chaque valve a été traitée immédiatement (3-12 h après l’extraction), la deuxième notice a été traitée environ 24 h plus tard (22-35 h) et la troisième notice a été traitée environ 48 h après l’obtention du tissu (45-61 h). Les feuillets des vannes ont été conservés dans une solution frigorifique à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités. L’axe des y représente le pourcentage de cellules vivantes. (B) Morphologie des cultures saines de CVÉ (panneaux de gauche) et de CIV (panneaux de droite). Les graphiques montrent la proportion moyenne de cellules vivantes SD de ± de cellules isolées à partir de n = 5 tissus valvulaires. Les images ont été capturées avec un objectif 4x et 10x, des barres d’échelle 200 μm et 100 μm, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Coloration immunofluorescente représentative sur les CVÉ et les CIV. Les CVE sont positives pour le marqueur endothélial von Willebrand Factor (vWF, panneaux de gauche) tandis que les VIC sont positives pour le marqueur interstitiel αSMA. Notez que notre protocole d’isolation garantit une efficacité d’isolation élevée; aucune contamination croisée entre les CVÉ et les CIV n’est détectée. Les images ont été capturées avec un objectif 10x, barre d’échelle 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’obtention de tissus témoins et de tissus pathogènes chez l’homme est essentielle pour la modélisation in vitro et ex vivo des maladies; Cependant, alors que l’on parle souvent des défis de combler l’écart entre le banc et le chevet du patient, l’ordre inverse - passer du bloc opératoire au banc - est souvent tout aussi décourageant. Il est essentiel pour un scientifique fondamental d’obtenir des échantillons primaires de tissus humains en collaboration avec un chirurgien scientifique investi qui dispose d’une équipe d’infirmières, de techniciens chirurgicaux, d’adjoints au médecin, d’étudiants en médecine et de résidents, ainsi que de gestionnaires de protocoles cliniques qui peuvent recruter et consentir des patients, participer et aider à la manipulation appropriée des tissus excisés et coordonner la logistique requise pour le prélèvement des tissus. Sans les plus grands efforts de toutes les personnes impliquées pour réduire le temps entre l’excision et l’isolement cellulaire, le matériel cellulaire vital et les informations qu’il contient seront irrémédiablement altérés ou perdus.

L’utilisation d’une solution d’entreposage frigorifique est essentielle au maintien de la viabilité des échantillons de tissus. C’est la même solution utilisée par les équipes de transplantation d’organes de l’UPMC et d’autres centres médicaux de transplantation. Un meilleur rendement cellulaire a été obtenu à partir de tissus cadavériques qui avaient été excisés du donneur plusieurs heures auparavant que de tissus obtenus plus rapidement en salle d’opération mais conservés dans du PBS froid. Cette découverte accidentelle a été essentielle pour l’approvisionnement cellulaire à partir de tissus humains. Le délai d’approvisionnement entre l’excision tissulaire et l’accouchement en laboratoire varie de 1 à 5 heures pour le tissu chirurgical et de plus de 24 heures pour le tissu cadavérique. En comparaison, l’obtention et le traitement des tissus animaux peuvent souvent être effectués dans les minutes suivant l’euthanasie, ce qui est idéal pour la viabilité cellulaire. En l’absence de solution de stockage frigorifique, il est probable qu’un milieu adapté à la culture de cellules pourrait également être plus performant que le PBS, mais ce milieu n’a pas été testé ici en raison du succès de la solution d’entreposage frigorifique dans la transplantation d’organes vivants et de la réception de tissus cadavériques dans cette solution. La solution est de longue conservation, ce qui est idéal pour le stockage dans les salles d’opération, et des ingrédients spécifiques tels que l’adénosine sont connus pour favoriser des réponses bénéfiques aux stress cellulaires tels que l’ischémie / hypoxie21,34.

Une autre étape essentielle pour obtenir des cellules viables est de laver les tissus avec un fongicide, de la gentamicine et un bactéricide. Ce court rinçage permet de s’assurer que les cellules ne sont pas contaminées par des bactéries et des champignons. Tout aussi critiques sont les étapes pour digérer les CVÉ hors du tissu valvulaire, où en l’espace de quelques minutes seulement, les CVÉ sont détachés puis frottis sur la surface des feuillets de valve. La digestion ultérieure des CIV qui résident sur la matrice extracellulaire dense du feuillet a beaucoup plus de marge de manœuvre pour la durée et la force. Le traitement tissulaire non biaisé décrit dans ce protocole permet d’isoler les deux principales populations cellulaires présentes dans le feuillet valvulaire, les CVÉ et les CIV. Bien qu’une analyse récente du transcriptome unicellulaire ait montré la coexistence d’au moins quatorze sous-types cellulaires différents résidant dans la valve humaine, y compris six cellules stromales non dérivées de valves dans le tissu CAVD35, cette diversité peut représenter des variations dues aux effets du traitement et de la digestion de ces tissus durcis, ou elle peut être due à différents microenvironnements auxquels les cellules folioles sont exposées: Les CVÉ sont exposés à deux flux sanguins différents tandis que les CIV sont intégrés dans trois strates différentes de la matrice extracellulaire 8,9. Le protocole d’isolement à grande échelle et l’analyse décrits ici garantissent que plus de 90% des CVÉ et des CIV correspondent à leur phénotype principal. Bien qu’un certain degré d’hétérogénicité puisse être trouvé, il n’affecte pas les résultats généraux de l’étude de la CEV et de l’homéostasie CIV 8,9,13,14,15,16.

Il est également important de noter que les patients et leurs tissus valvulaires, et donc les lignées cellulaires obtenues à partir d’eux, ne sont pas identiques. La génétique, les comorbidités, la manipulation pendant la chirurgie et le traitement, et la fraîcheur des ingrédients de la solution de digestion peuvent affecter le taux de croissance et même peut-être le comportement ou le phénotype des cellules isolées. Bien que la présente étude démontre la capacité de produire un nombre suffisant de cellules viables avec cette procédure, il peut y avoir des différences innées ou induites dans ces lignées cellulaires qui peuvent avoir un impact sur l’expérimentation en aval. Il est souvent difficile de connaître précisément le temps écoulé depuis que le tissu a été prélevé sur le patient ou le donneur, et particulièrement dans le cas de ce dernier, le temps écoulé depuis l’arrêt de la circulation. En outre, il existe une variabilité inhérente entre les tissus en ce qui concerne le nombre de cellules valvulaires viables obtenues, la capacité de prolifération des cellules et la rétention du phénotype cellulaire. Les lignées cellulaires peuvent contenir des mutations génétiques - congénitales ou somatiques - dont le médecin et l’équipe de recherche ne sont pas au courant, et le remodelage et la manipulation ultérieure des tissus peuvent également modifier le phénotype cellulaire ou même l’épigénétique. En tant que tel, pour toutes les expériences dans lesquelles ces cellules humaines primaires sont utilisées, il est absolument essentiel que des répliques biologiques - c’est-à-dire des lignées cellulaires obtenues de différents patients - soient utilisées, malgré le temps et le coût considérables qu’elles encourent. Cela permet de s’assurer que les résultats ne sont pas dus à des effets de confusion provenant de l’obtention et du traitement du tissu. Le taux de prolifération variable des différentes lignées cellulaires peut être ajusté soit en collectant des cellules dans des expériences à différents moments, soit en ensemençant des cellules pour des expériences à différentes densités; Aucune réponse unique n’est la meilleure pour tous les modèles expérimentaux. Bien que les complications ne soient pas négligeables, l’utilisation de témoins humains primaires et de lignées cellulaires dérivées de tissus CAVD pour les modèles expérimentaux in vitro et ex vivo est essentielle pour définir les facteurs initiateurs et les processus de propagation qui conduisent à la pathogenèse de la CAVD.

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Disclosures

IS reçoit le soutien de la recherche institutionnelle d’Atricure et de Medtronic et agit à titre de consultant pour Medtronic Vascular. Aucun de ces conflits n’est lié à ce travail. Tous les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Jason Dobbins pour sa discussion perspicace et sa lecture critique de ce manuscrit. Nous tenons à remercier le Center for Organ Recovery and Education pour son aide et son soutien et remercions les donneurs de tissus et leurs familles d’avoir rendu cette étude possible. Tous les échantillons de patients sont prélevés auprès de personnes inscrites à des études approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Pittsburgh conformément à la Déclaration d’Helsinki. Les tissus cadavériques obtenus par l’intermédiaire du Center for Organ Recovery and Education (CORE) ont été approuvés par le Comité de surveillance de la recherche et de la formation clinique impliquant des défunts (CORID) de l’Université de Pittsburgh.

Quelques figurines créées avec Biorender.com.

CSH est soutenu par le National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 et R01 HL142932, l’American Heart Association 20IPA35260111.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Thermo Scientific 7211345 Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plate Greiner Bio-One 664160 Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipet Fisher 14955234 VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tips VWR 76322-154 Cell culture/cell line expansion
10XL filter tips VWR 76322-132 Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339650 Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710S Tissue and cell fixative
190 proof ethanol Decon 2801 Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesium Gibco 14190250 Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBS Fisher BP2944100 Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tips VWR 76322-134 Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanol Decon 2701 Deparaffinizing tissue samples
2-propanol Fisher A416P 4 Making collagen coated plates
5 mL serological pipet Fisher 14955233 VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dish GenClone 25-260 VEC isolation
6-well cell culture plate Corning 3516 Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacial Fisher BP2401 500 Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidin Invitrogen A12379 Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution Bridge to Life BUW0011L Tissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g Bioworld 220700233 VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody  Abcam ab46794 Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2) Cell Signaling 3528 Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ Dynabeads Invitrogen 11155D VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5 Cell Signaling 2500 Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm pores Corning 431751 VIC isolation
Collagen 1, rat tail protein Gibco A1048301 Making collagen coated plates
Collagenase II Worthington Biochemical Corporation LS004176 Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray Decon 4101 Disinfection
Countess II Automated Cell Counter Invitrogen A27977 Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslips Invitrogen 2026h Automated cell counter required slide cover
Coverslips Fisher 125485E Mounting valve samples
Cryogenic vials Olympus Plastics 24-202 Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula  Clorox N/A Disinfection
DMEM Gibco 10569044 Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 Lonza Walkersville CC3129 Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit Lonza Walkersville CC4176 Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL Microscope Life Technologies Model Number: AME3300 Fluorescent imaging
EVOS XL Microscope Life Technologies AMEX1000 Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium Select R&D Systems S11550 VIC expansion
Fine scissors Fine Science Tools 14088-10 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell Scrapers Fisher 08-100-241 VIC expansion
Fungizone Gibco 15290-026 Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Gentamicin Gibco 15710-064 Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slides Globe Scientific Inc 1358L mounting valve samples
Goat anti-Mouse 488 Invitrogen A11001 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594 Invitrogen A11005 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488 Invitrogen A11008 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594 Invitrogen A11012 Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide Invitrogen A25750 Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) Invitrogen R37606 Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells HyClone Laboratories, Inc. SR30002 Frozen cell storage
Mounting Medium Fisher Chemical Permount SP15-100 Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing container Nalgene 51000001 Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS Spray PromoCell PK-CC91-5051 Disinfection
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140163 Antibiotic. VIC expansion
Plasmocin Invivogen ANTMPT Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibody Abcam ab14106 Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissors Fine Science Tools 14001-14 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swab Puritan 25806 10WC VEC isolation
Swingsette human tissue cassette Simport Scientific M515-2 Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm) Fine Science Tools 11016-17 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061 cell counting solution
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604021 Splitting VIC/VECs
Von Kossa kit Polysciences 246331 Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibody Abcam ab68545 Primary antibody (VEC positive stain)
Xylenes Fisher Chemical X3S-4 Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibody Abcam ab7817 Primary antibody (VIC positive stain)

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References

  1. Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
  2. Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
  3. Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
  4. Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
  5. Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
  6. Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
  7. Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
  8. Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
  9. Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
  10. Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
  11. Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
  12. Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
  13. Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
  14. Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
  15. Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
  16. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
  17. Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
  18. Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
  19. Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
  20. Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
  21. Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
  22. Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
  23. Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
  24. Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
  25. Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
  26. Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
  27. Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
  28. Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
  29. Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
  30. Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  32. Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
  33. Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
  34. St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
  35. Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).

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Biologie numéro 170
Isolement de cellules valvulaires primaires humaines pour la modélisation in vitro de maladies
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Cuevas, R. A., Chu, C. C., Moorhead III, W. J., Wong, R., Sultan, I., St. Hilaire, C. Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling. J. Vis. Exp. (170), e62439, doi:10.3791/62439 (2021).

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