Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påvisande av SARS-CoV-2 neutraliserande antikroppar med hjälp av fluorescerande avbildning med hög genomströmning av pseudovirusinfektion

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

Protokollet beskrivs här skisserar en snabb och effektiv metod för att mäta neutraliserande antikroppar mot SARS-CoV-2 spik protein genom att utvärdera förmågan hos konvalescent serum prover att hämma infektion av en förbättrad grön fluorescerande protein-märkt vesicular stomatitis virus pseudotyped med spik glykoprotein.

Abstract

När COVID-19-pandemin orsakad av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) fortsätter att utvecklas, har det blivit uppenbart att förekomsten av neutraliserande antikroppar mot viruset kan ge skydd mot framtida infektion. Således, när skapandet och översättningen av effektiva COVID-19-vacciner fortsätter i en aldrig tidigare skådad hastighet, kommer utvecklingen av snabba och effektiva metoder för att mäta neutraliserande antikroppar mot SARS-CoV-2 att bli allt viktigare för att fastställa långsiktigt skydd mot infektion för både tidigare smittade och immuniserade individer. Detta dokument beskriver en hög-genomströmning protokoll med vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotyped med SARS-CoV-2 spik protein för att mäta förekomsten av neutraliserande antikroppar i konvalescent serum från patienter som nyligen har återhämtat sig från COVID-19. Användningen av ett replikerande pseudotypat virus eliminerar behovet av en inneslutning nivå 3 anläggning som krävs för SARS-CoV-2 hantering, vilket gör detta protokoll tillgängligt för praktiskt taget alla inneslutning nivå 2 lab. Användningen av ett 96-brunnsformat gör att många prover kan köras samtidigt med en kort leveranstid på 24 timmar.

Introduction

I december 2019 identifierades ett nytt coronavirus, som vi nu känner som SARS-CoV-2, orsaksmedlet för coronavirussjukdom 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 är ett betacoronavirus som tillhör familjen Coronaviridae. Dessa höljede virus består av ett stort positivt RNA-genom och är ansvariga för luftvägs- och tarminfektioner hos både människor och djur2. I maj 2021 rapporterades mer än 157 miljoner fall av covid-19 globalt och mer än 3,2 miljoner dödsfall3. Utvecklingen av ett effektivt vaccin har blivit det primära målet för forskare runt om i världen med minst 77 prekliniska vacciner under utredning och 90 som för närvarande genomgår kliniska prövningar4.

Coronavirus kodar fyra strukturella proteiner inklusive spikproteinet (S), nukleokapslar (N), kuvertprotein (E) och membranproteinet (M). För att komma in i SARS-CoV-2 krävs interaktion mellan den receptorbindande domänen (RBD) av S med värdreceptorn, humant angiotensinkonverterande enzym 2 (hACE2) och efterföljande membranfusion efter proteolytisk klyvning av värdcellsserinproteas, transmembran proteas serin 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Humoral immunodominance av S-proteinet av SARS-CoV har tidigare rapporterats och har nu visats även för SARS-CoV-211,12,13. Neutraliserande antikroppssvar mot S har faktiskt påvisats i konvalescent serum från SARS-CoV patienter 24 månader efter infektion14, vilket belyser deras kritiska roll i det långsiktiga immunsvaret. S-proteinet har identifierats som ett lovande vaccinmål och har därmed blivit en nyckelkomponent i de flesta vacciner under utveckling15,16.

Även om den snabba upptäckten av neutraliserande antikroppar är en kritisk aspekt av vaccinutvecklingen, kan det också kasta ljus över infektionshastigheten och seroepidemiologisk övervakning i drabbade områden17. En replikerings kompetent VSV pseudotypad med SARS-CoV-2 S glykoprotein, i stället för wild-typ VSV glykoprotein, för att studera SARS-CoV-2 infektion i biosäkerhet nivå 2 inställningar donerades vänligt av Whelan och medarbetare18. VSV-uttrycksspik (VSV-S) kommer att användas för att bestämma det neutraliserande antikroppssvaret mot SARS-CoV-2 spike protein. Eftersom VSV-S som används här också uttrycker förbättrat grönt fluorescerande protein (eGFP), kan eGFP-högborgar detekteras inom 24 timmar för att kvantifiera infektion, medan plackbildning kan ta 48 till 72 timmar. Sammanfattas här är ett enkelt och effektivt protokoll för att bestämma förmågan hos konvalescent patienten serum att neutralisera VSV-S-eGFP infektion. Denna metod kan också enkelt anpassas för att förhöra andra potentiella terapier som syftar till att störa värd-viral interaktion av SARS-CoV-2 S protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Pläteringsceller (dag 1) för produktion och kvantifiering av pseudoviruset SARS-CoV-2

  1. Förberedelse för vävnadskultur
    1. Varm 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS); Dulbeccos modifierade eagle medium (DMEM) som innehåller 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin (valfritt); och 0,25% trypsinetylendiamintetraättiksyra (EDTA) till 37 °C i ett vattenbad i ca 15 minuter.
    2. Desinficera en mjukpappersodlingshuv med 70% etanol och placera vävnadskulturrätter, Pasteur-pipetter och serologiska pipetter i vävnadsodlingshuven efter behov. Ta bort PBS, DMEM och trypsin från vattenbadet och desinficera med 70% etanol innan du placerar i vävnadsodlingshuven.
  2. Plätering och underhåll av celler
    1. Odla Vero E6-celler i DMEM (innehållande 10% FBS) i T75 vävnadskulturkolvar eller 15 cm vävnadsodlingsfat i en 37 °C inkubator med 5% CO2. Passage cellerna efter behov när cellerna är 80-90% sammanflöde.
    2. Tvätta cellerna genom att tillsätta 10 ml 1x PBS till varje maträtt och försiktigt gunga 4-5 gånger; aspirera på PBS. Tillsätt 3 ml trypsin-EDTA till varje skål, gunga plattan för att säkerställa att hela ytan är täckt. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5% CO2 i cirka 5 minuter, eller tills cellerna har lossnat.
    3. Tillsätt 7 ml DMEM (innehållande 10% FBS) för att inaktivera trypsin och återanvända cellerna genom pipettering upp och ner flera gånger. Snurra ner cellerna för att ta bort trypsin med en bänkcentrifufu i 500 × g i 5 minuter, aspirera på mediet utan att störa cellpelleten och försänk cellerna i 10 ml DMEM (innehållande 10% FBS). Om celler krävs för framtida experiment, placera 1 ml i en ny maträtt som innehåller 15 ml färsk DMEM (innehållande 10% FBS).
    4. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare eller hemocytometer och tillsätt cirka 1 × 107 celler till varje 15 cm platta och inkubera vid 37 °C med 5% CO2 tills de är 100% sammanflöde (1-2 dagar).

2. VSV-S-EGFP pseudoviruspreparat

  1. Infektion
    1. Infektera celler vid multiplicitet av infektion (MOI) 0,01 med VSV-S-eGFP stock virus i 12 ml serumfri DMEM för 1 h vid 37 °C med 5% CO2, ibland gungning plattorna. Ersätt inokulat med färsk DMEM (innehållande 2% FBS och 20 mM HEPES, pH 7,7) och flytta till en inkubator inställd på 34 °C med 5% CO2.
      OBS: En temperatur på 34 °C krävs för spridning av VSV-S-eGFP i cellkulturen.
    2. Samla in cell supernatanter vid observation av omfattande cytopatisk effekt (CPE) och cellavlossning, cirka 48 h efter infektion. Använd ett fluorescerande mikroskop för att visualisera det omfattande uttrycket av eGFP av infekterade celler från 24 timmar efter infektion.
  2. Samling
    1. Centrifugera supernatanterna med en bänkcentrifuger i 5 min vid 1 000 × g vid 4 °C för att avlägsna cellskräpet. Aliquot supernatanten för att undvika flera frys-tina cykler, och lagra vid -80 °C.

3. Titering vsv-S-eGFP pseudovirus

  1. Seriell utspädning för att bestämma viral titer
    1. Platta Vero E6-celler på 6-brunnsplattor vid en såddtäthet på 6 × 105 celler per brunn i DMEM (med 10% FBS) och inkubera över natten vid 37 °C med 5% CO2.
      OBS: Vero-celler som överuttrycker TMPRSS2 och hACE2 kan också användas.
    2. Sätt upp en 10-faldig seriell utspädningsserie av VSV-S-eGFP-viruset i kall serumfri DMEM genom att placera 900 μL media i sju mikrocentrifugerör. Etikettrör från 1 till 7. Tillsätt 100 μL av viruslagret till det första röret och virveln kort. Överför 100 μL utspädd virus från rör 1 till rör 2 och virvel kort; fortsätt tills rör 7.
    3. Aspirera mediet från alla brunnar på 6-brunnsplattan som innehåller Vero E6-celler och ersätt med 500 μL utspädningar 10-2 till 10-7. Inkubera plattorna i 45 min vid 37 °C med 5% CO2, gunga försiktigt var 15: e minut.
    4. Aspirera inokulat och ersätt med överlägg som innehåller en 1:1 blandning av 2x DMEM och 6% karboxymetylcellulosa (CMC), slutlig koncentration av 3% CMC, kompletterad med 10% FBS; inkubera vid 34 °C med 5% CO2 för 48 h.
      OBS: Förvärm överläggsblandningen i ett vattenbad på 37 °C i 15 minuter under infektionssteget. En 1:1 blandning av 1% agaros med 2x DMEM kompletterad med 10% FBS kan användas i stället för CMC. För att täcka med agaros, koka 1% agaros (i dH2O) och blanda med kallt 2x DMEM. Se till att blandningen är en lämplig temperatur innan du tillsätter cellmonolagret (ca 37-40 °C). Om agaros används för överlägget måste cellerna fixeras genom inkubation i 2 ml 3:1 metanol:ättiksyra i minst en timme före färgning.
  2. Färgning och beräkning av viral titer
    1. Visualisera plack genom färgning med kristallviolett eller direkt visualisering av eGFP under ett fluorescerande mikroskop.
    2. För att färga plattor, aspirera överlägget, tvätta en gång med PBS och tillsätt sedan 2 ml 0,1% kristallviolett (i 80% metanol och dH2O) till varje brunn. Placera på en tallriksvipp i ca 20 minuter vid rumstemperatur före avfärgning. Ta bort den kristallviolett och tvätta försiktigt varje brunn två gånger med dH2O eller PBS.
      OBS: Tvätt- och färgningssteg bör utföras försiktigt genom att långsamt pipettera mot sidan av varje brunn för att säkerställa att cellmonolagret förblir intakt under hela proceduren.
    3. Låt plattorna torka i minst 1 h innan plack räknas. Se till att plackantal erhålls från brunnar som innehåller 20 till 200 plack. För att beräkna virusets titer i plackbildande enheter (PFU) per ml, multiplicera utspädningsfaktorn för den väl räknade med infektionsvolymen och dela detta nummer från plack som finns i respektive brunn.
      Equation 1

4. Pläteringsceller (dag 1) för mätning av neutralisering av sars-cov-2 pseudovirus genom kommersiellt tillgängliga antikroppar och konvalescent patientserum

  1. Förberedelse för vävnadskultur
    1. Förbered medel- och vävnadskulturhuven enligt beskrivningen i avsnitt 1. Dessutom förbereda det nödvändiga antalet 96 brunnsplattor för att rymma minst 2 replikat per prov (dvs. 1 platta per 6 prover); lägga till ytterligare replikat om provvolymen tillåter det.
  2. Plätering och underhåll av celler
    1. Odla och underhåll Vero E6-celler enligt beskrivningen i avsnitt 1. Förbered minst 10 ml cellfjädring per 96-brunnsplatta vid en koncentration av 2 × 105 celler per ml (platta 1,5 × 105 celler per ml för analyser som utförs efter 48 timmar, om det behövs). Tillsätt 100 μL cellfjädring till varje brunn på en 96-välplatta med en flerkanalspipett och inkubera i 24 timmar vid 37 °C med 5% CO2.
      OBS: Blanda cellupphängningen väl och vagga varje platta försiktigt i alla riktningar för att säkerställa jämn fördelning av celler.

5. Utspädningar och infektioner i antikropp eller serum (dag 2)

OBS: Detta protokoll kan tillämpas för att mäta neutralisering av VSV-S-eGFP med både kommersiellt tillgängliga antikroppar och patientserum, samt serum som samlats in från djur för prekliniska vaccinutvecklingsstudier. *Notera de ytterligare steg som anges vid hantering av patientserumprover.

  1. Serieutspädningsserier
    1. Innan serumproverna späds ut ska varje prov värmas upp i ett vattenbad på 56 °C i 30 minuter för att inaktivera komplementet. Se till att nödvändiga säkerhetsåtgärder vidtas vid hantering av patientprover. Öppna endast provbehållare i vävnadsodlingshuven och se till att lämplig inneslutningsnivå 2 personlig skyddsutrustning är sliten.
    2. Ställ in utspädningsserien i en tom 96-brunnsplatta (platta 1).
    3. Påbörja alla utspädningar i rad A på 96-brunnsplattan i 80 μL. *För patientprover, börja utspädningsserien vid 1 av 10 genom att placera 8 μL serum i 72 μL serumfritt DMEM (med 1% penicillin/streptomycin).
      OBS: Koncentrationen av neutraliserande antikroppar som används beror på den aktivitet som tillverkaren förutspår. För sars-cov-2 spike neutraliserande antikropp som används här (se tabellen över material), börja med 5 μg/ml för att observera minst 50% neutralisering.
    4. Tillsätt 40 μL serumfritt DMEM (med 1% penicillin/streptomycin) på raderna B till G och 80 μL till rad H. Lägg inte till virus på rad H, eftersom det fungerar som en cellkontroll.
    5. Blanda och överför 40 μL utspädd serum eller antikropp från rad A till rad B med en 12-wells flerkanalspipetter och kassera 40 μL från rad F. Tillsätt inte serum till rad G eftersom det representerar kontrollraden för enbart virus.
  2. Infektion och överlägg
    1. Förbered en lämplig volym utspädd VSV-S-eGFP för att behandla varje brunn vid MOI 0,05 (eller 2000 pfu). (När du slutför denna beräkning, kom ihåg att endast 60 μL av den totala 80 μL-volymen kommer att flyttas till cellerna, var därför noga med att multiplicera virusets volym med 1,33 för att bibehålla 2000 pfu).
      OBS: Eftersom VSV-S-eGFP är temperaturkänslig, se till att viruslagren förblir på is när de inte används och undvik flera frys-tina-cykler eftersom titers kommer att skilja sig åt efter upprepad frysning.
    2. Tillsätt 40 μL utspädd virus till varje brunn i raderna A till G på platta 1 och blanda genom pipettering upp och ner 4-5 gånger. Inkubera plattan i 1 h vid 37 °C med 5% CO2.
    3. Ta bort plattan som innehåller celler från inkubatorn (platta 2) och aspirera försiktigt media från alla brunnar. Överför 60 μL antikropps-/virusblandning från platta 1 till platta 2 och inkubera i 1 h vid 37 °C med 5% CO2, gunga plattan var 20:e minut.
    4. Fyll på varje brunn med 140 μL överlägg som innehåller CMC i DMEM för en slutlig koncentration på 3% CMC (med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin). Placera platta 2 i en inkubator inställd på 34 °C med 5% CO2 i cirka 24 timmar före avbildning.
      OBS: Förvärm överläggsblandningen i ett vattenbad på 37 °C i 15 minuter under infektionssteget.

6. Bildbehandling och kvantifiering (dag 3)

  1. Bildplattor med hjälp av en automatiserad fluorescein isotiocyanatefilter (FITC) eller ett alternativt filter med en excitationsvåglängd på 488 nm). Kvantifiera virusinfektion genom att skapa ett protokoll som automatiskt identifierar och räknar enskilda eGFP-högborgar. Om en automatisk räkningsfunktion inte är tillgänglig använder du ImageJ-programvaran för att kvantifiera antalet eGFP-foci.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll beskriver en snabb och effektiv metod för att upptäcka neutraliserande antikroppar mot SARS-CoV-2 S protein via hämning av VSV-S-eGFP pseudovirusinfektion (kvantifierbar genom förlust av eGFP-högborgar upptäckt). En schematisk representation av protokollet visas i figur 1. Det rekommenderas att en kommersiellt tillgänglig antikropp används som en positiv kontroll varje gång analysen körs för att säkerställa analysens konsistens. Här demonstrerar vi en utspädningskurva med hjälp av en kommersiellt tillgänglig neutraliserande IgG-antikropp mot SARS-CoV-2 Spike RBD jämfört med en IgG-kontroll (se materialtabellen för detaljer om båda antikropparna; Bild 2).

Konvalescenta patientprover samlades in ungefär tre månader efter SARS-CoV-2-infektion, och pseudovirusneutralisering bestämdes med den metod som beskrivs ovan (figur 3). Viktigt, minimal bakgrund hämning observerades med friska givaren serum. Dessutom, notera, denna analys skiljer mellan patienter med hög symptom svårighetsgrad jämfört med de med mildare sjukdom baserat på behovet av sjukhusvistelse. I linje med andra rapporter har vi observerat inom vår lilla kohort att inlagda patienter tenderar att visa ökad neutraliserande kapacitet än de som inte behövde sjukhusvistelse19,20. Även om detta kanske inte alltid är fallet för sjukhus kontra icke-sjukhus patientprover, är analysens förmåga att skilja olika grader av neutralisering en tillgång. Det kan också finnas fall där neutraliserande förmåga av patientens serum är mycket högre än de som visas här. Vid behov kan startutspädningen av patientserum justeras, eller ytterligare utspädningssteg kan utföras på en extra platta.

Figure 1
Figur 1: Protokoll skiss som visar neutralisering av VSV-S-eGFP genom konvalescent serum. Förkortningar: VSV = vesikulärt stomatitvirus; eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; COVID-19 = coronavirussjukdom. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: En kommersiellt tillgänglig neutraliserande antikropp mot SARS-CoV-2 har använts som ett exempel på en positiv kontroll vid sidan av IgG som en negativ kontroll. Förmågan att neutralisera antikroppar för att hämma virusinfektion kommer att variera; hänvisa till den information som finns tillgänglig för den specifika antikropp som köpts för att bestämma vilken koncentration som ska börja utspädningskurvan (proverna kördes i tre exemplar, felstaplar representerar ± SD). (A) Procentuell hämning har beräknats baserat på antalet eGFP-högborgar som detekteras via (B) fluorescerande avbildning. Förkortningar: SARS-CoV-2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2; IgG = immunglobulin; SD = standardavvikelse; eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; RBD = receptorbindande domän. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Förmågan hos konvalescent serum från patienter att neutralisera VSV-S-eGFP varierar beroende på svårighetsgraden av symtomen. Patient serum prover samlades in cirka 3 månader post-SARS-CoV-2 infektion, och kontroll prover samlades in från oinfekterade patienter (prover kördes i tre exemplar, felstaplar representerar ± SD). (A) Procentuell hämning har beräknats baserat på antalet eGFP-högborgar som detekteras via (B) fluorescerande avbildning. Förkortningar: SARS-CoV-2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2; SD = standardavvikelse; eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som beskrivs här kan anpassas för att passa olika labbmiljöer och resurser efter behov. Viktigt är att den huvudsakliga begränsningen av detta protokoll är nödvändigheten av en inneslutning nivå 2 utrymme och vävnad kultur huva. Tillämpningen av ett replikerande RNA-virus pseudotypat med SARS-CoV-2-spiken, såsom VSV-S-eGFP, är ett formidabelt alternativ till SARS-CoV-2-viruset, som kräver ett arbetsområde på inneslutningsnivå 3, men kan förbli en begränsning för vissa grupper. Alla andra steg som beskrivs här är ganska flexibla och kan utföras i nästan alla inneslutning nivå 2 labb. Till exempel är det inte nödvändigt att använda en fluorescerande bildspelare med en automatiserad räkningsfunktion. 96-brunnsformatet som används här innebär att endast cirka 4 synfält krävs för att avbilda nästan hela brunnen med det lägsta tillgängliga målet (2x).

Ett manuellt fluorescerande mikroskop kan användas för att avbilda flera fält i varje brunn, och ImageJ (fri programvara) kan sedan användas för att kvantifiera eGFP-högborgar. Dessutom har vi valt att använda 96-brunnsformatet för att använda lägsta möjliga serumvolym samt hålla förbrukningsbar användning till ett minimum. Om ett fluorescerande mikroskop inte är tillgängligt kan detta protokoll skalas upp till ett 6- eller 12-välformat för att upptäcka plackbildning efter kristallviolett fixering och färgning (liknande det virala titerprotokollet som beskrivs ovan). Det mest kritiska övervägandet att tänka på när du utför detta protokoll är temperaturkänsligheten hos VSV-S-eGFP. När du arbetar med VSV-S-eGFP, aliquot alltid viruset i små volymer för att undvika flera frys-tina cykler, och hålla viruset på is när det är möjligt. Dessutom kan robust fluorescerande signal detekteras efter 24 timmar; Vi har dock förvärvat liknande resultat efter imaging vid 20 till 28 h efter infektion.

Det finns flera metoder tillgängliga för att upptäcka förekomsten av antikroppar mot SARS-CoV-2, inklusive den enzymlänkade immunosorbentanalysen (ELISA), som kvantifierar den totala mängden antikroppar mot S21,22. Här har vi skisserat en snabb och pålitlig metod för att specifikt upptäcka neutraliserande antikroppar mot immunodominant SARS-CoV-2 spik protein i konvalescent serum från patienter. Vi har förbättrat det klassiska plack-reduktion neutraliseringstestet (PRNT) genom att framgångsrikt anpassa sig till ett 96-välformat, vilket möjliggör detektion av neutraliserande antikroppar i ett stort antal prover inom 24 timmar genom automatiserad kvantifiering av pseudovirusinfektion, vilket möjliggör snabb vändning av slutliga datarapporter. Förutom att detektera neutraliserande antikroppar inom serum kan denna metod anpassas för att utföra screening med hög genomströmning av andra terapeutiska strategier, som syftar till att direkt hämma SARS-CoV-2 spike protein interaktion med hACE2, såsom monoklonala antikroppar, rekombinant löslig hACE2 eller proteashämmare, för att hindra viral entry23 . Med framväxten av flera SARS-CoV-2 spikproteinvarianter är det också viktigt att notera att denna metod kan tillämpas för att avgöra om liknande neutraliseringsnivåer uppstår efter infektion med olika varianter av viruset24.

Andra exempel på tillgängliga metoder för att upptäcka antikroppar mot SARS-CoV-2 är ELISAs, lentivirusbaserade analyser och kommersiella kit för att utvärdera serumprovernas neutraliserande kapacitet. Medan de vanliga IgM- eller IgG-bindande ELISAs är en effektiv metod för att bestämma förekomsten av antikroppskoncentration för att spåra tidigare infektion eller immunisering, kan de inte skilja de bindande antikropparnas neutraliserande kapacitet25. Pseudotypade lentivirusbaserade neutraliseringsanalyser har en förbättrad säkerhetsprofil genom att använda icke-replikativa viruspartiklar i motsats till att replikera VSV-S-eGFP; Detta skapar dock en barriär när det gäller testkapacitet eftersom lentivirala titer tenderar att vara mycket lägre26,27. Det finns flera kommersiellt tillgängliga kit som mäter antikropparnas förmåga att blockera infektion via konkurrenshämning av SARS-CoV-2 spike protein (RBD specifikt) som binder med hACE2-receptorn efter inkubation med konvalescent serum (t.ex. CUSABIO, GenScript, Abnova). Medan många av dessa kit har välrenommerad känslighet och specificitet, tenderar de också att vara relativt dyra och därför inte idealiska för en stor mängd prover. Protokollet som tillhandahålls här är snabbt, pålitligt och billigt. Denna metod med hög genomströmning kan användas för att testa många prover och uppnå en robust avläsning inom 24 timmar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen i samband med denna publikation.

Acknowledgments

Vi vill tacka Whelan-labbet för att generöst ha tillhandahållit VSV-S-eGFP-viruset som används i detta protokoll (beskrivs i fall et al. 2020). Vi tackar också Drs. Bill Cameron och Juthaporn Cowan (och team) för att samla in patientens blodprover (REB-protokoll-ID 20200371-01H). Författarna avslöjar mottagandet av följande ekonomiska stöd för forskning, författarskap och / eller publicering av denna artikel: Detta arbete finansierades av det generösa stödet från Ottawa Hospital Foundation och ett bidrag från Canadian Institutes of Health Research (#448323) och ett fast grant från Thistledown foundation för COVID-19 Science till C.S.I. T.R.J. finansieras av ett Ontario Graduate Scholarship och cluster Mitacs fellowship. JP finansieras av ett kluster Mitacs-stipendium. T.A. finansieras av cihr banting fellowship. Vi vill också tacka alla individer som deltog och donerade sina blodprover för denna studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).

Tags

Immunologi och infektion nummer 172 SARS-CoV-2 COVID-19 Pseudovirus Neutraliserande antikropp Vesikulärt stomatitvirus Spike glykoprotein
Påvisande av SARS-CoV-2 neutraliserande antikroppar med hjälp av fluorescerande avbildning med hög genomströmning av pseudovirusinfektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, … More

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, R., He, X., Rezaei, R., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (172), e62486, doi:10.3791/62486 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter