Summary
Hier beschrijven we een protocol om nierorganoïden te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's). Dit protocol genereert nierorganoïden binnen twee weken. De resulterende nierorganoïden kunnen worden gekweekt in grootschalige spinnerkolven of magnetische roerplaten met meerdere bronnen voor parallelle medicijntestbenaderingen.
Abstract
Nierorganoïden gegenereerd uit hPSC's hebben gezorgd voor een onbeperkte bron van nierweefsel. Menselijke nierorganoïden zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van nierziekte en -letsel, het ontwikkelen van celgebaseerde therapieën en het testen van nieuwe therapieën. Voor dergelijke toepassingen zijn grote aantallen uniforme organoïden en zeer reproduceerbare assays nodig. We hebben voortgebouwd op ons eerder gepubliceerde nierorganoïde protocol om de algehele gezondheid van de organoïden te verbeteren. Dit eenvoudige, robuuste 3D-protocol omvat de vorming van uniforme embryoïde lichamen in minimaal componentmedium met lipiden, insuline-transferrine-selenium-ethanolaminesupplement en polyvinylalcohol met GSK3-remmer (CHIR99021) gedurende 3 dagen, gevolgd door kweek in knock-out serumvervanging (KOSR)-bevattend medium. Bovendien zorgen agitatietests voor vermindering van het samenklonteren van de embryoïde lichamen en het handhaven van een uniforme grootte, wat belangrijk is voor het verminderen van variabiliteit tussen organoïden. Over het algemeen biedt het protocol een snelle, efficiënte en kosteneffectieve methode voor het genereren van grote hoeveelheden nierorganoïden.
Introduction
In de afgelopen jaren zijn een aantal protocollen ontwikkeld om menselijke pluripotente stamcellen te differentiëren in nierorganoïden 1,2,3,4,5. Nierorganoïden hebben een belangrijk hulpmiddel geboden bij het onderzoek naar nieuwe regeneratieve geneeskundebenaderingen, modelleren niergerelateerde ziekten, het uitvoeren van toxiciteitsstudies en de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen. Ondanks hun brede toepasbaarheid hebben nierorganoïden beperkingen zoals gebrek aan rijping, beperkte kweekcapaciteit op lange termijn in vitro en een tekort aan verschillende celtypen in de menselijke nier 6,7,8. Recent werk heeft zich gericht op het verbeteren van het niveau van organoïde rijping, het verlengen van de kweekperioden en het uitbreiden van de complexiteit van niercelpopulaties door de bestaande protocollente wijzigen 9,10,11,12. In deze huidige iteratie van ons vastgestelde protocol 5,13 hebben we de mediumcomponenten in de eerste fase van het protocol gewijzigd in een serumvrij basemedium aangevuld met insuline-transferrine-selenium-ethanolamine (ITSE), lipiden, polyvinylalcohol (E5-ILP) en CHIR99021 (figuur 1). Deze veranderingen zorgen voor een volledig gedefinieerd, serumvrij, eiwitarm medium, met minder componenten dan onze vorige mediumsamenstelling 5,13 en zonder extra groeifactoren. Als gevolg hiervan is het medium van de eerste fase minder arbeidsintensief om voor te bereiden dan onze eerder gepubliceerde versie en kan de batch-tot-batch variabiliteit5 verminderen. Eerdere studies hebben aangetoond dat zowel insuline als transferrine belangrijk zijn in serumvrije cultuur14,15, maar hoge niveaus van insuline kunnen remmend zijn voor mesodermdifferentiatie16. We hebben de lage insulinespiegels gehandhaafd zoals voorzien in het oorspronkelijke protocol en verder verlaagde niveaus van KOSR (met insuline) in de tweede fase van de test. In overeenstemming met andere protocollen voor de vorming van nierorganoïden, zijn lagere niveaus van KOSR gunstig voor het handhaven van een evenwicht tussen proliferatie en differentiatie van het nierweefsel17. Daarnaast hebben we de glucoseconcentratie in ons Stadium II medium13 verlaagd.
Onze methode beschrijft een opstelling voor suspensietest van nierorganoïden, die tot ~ 1.000 organoïden oplevert van een initiële ~ 60% confluent hPSC 100 mm kweekplaat zoals beschreven in de oorspronkelijke publicatie 5,13. Dit protocol kan eenvoudig worden opgeschaald naar meerdere platen van 100 mm of 150 mm om het aantal organoïden verder te verhogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met hPSC's werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en werden uitgevoerd in een klasse II bioveiligheidskap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Alle reagentia zijn van celkweekkwaliteit, tenzij anders vermeld. Alle culturen worden geïncubeerd bij 37 °C, 5% CO2 luchtatmosfeer. In alle stadia van de test kunnen embryoïde lichamen of nierorganoïden worden verzameld en gefixeerd of voorbereid voor analyse. De hPSC-lijnen die zijn gebruikt om deze gegevens te genereren, zijn volledig gekarakteriseerd en gepubliceerd18.
1. Kweekplaten bereiden
OPMERKING: Ongeveer 1 uur voorafgaand aan het splitsen van hPSC's, coat 2 x 100 mm weefselkweekplaten met een stamcelgekwalificeerd keldermembraanmatrixextract (BME). Men kan de platen voorbestemmen, afdichten met een paraffinefilm en bewaren bij 4 °C volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid 2 x 100 mm met weefselkweek behandelde platen (1 voor nierorganoïde assay, 1 om de cellijn te behouden) en een conische buis van 15 ml in de bioveiligheidskap van klasse II.
- Aliquot 8 ml koude, serumvrije Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) in een conische buis van 15 ml en ~ 4 ml in elk van de 100 mm-platen, genoeg om de bodem van elke plaat met medium te bedekken.
- Neem een aliquot van 100 μL BME uit de vriezer (-20 °C). Gebruik een serologische pipet van 2 ml en neem ~ 1 ml koude DMEM uit de conische buis van 15 ml. Ontdooi de BME aliquot langzaam door zachtjes op en neer te pipetteren met de koude DMEM, zonder bubbels te maken.
OPMERKING: Laat BME aliquot niet op kamertemperatuur zitten. Onmiddellijk gebruiken. - Breng de ontdooide DMEM/BME terug in de conische buis van 15 ml met de resterende DMEM. Meng met een serologische pipet van 10 ml voorzichtig de verdunde BME door minstens 8 keer op en neer te pipetteren om de BME gelijkmatig te verspreiden, waardoor er geen bubbels ontstaan.
- Breng 4 ml van de verdunde BME over in elke plaat met DMEM en draai de plaat voorzichtig rond zodat de BME gelijkmatig wordt verdeeld. Incubeer de gecoate plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 30 min bij 37 °C.
OPMERKING: Gebruik 50 μL BME per plaat van 100 mm. Het gebruik van andere hPSC-kweekmedia en cellijnen kan verschillende concentraties BME vereisen.
2. Passerende hPSC's
OPMERKING: Voor routinematige hPSC-cultuur passeren cellijnen bij 70-80% confluentie.
- Zuig het kweekmedium op uit de hPSC-plaat die moet worden gepasseerd. Voeg ~ 8 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) toe aan de hPSC-plaat en draai voorzichtig om de cellen te wassen.
- Zuig DBPS op en voeg 2 ml zacht celdissociatiereagens (GCDR) toe aan de 100 mm-plaat, druppel voor druppel bovenop om de cellen te bedekken.
OPMERKING: Andere dissociatiereagentia kunnen ook worden gebruikt. Pas dienovereenkomstig aan. - Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ~ 6-8 minuten totdat de kolonies uiteenvallen en cellen refractief zijn onder fasecontrast (figuur 2A).
OPMERKING: De timing kan variëren tussen cellijnen. Pas dienovereenkomstig aan. - Bereid tijdens het broeden een conische buis van 50 ml voor. Voeg 16 ml hPSC-medium (8 ml per plaat van 100 mm) toe en voeg Rho-geassocieerde kinaseremmer (ROCKi) toe aan een eindconcentratie van 5 μM.
- Zuig DMEM op uit de BME-gecoate platen en voeg 8 ml hPSC-medium plus ROCKi toe aan elke plaat.
- Wanneer de cellen klaar zijn (zoals beschreven in punt 2.3, figuur 2A), zuigt u de GCDR op en kantelt u de plaat ~45° naar de experimentator en schraapt u de cellen met een cellifter.
OPMERKING: Als cellen losraken, laat dan aspiraterende GCDR weg en ga verder. - Draai de plaat ~90° en schraap opnieuw om de resterende cellen op te tillen. Houd de plaat ~45° en spoel de cellen af met 3 ml hPSC-medium met een serologische pipet van 10 ml.
- Pipetteer voorzichtig op en neer om grote klonten te breken (niet meer dan 2-3 keer) en zaai de cellen in de juiste verhouding voor de betreffende cellijn op de voorbereide platen. Plaats de plaat met de cellen in de couveuse en beweeg de plaat voorzichtig in figuur acht bewegingen om de cellen gelijkmatig te verdelen.
OPMERKING: In dit experiment werden hPSC-lijnen gesplitst in een verhouding van 1:5, dit kan variëren voor andere cellijnen en omstandigheden. Laat het bord 's nachts ongemoeid. - Onderzoek na ~ 24 uur de cellen op hechting. Zoek naar kleine individuele kolonies die eraan vastzitten. Zuig het gebruikte medium aan en vul aan met 8 ml vers hPSC-medium (geen ROCKi toegevoegd).
- Blijf dagelijks observeren en voeden totdat de cellen ~ 60% samenvloeiing bereiken om de nierorganoïde assay te starten (meestal bereikt 48 tot 72 uur na het passeren). De kolonies zullen idealiter discreet zijn en niet samensmelten (figuur 2B).
OPMERKING: Het is erg belangrijk om de cellen te beperken tot niet meer dan 80% confluentie om hun pluripotentietoestand te behouden. Confluentculturen, ruwe behandeling of hogere passages kunnen leiden tot ongewenste spontane differentiatie of lage efficiëntie van nierorganoïdevorming.
3. Dag 0 - Het instellen van de nierorganoïde assay
- Bereid voordat u begint zowel de E5-ILP- als de Fase II-media voor volgens de formuleringen (tabel 1 en tabel 2).
OPMERKING: De media kunnen tot 14 dagen worden bewaard bij 4 °C. - Bereid voor één nierorganoïde assay (één 100 mm kweekplaat is nodig voor één 6-well plaat) het volledige E5-ILP medium in een conische buis van 50 ml: 18 ml E5-ILP aangevuld met 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM bèta-mercaptoethanol (32,7 μL).
- Plaats 2 ml compleet E5-ILP-medium in elke put van een ultralage bevestigingsplaat met 6 putten.
- Was hPSC's tweemaal op ~60 % confluentie (figuur 2B) met ~ 8 ml DPBS. Aspiraat DPBS voeg vervolgens 2 ml dispase per 100 mm plaat toe, druppel voor druppel om de cellen te bedekken en incubeer gedurende 6 minuten bij 37 °C.
OPMERKING: Na 6 minuten beginnen de randen van de kolonies op te krullen (figuur 2C, rode pijlen) terwijl de rest van de kolonie vast blijft zitten. Als dit na 6 minuten niet wordt verkregen, plaatst u de cellen terug in de incubator voor nog eens 30 s. Andere hPSC-media en -matrix zijn mogelijk niet compatibel met deze timing. BME-coating op basis van laminine is niet compatibel met dispase. Als op laminine gebaseerde BME de standaard hPSC-matrix is, bekleedt u een van de platen in rubriek 1 met de BME die in deze methode wordt beschreven en die moet worden gebruikt voor de nierorganoïdetest. - Was cellen 3x met ~10 ml DPBS. Zuig DPBS vervolgens de plaat ~ 45 ° en schraap naar beneden met een cellifter.
OPMERKING: Dispase is niet gedeactiveerd, daarom moet het grondig worden uitgewassen. Verminder het aantal wasbeurten niet. - Spoel de kolonies vanaf de bovenkant af met 6 ml volledig E5-ILP-medium met behulp van een serologische pipet van 10 ml. Pipetteer voorzichtig op en neer om grote kolonies op te breken (2 of 3 keer is meestal voldoende).
- Verdeel de kolonieclusters gelijkmatig door 1 ml per put toe te voegen aan de 6-putplaat. Plaats de plaat op een orbitale shaker (instellingen: orbitaal = 30, reciproquent = 330°, trilling = 5° - 2 s) die in de incubator van 37 °C wordt geplaatst (figuur 2D).
OPMERKING: De trillingsfunctie is belangrijk voor een adequate verdeling van organoïden en om klonteren te voorkomen.
4. Dag 2 - Voeding door half-medium verandering
OPMERKING: Binnen de 48 uur zullen kolonieclusters embryoïde lichamen vormen.
- Bereid het volledige medium voor: Bereid voor een 6-well plaat 12 ml E5-ILP medium + 8 μM CHIR99021 in een conische buis van 15 ml.
OPMERKING: Beta-mercaptoethanol en ROCKi zijn niet vereist. - Laat de embryoïde lichamen zich aan de onderkant van de plaat nestelen, kantel de plaat ~ 45 ° en zuig het medium langzaam vanaf de bovenkant op, laat ~ 1 ml per put staan.
OPMERKING: Embryoïde lichamen klonteren in dit stadium snel samen. Laat ze geen genoegen nemen met > 5 minuten. - Voeg per put 2 ml bereid volledig medium (rubriek 4.1) toe. Plaats de plaat terug op de shaker.
5. Dag 3 - Overdracht van embryoïde lichamen naar stadium II medium
- Bereid een conische buis van 50 ml en DMEM (lage glucose). Laat de embryoïde lichamen zich op de bodem van de plaat nestelen. Kantel de plaat ~ 45 ° en zuig het medium langzaam van de bovenkant op, laat ~ 1 ml per put staan.
- Verzamel alle embryoïde lichamen zorgvuldig uit elke put met behulp van een serologische pipet van 10 ml en breng ze over naar de conische buis van 50 ml.
- Was elke put om eventuele resterende embryoïde lichamen te verzamelen met ~ 1 ml DMEM (lage glucose) en voeg ze toe aan dezelfde conische buis van 50 ml.
- Laat de embryoïde lichamen zich op de bodem van de buis nestelen, ~ 5 min. Voeg tijdens het wachten 2 ml Stage II medium toe aan elke put van de 6-well plaat. Verwijder grote embryoïde lichamen (>300 μm) met behulp van een celzeef van 200 μm (figuur 2E).
- Gebruik een nieuwe conische buis van 50 ml en plaats de celzeef van 200 μm erop. Pipetteer alle embryoïde lichamen met behulp van een serologische pipet van 10 ml voorzichtig over de celzeef.
- Spoel de celzeef met een extra ~ 5 ml DMEM (lage glucose) om embryoïde lichamen te verzamelen die vastzitten in de celzeef. Laat de embryoïde lichamen zich op de bodem van de conische buis nestelen.
- Wanneer de embryoïde lichamen zijn neergedaald, aspirateer het supernatant en was met ~ 10 ml DMEM (lage glucose).
- Aspirateer DMEM en suspensuur de embryoïde lichamen opnieuw in 6 ml stadium II-medium.
- Breng de embryoïde lichamen terug in de 6 put ultra-lage bevestigingsplaat en verdeel ze gelijkmatig over de 6 putten.
- Voer om de dag halve mediumveranderingen uit zoals beschreven in stap 4.2 en 4.3.
OPMERKING: Vanaf dag 3 zullen de embryoïde lichamen een 'gouden' en glad, bolvormig uiterlijk hebben (figuur 2F). Vanaf ~ dag 6 zal tubulusvorming in individuele embryoïde lichamen duidelijk worden, met toenemende aantallen in de volgende dagen die optimale aantallen en groei bereiken op dag 14 (figuur 2G, H). Om incidentele klontvorming te elimineren, zeeft u bij het visueel observeren van de nierorganoïden of zeer kleine embryoïde lichamen zonder tubuli de <200 en grote organoïden van >500 μm met een celstamm van 500 en 200 μm zoals beschreven in stappen 5.4.1 en 5.4.2.
6. Breng over in een spinnerfles en voer
OPMERKING: Een spinnerkolf kan vanaf dag 3 op elk moment worden gebruikt voor experimenten waarvoor grote aantallen organoïden nodig zijn. Routinematige overdracht van organoïden vindt plaats in ons laboratorium tussen dag 6-8. Raadpleeg het gedeelte Discussie voor alternatieven als er geen apparatuur beschikbaar is.
- Breng embryoïde lichamen over in een spinnerkolf van 125 ml met 45 ml stadium II-medium. Stel de snelheid van de magneetroerder in op 120 tpm en plaats deze in de incubator (figuur 2I).
- Om embryoïde lichamen of nierorganoïden te voeden, laat u de nierorganoïden kort op de bodem van de spinnerkolf bezinken. Til het deksel van de ene zijarm van de kolf en plaats de aanzuigende pipet erin, waarbij de punt de tegenoverliggende binnenwand raakt.
- Richt de aanzuigende pipet langzaam naar beneden en aspirateer ongeveer de helft van het medium. Vul aan met 20 ml vers Stage II medium door het door dezelfde opening te pipetteren.
7. Instellen van 6-well magnetische roerplaat (6MSP)
OPMERKING: Het 6MSP-formaat kan worden gebruikt in plaats van spinnerkolven als er meerdere omstandigheden moeten worden getest. Gebruik de 6MSP voor samengestelde of nefrotopxine behandelingen. Dit bespaart de hoeveelheid medium die in de tweede fase wordt gebruikt, terwijl de beschikbaarheid van voedingsstoffen door diffusie behouden blijft.
- Reinig de ovale magneetroerstaven in een conische buis van 50 ml door kort in een weefselkweek geschikt reinigingsmiddel te wassen (indien nooit gebruikt) of laat > 1 uur weken indien eerder gebruikt.
- Kort 3x wassen in steriele DPBS.
- Was 1x gedurende 5 min in 70% ethanol, 1x in steriele DPBS.
- Spoel af met antikleefoplossing en was 1x in steriel DPBS en aspiraat.
- Plaats voorzichtig met behulp van een lange steriele tang een magnetische roerstaaf in elke put van de 6-putplaat met embryoïde lichamen of nierorganoïden.
- Plaats de plaat op de 6MSP en stel het toerental in op 120 tpm (figuur 2J). Handhaaf nierorganoïden met een halve mediumverandering volgens rubriek 4.2 en 4.3.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de magnetische roerstangen in positie klikken en beginnen te draaien, moet u mogelijk eerst het vermogensniveau kort op 100 zetten en vervolgens, zodra ze allemaal draaien, het vermogensniveau verlagen tot 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze meest recente versie van ons protocol wordt nierorganoïde differentiatie geïnitieerd in een gedefinieerd, eiwitarm medium. De assays worden volledig in suspensie uitgevoerd en zijn afhankelijk van het aangeboren vermogen van hPSCs-differentiatie en -organisatie voor het initiëren van tubulogenese. Een enkele test afkomstig van een 100 mm ~ 60% confluente hPSC-cultuurplaat levert routinematig 500-1.000 nierorganoïden op, zoals getoond in onze vorige publicatie5. Vanwege het grote aantal gegenereerde organoïden is dit protocol zeer geschikt voor samengestelde tests. We gebruiken routinematig een 6-well-formaat voor samengestelde tests, maar dit protocol kan eenvoudig worden geschaald in de tweede fase (dag 3 vanaf dag) naar andere multi-well-formaten voor compoundtests met een hogere doorvoer. Immunofluorescentie van paraffinesecties toont aanwezigheid van nefronsegmenten in de organoïden, d.w.z. niertubuli die Hepatocyte Nuclear Factor-1 beta (HNF1B) en Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL) (Figuur 3A - HNF1B, LTL) tot expressie brengen, en podocytenclusters die V-maf Musculoaponeurotisch Fibrosarcoom oncogen homoloog B (MAFB) en nefrine (NPHS1) tot expressie brengen (Figuur 3A - MAFB, Figuur 3B - NPHS1). Bovendien kunnen de modificaties in dit protocol de uitbreiding van endotheelcellen ondersteunen, zoals te zien is in figuur 3B met kleuring met bloedplaatjes en endotheelceladhesiemolecuul 1 (PECAM1) op dag 26 van de kweek.
| Reagens | Voorraad conc. | Werkconc. | Hoeveelheid per 250 ml |
| Tesr-E5 | n.v.t | n.v.t | 238,48 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 6,25 ml |
| Pen-Strep | 100x | 1x | 2,5 ml |
| ITSE | 100x | 0,1x | 250 μL |
| Chemisch gedefinieerde lipiden | 100x | 1x | 2,5 ml |
| Plasmocine | 25mg/ml | 2,5 μg/ml | 25 μL |
Tabel 1: E5-ILP medium samenstelling. Pipetteer alle reagentia behalve de chemisch gedefinieerde lipiden en het anti-mycoplasmareagens rechtstreeks in de bovenste kamer van een 0,22 μm Stericup-filtratie-eenheid. Voeg na filtratie de lipiden en het anti-mycoplasma-reagens toe. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.
| Reagens | Voorraad conc. | Werkconc. | Hoeveelheid per 500 ml |
| DMEM (lage glucose) | n.v.t | n.v.t | 417,5 ml |
| Kosr | n.v.t | 10% | 50 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 12,5 ml |
| Pen-Strep | 100x | 1x | 5 ml |
| Mem-Neaa | 100x | 1x | 5 ml |
| GlutaMAX | 100x | 1x | 5 ml |
| Hepes | 100x | 1x | 5 ml |
| Plasmocine | 25mg/ml | 2,5 μg/ml | 50 μL |
Tabel 2: Fase II medium samenstelling. Pipetteer alle reagentia behalve en anti-mycoplasma-reagens rechtstreeks in de bovenste kamer van een 0,22 μm Stericup-filtratie-eenheid. Eenmaal gefilterd, voeg anti-mycoplasma reagens toe. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.
Figuur 1: Protocoloverzicht. Schematisch overzicht van het protocol met de timing van de twee fasen en het gebruik van spinnerkolven en 6MSP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stadia van het protocol. (A) Bright-field afbeelding van hPSC kolonie behandeld met GCDR. (B) Optimale samenvloeiing en koloniegrootte om een nierorganoïde assay te starten. (C) hPSC's behandeld met dispase gedurende 6 minuten. Rode pijlen wijzen naar randen van de kolonies die opkrullen. (D) Organoïde assays op een orbitale shaker. (E) Gebruik van 200 μm celzeef om grote embryoïde lichamen uit te zeven. (F) Embryoïde lichamen op dag 3 (D3) voordat ze worden overgebracht naar stadium II-medium. (G) Opkomst van tubulusvorming kan worden waargenomen op dag 8 (D8) en (H) optimaal tijdstip voor het oogsten en behandelen van organoïden op dag 14 (D14). I) Spinnerkolf gebruikt voor bulkcultuur op een magnetische plaat met meerdere posities. (J) Bepaling op een magnetische roerplaat met meerdere bronnen. Schaalbalken, 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verwachte resultaten. (A) Representatieve confocale beelden van immunofluorescent gelabelde paraffinesecties van dag 14 nierorganoïden die positieve kleuring vertonen voor tubulusepithelia (HNF1B en LTL) en podocytenclusters (MAFB). (B) Dag 26 nierorganoïde secties gelabeld voor podocytenclusters (NPHS1) en endotheelcellen (PECAM1). Schaalstaven, 100 μm (A); 200 μm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerdere studies hebben aangetoond dat de eerste protocolstappen van cruciaal belang zijn voor intermediaire mesodermdifferentiatie 5,19,20 en daarom is het essentieel om in dit stadium een strikte mediumsamenstelling te implementeren. Het verwijderen van ongedefinieerde componenten zoals serum, albumine, eiwitvrij hybridoma medium II uit de eerste fase van het protocol kan helpen om de consistente differentiatie-efficiëntie tussen assayste verbeteren 21.
De metabole toestand van niercellen is van cruciaal belang voor hun functie en glucoseveranderingen kunnen leiden tot een veranderde metabole toestand22. Eerdere studies hebben beschreven dat hoge niveaus van glucose (tot 25 mM) endotheelceldisfunctie kunnen induceren en de groei en oxidatiecapaciteit van niercellen kunnen veranderen 22,23,24. Hoge glucosespiegels zijn ook beschreven om de mitochondriale functie24 te veranderen, wat ongunstig kan zijn bij het onderzoeken van nierziekte en nefrotoxiciteit of het uitvoeren van medicijnontdekking met behulp van nierorganoïden. We hebben daarom het glucosegehalte in ons protocol verlaagd om een meer in vivo-achtige metabole toestand van de organoïde niercellen te bevorderen. Als gevolg hiervan bieden de wijzigingen aan de nierorganoïde assay een consistent, robuust protocol, met behoud van de eenvoud.
Nierorganoïden zijn onvolgroeid en uitgebreide kweek (>20 dagen) kan leiden tot incidentie van pro-fibrotische en niet-renale celtypen zoals eerder beschreven 5,25, waardoor organoïden minder representatief zijn voor gezond menselijk nierweefsel. Op basis van onze ervaring is het optimale behandelingsvenster, waar de nierorganoïden op hun gezondst zijn, tussen dag 14-18. Het gebruik van spinnerkolven en magnetische roerders met meerdere bronnen zoals hierboven beschreven, zal de uniforme beschikbaarheid van voedingsstoffen verbeteren in tegenstelling tot statische cultuur21,26. Als de apparatuur voor ophangcultuur zoals de shaker of magneetroerders niet beschikbaar is, kan dit protocol nog steeds volledig worden uitgevoerd in de ultralage bevestigingsplaten in statische cultuur. Er kan echter een verhoogde incidentie zijn van embryoïde lichamen / organoïde samensmelting, wat leidt tot grote exemplaren met necrotische kernen als gevolg van hypoxie. Alle organoïden groter dan 500 μm kunnen worden verwijderd met behulp van de beschreven cel strainers. Om de kans op samensmelting van de organoïden in die gevallen te verkleinen, raden we aan om niet meer dan 100 organoïden per 6-put te zaaien. Bovendien moeten de organoïden na het voeden gelijkmatig worden verdeeld door figuur acht bewegingen met de plaat uit te voeren.
Lage efficiëntie (<50%) van organoïde vorming kan worden waargenomen. Dit gebeurt meestal wanneer de hPSC-culturen een hoge confluentie (>80%) hebben bereikt tijdens standaard passaging. Het is van cruciaal belang dat hPSC-onderhoud consistent is en dat cellen niet over-confluent worden. Hoge confluentie en inconsistente passaging techniek kan ook leiden tot spontane differentiatie en verhoogde celdood. Als differentiatie aanwezig is in de hPSC-cultuur, raden we aan de gedifferentieerde gebieden te verwijderen door te aspirateren met een fijne pipetpunt als deze niet meer dan 5% van de celpopulatie bedraagt, voordat de test wordt gestart. Als de differentiatiegebieden groter zijn dan 5%, raden we aan dat een nieuwe partij hPSC's ten minste eenmaal wordt ontdooid en gesplitst voordat een nieuwe test wordt gestart.
We hebben waargenomen dat sommige hPSC-lijnen meer vatbaar zijn voor het vormen van niet-renale celtypen, zoals hart- of neuraal weefsel. Als dit gebeurt, kan groottefiltratie met behulp van de celstammen helpen om die organoïden te verwijderen die niet-renale uitwassen bevatten. Als alternatief kan het veranderen van het hPSC-medium en /of de matrix helpen om de niet-renale uitgroei te verminderen. Uit onze ervaring blijkt dat alternatieve hPSC-media met minimale componenten en BME zoals vitronectine een strengere pluripotente niche bieden en zo helpen bij het genereren van homogenere hPSC-culturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 en P30-DK079307 en ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program aan AP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters - Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement - Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
- Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
- Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
- Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
- Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
- Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
- Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
- Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
- Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
- Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
- Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).
