Summary
生物元力探针 （BFP） 是一种 原位 动态力光谱 （DFS） 技术。BFP可用于测量活细胞分子相互作用的弹簧常数。此协议对 BFP 检测到的分子键进行弹簧常量分析。
Abstract
生物元原力探针（BFP）最近成为一种原生细胞表面或 原位 动态力光谱（DFS）纳米图，可以测量单分子结合动力学，评估配体受体相互作用的机械特性，可视化蛋白质动态构象变化，更令人振奋地阐明受体介导细胞机械增效机制。最近，BFP被用来测量分子键的弹簧常数。此协议描述了执行分子弹簧恒定 DFS 分析的分步过程。具体来说，讨论了两种 BFP 操作模式，即珠子单元和珠珠模式。此协议侧重于从 DFS 原始数据中提取分子键和细胞的弹簧常数。
Introduction
作为活细胞DFS技术，BFP工程人类红血球（RBC：图1）进入一个超敏感和可调谐的力量传感器与兼容的弹簧恒定范围在0.1-3 pN/nm1，2，3。为了探测配体受体相互作用，BFP 使 DFS 测量在 +1 pN （10-12 N）， +3 nm （10-9米） 和 +0.5 ms （10-3 s） 生效， 空间和时间分辨率4，5.其实验配置由两个对立的微管，即探测器和目标组成。探针微管吸气RBC和珠子粘在其顶点通过生物素-链球菌素的相互作用。珠子上涂有感兴趣的配体（图1A）。目标微管吸气细胞或带有利益受体的珠子，分别对应珠细胞（图1B）和珠珠（图1C）模式。
BFP的建造，组装和DFS实验协议被详细描述之前1，6。简言之，BFP 触摸周期由 5 个阶段组成：方法、因平格、接触、缩回和分离（图 1D）。水平 RBC 顶点位置表示为+xRBC。在开始时，未应力（零力）RBC 变形=xRBC为 0（表 1）。然后，目标由压电翻译驱动，以冲压和缩回从探针珠（图1D）。RBC 探头首先由目标压缩，具有负 RBC 变形+xRBC < 0。在债券事件中，缩回阶段从压缩阶段过渡到拉伸阶段，正 RBC 变形=xRBC > 0 （图 2C和D）。根据胡克定律，BFP 承载力可以测量为F = k RBC ×xRBC，其中kRBC （表1）是 BFP 的 RBC 弹簧常数。当键破裂并完成一个触摸周期后，探针珠返回到零力位置与+xRBC = 0 （图1D）。
为了确定kRBC，我们测量并记录探针微管内孔（Rp）、RBC（R0）和 RBC 和探针珠之间的圆形接触区域（Rc）的半径（图1A）。然后kRBC根据埃文的模型（Eq.1）7，8使用实验室VIEW程序，作为一个虚拟仪器（VI）来操作BFP（图S1A）8，9。
（Eq. 1）
通过建立 BFP 和获得 DFS 原始数据，我们介绍如何分析配体受体对或细胞的弹簧常数。DFS关于糖化蛋白Thy-1和K562细胞轴承集成蛋白相互作用的原始数据α 5 β 1（Thy-1-α 5 β 1： 数字3A和3B）10和纤维蛋白和珠涂层的集成物α IIb β 3（FGN-α IIb β 3： 图3C）11，12已分别用于演示珠细胞和珠珠分析模式。
BFP 实验准备
有关 BFP 实验制备和仪器的详细信息，请参阅先前发布的协议3。简言之，人类RBC在碳/碳酸氢盐缓冲中使用了生物素-PEG3500-NHS进行生物素化。感兴趣的蛋白质与磷酸盐缓冲器中使用MAL-PEG3500-NHS的玻硅酸盐玻璃珠共价耦合。为了附着在生物素化RBC上，探针珠还使用MAL-SA涂上链球菌素（SA）。请参阅材料表和表2。
为了组装BFP（图1，左），第三个称为"帮手"的微管将用于交付探针珠，并粘附到RBC的顶点1，3。SA 涂层探针珠和生物镀金 RBC 之间的共价相互作用比配体受体的利益纽带强得多。因此，分离阶段可以解释为配体受体键破裂，而不是探针珠从RBC分离。
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Protocol
1. 获取可分析的 DFS 事件
- 在 BFP 控制和参数设置（图 S1A）的软件（例如 LabVIEW VI）中开始实验。
- 观察 BFP 监视器软件中的重复探针珠目标珠/细胞触摸（图 S1B）。
- 通过调整冲击力和接触时间，在前 50 次接触中测试并实现粘附频率≤ 20%，从而确保 DFS 粘附事件的 ≥ 89% 通过单键12、13、14进行介导。
注：对于每个珠子单元格/珠子对，我们执行 200 个重复的触摸周期。为了获得可发布的数据质量，我们通常执行 n ≥ 3 个珠珠或珠子细胞对。- 通过 BFP 控制和参数设置软件提示，以"强制与时间"的形式将数据保存到每个对末尾的用户定向文件夹。
- 使用 BFP 采集平台（图 S1C）收集债券事件的原力与时间原始数据，如图 2A中所举例。
- 打开 BFP 数据分析软件。单击黄色文件夹图标，通过双击它们来选择相应的原始数据文件。
- 运行程序，然后单击上下按钮在事件之间切换。使用离群值排除标准 （图 S2）筛选出无效事件。选择输出数据类型作为"强制与时间"格式，然后单击 "导出绘图"数据 按钮。
2. 将力与时间曲线转换为力与位移曲线
- 将与缩回阶段对应的数据段导出到电子表格（图2A，方形选框），这与弹簧常数分析相关。
- 使用电子表格软件绘制原力与时间曲线。要获得原力与置换曲线，请将时间值（图 2A、x轴）转换为总位移值（+xtot），将时间值与 Piezo 运动速度（即预设 4，000 nm/s）相乘。
- 从每个获得的位移值中减去最小的位移值，将第一个数据点为零。这种水平转换不会影响缩回阶段的上升坡度，也不会影响随后的弹簧常数计算。
- 值得注意的是，BFP 被认为是一个串行弹簧系统，其中+x托特 （表 1）RBC 的总和变形，+xRBC （表1），分子键，+x摩尔 （表 1），和目标细胞，+x细胞 （表 1），作为 Eq. 2：
（Eq. 2） - 绘制图 2B中显示的原力（F）与位移 （+xtot）曲线。
（Eq. 2）3. 珠子细胞模式的弹簧神经元分析
- 在力与位移曲线中，可以识别两个不同的斜面，每个斜点可以表示压缩相和拉伸相。将回归线拟合到每个数据组（图 2B），其中较大的线性拟合坡度表示压缩相下的总弹簧常数（图 2B，红色），表示为k1（表 1）：较小的线性拟合坡度表示十字形相（图 2B、蓝色）的总弹簧常数，表示为k2（表 1）。
- 对于每步2.2描述的串联弹簧，表示总弹簧常数的对等，ktot（表1），作为RBC、k RBC（表1）、分子键、k摩尔（表1）和目标细胞、k细胞（表1）的弹簧常数反向之和。在珠细胞模式的压缩阶段，分子键不拉伸，因此不考虑kmol。此方案中ktot的对等 （1/k1）表示为
（Eq. 3） 。
在示例数据中，kRBC是预先确定的（默认情况下为 0.25 pN/nm）。k细胞可从 Eq. 3 中提取，并具有获得的k1和kRBC（图3B）。 - 在拉伸阶段，配体受体对之间形成粘附。在此方案中表达 ktot 的对等 （1/k2） 作为
（Eq. 4）
其中 k2 （表 1） 表示拉伸阶段的总弹簧常数。 - 从1/ k 2 中减去1/ k1 （比较 Eq. 3 与 Eq. 4） 。
（Eq. 3） 。
（Eq. 4）4. 珠珠模式的春季恒定分析
- 将回归线安装到压缩相数据以获取k1（类似于图 2B，红色）。值得注意的是，在珠珠模式下，目标细胞被涂有兴趣受体的玻璃珠所取代（图1C）。由于珠子变形可以忽略不计，因此可以相应地从 Eq. 3 和 Eq. 4 中删除 1/k细胞术语。压缩相的对等k托特（1/k1）可以表示为：
（Eq. 5） - 将回归线安装到拉伸相数据以获取 k 2（类似于图 2B，蓝色）。拉伸相（1/k2）的对等k托特可表示为：
（Eq. 6） - 从1/ k 2 中减去1/ k1 （比较 Eq. 5 与 Eq. 6） 。
（Eq. 5）
（Eq. 6）Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在这项工作中，我们演示了 BFP 弹簧常数分析的协议。对于珠细胞分析模式，我们分析了涂在探针珠上的糖基化蛋白Thy-1与目标K562细胞（Thy-1-integrin 5 β 1）上表达的特格林α分子键的kmol（Thy-1-integrin α 5 β 1： 图3A）10. k细胞也来自珠细胞模式（K562细胞：图3B）。对于珠珠模式，纤维蛋白原和集成蛋白之间的分子键α IIb β 3（FGN-因特格林α IIb β 3：图3C）11、12用于演示珠珠分析模式。
对于珠细胞模式，我们测量了Thy-1-集成素的弹簧常数α 5 β 1键和K562细胞为kmol = 0.45 ± 0 0.28 pN/nm （图3A） 和k单元格 = 0.18 ± 0.07 pN/nm （图 3B）从 27 预筛选的可分析事件。对于珠珠模式，我们从33个预筛选的分析事件中测量了 FGN-集成αIIbβ 3 键的弹簧常数为kmol = 0.53 ± 0.29 pN/nm （图 3C）。
| 象征 | 定义 | 象征 | 定义 |
| \x托特 | 馅饼的总位移，也可以解释为RBC、靶细胞和分子键的总变形。 | •xRBC | RBC 变形，这也可以解释为探针珠的位移。 |
| k托特 | 整个 BFP 串行弹簧系统的总弹簧常数。 | kRbc | 探测器微管的吸气 RBC 的弹簧常数。 |
| k摩尔 | BFP 的弹簧常数检测到分子键 | k电池 | 目标单元格的弹簧常数。 |
| k1 | k缩回阶段的压缩阶段。 | k2 | k缩回阶段的拉伸阶段。 |
| +F1 | 在压缩阶段，探针珠感觉到的力增量。 | +F2 | 探针珠在拉伸阶段感觉到的力增量。 |
| \x1 | 压缩阶段的位移增量。 | +x2 | 在紧张阶段的位移增量。 |
表1。BFP分子弹簧常数分析的符号定义。所有物体的水平位置定义为x，而 x [nm]是指相对于原始位置的变形。[F [pN] 是指 BFP 测量的力增量。k [pN/nm] 指弹簧常数。子脚本 1 和 2 分别对应压缩和拉伸相。分子弹簧常数来自原力（F）与。位移（+x托特）曲线。
图1： BFP配置和DFS触摸周期。（A） BFP 系统组装了两个对立的微管，即探测器（左）和目标（右）。探测器微管吸气RBC（红色），玻璃珠粘在其顶点，作为力传感器。目标微管吸气受体携带细胞（蓝色）。RBC 弹簧常数（kRBC）由吸入压力 （+p）和吸气 RBC（R0）、探针微管（Rp）和 RBC 和探针珠之间的圆形接触区域（Rc）的半径决定。（B 和 C）珠细胞 （B） 和珠珠 （C） BFP 模式的显微图。刻度条 = 5 μm. （D） BFP 触摸周期，由方法、因平、接触、缩回和分离阶段组成。+xRBC = 0 破折号线表示 BFP 未受压力或零力位置。缩回阶段包括压缩相（+xRBC < 0，红色），零力位置（+xRBC = 0，黑色）和拉伸相（+xRBC >0，蓝色）的顺序。黑色箭头表示债券事件的位置。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：从DFS原始数据中提取分子弹簧常数。 （A） 代表力（F） 与时间（t）DFS 原始数据曲线在一个 BFP 触摸周期中。（B） 代表转换力（F） 与描绘缩回阶段的位移（+xtot）曲线。k1和k2分别表示连续压缩和拉伸相的拟合坡度。[F1 和+F2分别表示压缩相和拉伸相数据中的力增量，其中+x1和+x2分别表示压缩相和拉伸相数据中的排量增量。压缩阶段（R1 2）和拉伸相（R2 2）期间的弹簧常数的R2值在图表上标注，以表示良好的统计适应性。（C 及 D）珠细胞 （C） 和珠珠 （D） 实验模式中缩回阶段的插图。kRBC代表 RBC 的弹簧常数;k细胞和k摩尔分别代表目标细胞的弹簧常数和分子键。在拉伸阶段，配体受体对之间形成粘附，RBC 偏转方向与 Piezo 缩回零力位置（+xRBC > 0）相同。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：BFP的直方图测量弹簧常数。在珠子模式下测量的弹簧常数（左 y 轴） 和频率分布 （右 y 轴） α5β1键 （A） 和 K562 目标细胞 （B） 和 FFGN-因特格林αIIbβ3键 （C） 在珠珠模式下。直方图与高斯分布曲线（粉红色）相符，统计参数R2用于表示健身强度。请单击此处查看此图的较大版本。
图 S1：自制 BFP 界面。（A） BFP 控制和参数设置接口。确定RBC弹簧常数的参数是从生物物理参数面板输入的。（B） BFP 监测。将从此相机视图中观察实时 BFP 触摸周期。（C） BFP DFS 分析界面，其中力（F） 与时间（t）曲线被离线审查和预处理，以便进行后续分子弹簧常量分析。请点击这里下载此文件。
图 S2。BFP 可分析数据质量控制和预筛选标准。（A） 高质量的好DFS事件：（一） 珠细胞破裂力事件：（二） 珠细胞终身事件：（三） 珠珠破裂力事件：（四） 珠珠终身活动。（B） 具有某些噪声的可接受 DFS 事件： （i） 数据漂移，但放大缩回阶段仍然有效：（二）债券分离后轻微数据漂移;（三） 零力制度的数据扭结：（四） 保持力小（<10pN）。（C）应丢弃的劣质事件：（一） 无粘附：（二） 数据振荡：（三） 数据一直漂移：（四） 不连续的数据：（五） 压缩力过小（≈0 pN）：（六） 多种债券：（七） 与衍生的kmol < 0 的无效数据：（八） 信号错误。灰色间歇性线表示零力。请点击这里下载此文件。
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Discussion
总之，我们提供了详细的数据分析协议，用于在 BFP 珠子和珠子细胞分析模式下对 DFS 原始数据进行预处理并衍生分子弹簧常数。介绍了确定分子和细胞弹簧常数所需的生物力学模型和方程。尽管研究的集成物不同，但珠珠模式和珠细胞模式测量的kmol具有显著的范围差异（图3A与图3C）。值得注意的是，与珠珠模式，受体是共同连接到玻璃珠。相比之下，与珠细胞模式相比，表面受体由底层等离子体膜和细胞骨架调节，最有可能影响测量到的kmol。
数据质量控制对于确保可重复性至关重要。为此，我们已对原力与时间图实施了 DFS 数据预筛选和离群值排除标准。为了证明这一点，我们选择了一个具有代表性的数据集，其中我们将DFS原始数据分为三个质量级别：良好（图S2A），噪声可接受（图S2B）和差（图S2C）。对于使用 BFP 的初学者，我们建议采用严格的标准，以良好的质量（图 S2A）预先筛选数据。 值得注意的是，根据数据预筛选标准，压缩相的回归拟合线应比拉伸相陡峭，特别是 k1 > k2（ 图S2C，vii）。当测量 k1 < k2（ 图S2C，vii） 时，派生的 kmol < 0 与第 4 步中每次计算的原理不一致。然后，此类事件应被视为无效的离群值并予以丢弃。
为了在数据采集过程中采用单分子水平的BFP测量，根据先前的研究12，已经实施了多个实验配置。首先，通过严格控制溶液浓度、蛋白质数量和反应条件15，珠子上的蛋白质涂层密度通常被压低到最低水平（如60μm-2）。因此，估计珠子上蛋白质之间的平均空间距离比蛋白质的线性尺寸大得多，有利于我们在单分子水平12、13、14上的测量。其次，我们控制每个配体受体对的粘附频率≤20%，根据这种频率结合事件将跟随Poisson分布预测≥89%的事件将是单分子结合14，15。为此，应相应地设置冲击力和接触时间，并且需要在整个实验12中保持一致。然而，仍然有可能连续发生多个债券（图S2C，vi）。在这种情况下，我们将丢弃带有多个债券签名的事件。最后但并非最不重要的，负控制实验将执行与珠涂覆牛血清白蛋白（材料表）或SA单独，以确保非特定粘附频率≤2%16，17。
虽然BFP是强大的研究蛋白质动力学活细胞表面10，11，12，有技术限制。在 BFP 中，一次只能调查一对配体受体对。获得具有统计意义的足够数据将是耗时的。此外，实验程序是劳动密集型的，学习曲线陡峭。实施明智，目前的BFP系统容易受到环境漂移和周围的机械振动。因此，需要持续手动调整以确保 DFS 数据质量。为此，我们最近的一项研究已经推出了超稳定的BFP反馈控制算法，以提高BFP力夹DFS检测4的稳定性。这一技术进步使测量更强分子相互作用，如抗原抗体结合超长粘结寿命（>50s）。不过，我们预计未来将努力将 BFP 数据采集和 DFS 分析自动化并集成到一个计算机化程序中，使整个 BFP 操作和数据分析更加用户友好和高吞吐量。
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Disclosures
作者宣称，他们没有相互竞争的利益来报告本研究。
Acknowledgments
我们感谢纪劳姆·特罗亚德茨的有益讨论，王子豪的硬件咨询，悉尼制造中心，格雷格·苏宁和西蒙·林格支持我们的实验室启动。这项工作得到了澳大利亚研究理事会发现项目（DP200101970 - 洛杉矶J.），新南威尔士州心血管能力建设计划（中早期职业研究员格兰特 - 洛杉矶J.），悉尼研究加速器奖（SOAR - 洛杉矶），拉马乔蒂的支持 基金会健康投资赠款（2020HIG76 - 洛杉矶J.）、国家健康和医学研究理事会创意赠款（APP2003904 - L.A.J.）和悉尼大学工程学院启动基金和主要设备计划（L.A.J.）。李宁·阿诺德·朱是澳大利亚研究理事会DECRA研究员（DE190100609）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
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