Summary
هنا، نقدم بروتوكولا لتحليل البنية الفوقية للخلايا العملاقة في الموقع باستخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM). يتم جمع نخاع عظم مورين، ثابتة، جزءا لا يتجزأ من راتنج الايبوكسي وقطع في أقسام ultrathin. بعد تلطيخ التباين ، لوحظ نخاع العظم تحت مجهر TEM عند 120 كيلو فولت.
Abstract
يحدث التمايز ونضوج الخلايا الضخمة في ارتباط وثيق مع المكونات الخلوية وخارج الخلية لنخاع العظام. وتتميز هذه العمليات بالمظهر التدريجي للهياكل الأساسية في السيتوبلازم megakaryocyte مثل نواة متعددة الأضلاع وتعدد الأضلاع، وشبكة غشاء داخلي تسمى نظام غشاء الترسيم (DMS) وحبيبات كثيفة وألفا التي سيتم العثور عليها في الصفائح الدموية المتداولة. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول موحد للدراسة فوق الهيكلية في الموقع لخلايا مورين الضخمة باستخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM)، مما يسمح بتحديد الخصائص الرئيسية التي تحدد مرحلة نضجها وكثافتها الخلوية في نخاع العظام. يتم مسح نخاع العظم، ثابتة، المجففة في الإيثانول، جزءا لا يتجزأ من الراتنج البلاستيك، وشنت لتوليد المقاطع العرضية. يتم إعداد أقسام شبه رقيقة ورقيقة لملاحظات الهسهولوجية وTEM، على التوالي. يمكن استخدام هذه الطريقة لأي خلية نخاع العظم، في أي مرفق EM ولها ميزة استخدام أحجام عينة صغيرة مما يسمح لمزيج من عدة نهج التصوير على نفس الماوس.
Introduction
Megakaryocytes هي خلايا متعددة الأضلاع كبيرة متخصصة ، مترجمة في نخاع العظام ، مسؤولة عن إنتاج الصفائح الدموية1. أنها تنشأ من الخلايا الجذعية الدموية من خلال عملية نضوج معقدة، خلالها السلائف megakaryocyte زيادة تدريجيا في الحجم، في حين تمر تغييرات مورفولوجية المصاحبة واسعة النطاق في السيتوبلازم والنواة2. أثناء النضج ، تطور الخلايا الضخمة عددا من العناصر الهيكلية المميزة بما في ذلك: نواة متعددة الأضلاع ، وثقب الغشاء السطحي الذي يشكل نظام غشاء الترسيم (DMS) ، ومنطقة محيطية خالية من العضيات محاطة بالشبكة الخلوية القائمة على actin ، والعديد من العضيات بما في ذلك حبيبات α ، والحبيبات الكثيفة ، والليسوسومات ، والعديد من مجمعات غولجي. على مستوى البنية الفائقة ، لوحظ تعديل كبير هو تقسيم السيتوبلازمية إلى مناطق منفصلة محددة بواسطة DMS3. هذا العرض الواسع من الأغشية سوف يغذي تمديد العمليات السيتوبلازمية الطويلة في المرحلة الأولية من إنتاج الصفائح الدموية ، والتي إعادة تشكيلها بعد ذلك إلى الصفائح الدموية داخل الدورة الدموية. أي عيب أثناء التمايز megakaryocyte والنضج يمكن أن تؤثر على إنتاج الصفائح الدموية من حيث عدد الصفائح الدموية و / أو وظيفة الصفائح الدموية.
طبقة رقيقة انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) وقد تم نهج التصوير المفضل لعقود توفير ultrastructure عالية الجودة من megakaryocytes التي شكلت فهمنا لعلم وظائف الأعضاء من خثار4،5. تركز هذه الورقة على طريقة TEM موحدة تسمح بالتقاط عملية التكوين الحيوي للصفائح الدموية التي تحدث في الموقع داخل البيئة الدقيقة لنخاع العظم الأصلي ، والتي يمكن أن تكون أيضا بمثابة أساس لتحليل أي نوع من خلايا نخاع العظم. نحن نقدم أمثلة فائقة البنية لتطوير الخلايا الضخمة من غير ناضجة إلى ناضجة تماما ، والتي تمتد العمليات السيتوبلازمية في دوران الأوعية الدقيقة من الجيوبالأنفية 6. كما نقوم بوصف إجراء سهل لقياس مراحل نضوج الخلايا الضخمة المختلفة، مع إرشادك إلى قدرة إنتاج التجدد والصفائح الدموية لنخاع العظم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمعايير الأوروبية 2010/63/EU ولجنة CREMEAS المعنية بأخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة لجامعة ستراسبورغ (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). يتم عرض البروتوكول تخطيطيا في الشكل 1.
1. جمع نخاع العظم والتثبيت ( الشكل 1A)
تنبيه: يشمل هذا الإجراء المواد المسببة للسرطان، والطفرات، و/أو السامة، ويتم تنفيذه تحت غطاء للاستخراج الكيميائي. ارتداء معدات الحماية المناسبة مثل القفازات والنظارات الحماية.
- إعداد الحل التثبيتي الذي يتكون من 2.5٪ غلوتارارالدهيد في المخزن المؤقت cacodylate (انظر الملف التكميلي).
- جمع نخاع العظم
- استخدام الفئران C57BL/6 الكبار من أي من الجنسين 12-18 أسابيع من العمر. قتل الفئران عن طريق اختناقثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم.
- مع زوج من مقص رقيقة، وقطع الجلد حول الفخذ واستخدام ملاقط لتقشير الجلد قبالة. إزالة أقصى مخلب ثم قطع بين الورك والفخذ. فصل الساق من عظم الفخذ عن طريق قطع في مفصلية الركبة وإزالة الأنسجة الملتصقة على الساق وعظم الفخذ باستخدام مشرط.
- إزالة epiphyses مع شفرة حلاقة حادة. أثناء الإمساك بعظم الفخذ بالملاقط، استخدم حقنة سعة 5 مل مليئة بحاجز cacodylate مع إبرة 21 G لغسل نخاع العظم في أنبوب 15 مل مملوء بحاجز كاكوديلات 2 مل. للقيام بذلك، أدخل شطبة الإبرة في فتحة نخاع العظم واضغط ببطء على المكبس حتى يتم طرد النخاع.
- تثبيت نخاع العظم عن طريق الغمر السريع في التثبيت.
- مباشرة بعد التنظيف، استخدم ماصة بلاستيكية لنقل أسطوانة نخاع العظم إلى 1 مل من محلول تثبيت الغلوتاراالدهيد الطازج (الذي تم إعداده سابقا في 1.1) لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: للحفاظ على الأنسجة، تأكد من اكتمال العملية بأكملها، من تشريح العظام إلى خطوة التثبيت، في أقل من 10 دقائق. لتثبيت, تأكد من أن الحل التثبيت في درجة حرارة الغرفة لتجنب صدمة الحرارة.
- مباشرة بعد التنظيف، استخدم ماصة بلاستيكية لنقل أسطوانة نخاع العظم إلى 1 مل من محلول تثبيت الغلوتاراالدهيد الطازج (الذي تم إعداده سابقا في 1.1) لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. تضمين نخاع العظم في الآغروز
ملاحظة: أنسجة النخاع ليست متماسكة بما فيه الكفاية للحفاظ على سلامتها خلال خطوات الغسيل المختلفة ويمكن بسهولة فقدان المواد. للتغلب على هذه المشكلة ، يتم تغطية النخاع في هلام من أجار قبل الجفاف.
- إعداد الحل agarose كما هو موضح في الملف التكميلي.
- غسل النخاع الثابت من القسم 1.3 في العازلة cacodylate ونقله بعناية إلى شريحة زجاجية باستخدام ماصة بلاستيكية. باستخدام ماصة دافئة، وتطبيق بسرعة قطرة من 2٪ أجار السائل إلى اسطوانة نخاع العظام.
ملاحظة: أجار يقوي بسرعة أثناء التبريد. لضمان تغطية متجانسة لنخاع العظام ، يجب الحفاظ على محلول أجار دافئا حتى يتم إيداعه على الشريحة. - بسرعة وضع الشريحة بسرعة على الجليد حتى يتماسك أجار (1-2 دقيقة).
- تحت المجهر، استخدم شفرة حلاقة حادة لقطع وتخلص من أطراف أسطوانة نخاع العظم بسبب ضغط الأنسجة المحتمل في هذه المناطق. نقل كتل النخاع في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل التي تحتوي على 1 مل من العازلة cacodylate.
3. تضمين نخاع العظم في الراتنج
تنبيه: مكونات الراتنج سامة. بعضها مسرطن ويجب التعامل معها بعناية تحت غطاء محرك السيارة استخراج المواد الكيميائية. استخدام معدات الحماية المناسبة مثل القفازات ونظارات الحماية. بيروكسيد أوزميوم شديد التطاير في درجة حرارة الغرفة وأبخرته ضارة جدا للعيون والأنف والحنجرة. قبل التخلص منها، يجب تحييد 2٪ من التيتروكسيد أوسميوم بإضافة ضعف حجمها من الزيت النباتي.
- إعداد راتنج الايبوكسي كما هو موضح في الملف التكميلي.
- تضمين الراتنج
ملاحظة: احتفظ بالعينات في نفس أنابيب الطرد المركزي الدقيق أثناء الحضانات في الحمامات المتعاقبة من الأوسميوم وخلات الأورانيل والإيثانول. يستنشق الناطور مع ماصة باستور. حجم الحل المستخدم لكل حمام يجب أن يساوي على الأقل 10x حجم العينة.- بعد إصلاح الكتل مع 1٪ أوسميوم في العازلة cacodylate لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية، وغسل مرة واحدة في العازلة cacodylate ثم مرة واحدة في الماء المقطر.
- وصمة عار مع خلات أورانيل 4٪ في الماء المقطر لمدة 1 ساعة، وغسل مرتين في الماء المقطر.
- الجفاف من خلال سلسلة متدرج من الإيثانول في الماء المقطر: 4 مرات في الإيثانول 75٪ لمدة 5 دقائق، تليها 3 مرات في الإيثانول 95٪ لمدة 20 دقيقة ثم 3 مرات في الإيثانول 100٪ لمدة 20 دقيقة. في هذه الخطوة، خذ حقنة واحدة من راتنج الايبوكسي من الثلاجة.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة ساعة واحدة. - للحصول على تسلل موحد وبلمرة من راتنج الايبوكسي داخل النخاع، واحتضان أول كتل في 2 حمامات متتالية من أكسيد البروبيلين لمدة 15 دقيقة.
- إضافة خليط 1:1 من أكسيد البروبيلين 100٪ والراتنج الايبوكسي واحتضان لمدة 1 ساعة. ضع العينات على شاكر دوار بطيء في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 100٪ راتنج الايبوكسي ترك العينة لاحتضان بين عشية وضحاها تحت التحريض.
- إضافة 100٪ راتنج الايبوكسي لحضانة 2 ساعة، لا تزال تحت التحريض.
- تحت المجهر، ضع كتل النخاع في قوالب السيليكون المسطحة. عينات موجهة للسماح بالقسم المستعرض اللاحق لنخاع العظم بأكمله. ملء قوالب مع راتنج الايبوكسي ووضعها في 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
ملاحظة: تتم تصفية جميع المحاليل (باستثناء الإيثانول وأكسيد البروبيلين) من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لتجنب تلوث العينات. لضمان البلمرة الكافية للراتنج، تجنب الفقاعات أثناء ملء القوالب.
4. تقسيم Ultrathin (الشكل 1B)
ملاحظة: يتطلب انتقال EM أقسام الأنسجة الرقيقة التي يمكن أن تمر عبر الإلكترونات توليد صورة الإسقاط من الداخل من الخلايا، وهيكل، وتنظيم العضيات الداخلية (الحبيبات، reticulum endoplasmic، غولجي) وترتيب أغشية الخلايا داخل الخلايا.
- قم بتركيب كتلة العينة في دعم microtome فائقة. ضعه على حامل العينة تقليم العينات في 45° من أجل إزالة فائض من الراتنج حول الأنسجة مع الماس الدورية أو قطع الطحن التنغستن.
- قم بتركيب العينات على الصفن الفائق مع شفرة سكين ماسية مجهزة بخزان مياه. قطع المقاطع العرضية من 500 نانومتر و 100 نانومتر سمك للتحليلات الهستورية وTEM، على التوالي. جمع المقاطع العائمة على سطح الماء مع حلقة.
- إيداع مقطع 500 نانومتر سميكة على شريحة زجاجية و 100 نانومتر أقسام سميكة على 200 شبكة رقيقة شريط شبكات النحاس مع مرشح ورقة تحت. إعداد خمس شبكات لشرط واحد: وصمة عار شبكتين أولا والحفاظ على الشبكات الثلاث المتبقية كدعم إذا لزم الأمر.
5. Toluidine الأزرق تلطيخ لعلم الأنسجة
ملاحظة: أقسام تلطيخ لعلم النسيج مهم لثلاثة أسباب: 1) للتأكد من أن يتم قطع الأنسجة فعلا وليس الراتنج، 2) للتحقق من نوعية إدراج، و 3) لتقييم عينة النخاع بسرعة. إذا لم يكن هذا صحيحا، قطع أعمق في الكتلة.
- جفف الشرائح شبه الرقيقة على طبق حراري (60 درجة مئوية).
- إضافة تصفية 1٪ toluidine الأزرق / 1 ٪ بورات الصوديوم في الماء المقطر على الشرائح والحرارة على لوحة ساخنة (60 درجة مئوية) لمدة 1-2 دقيقة. غسل الشرائح بالماء المقطر والسماح لها الجافة على لوحة الحرارة.
- جبل المقاطع على coverlips مع قطرة من بولي (بوتيل ميثاكريلات-ميثيل ميثاكريلات) تركيب المتوسطة وفحص تحت المجهر الخفيف.
6. تلطيخ المعادن الثقيلة للمراقبة TEM (الشكل 1C)
ملاحظة: بالنسبة للتباين، يتم عكس الجانب العلوي من الشبكات على قطرات 100 ميكرولتر من كل حمام متتابع مع حلقة. قبل الاستخدام، يتم تصفية كل حل 0.22 ميكرومتر. قم بإزالة فائض السائل بين كل حمام عن طريق الاتصال بلطف بجانب الشبكة على ورقة تصفية.
- وصمة عار مع خلات أورانيل 4٪ في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
- يغسل 3 مرات في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
- وصمة عار مع سترات الرصاص لمدة 3 دقائق.
- يغسل 3 مرات في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
- قم بإيداع الشبكات من الجانب السفلي ملامسة لورق التصفية للسماح لها بالجفاف.
ملاحظة: تتفاعل المعادن الثقيلة في وجود ثاني أكسيد الكربون. لتقليل الرواسب، تجنب إزاحة الهواء أثناء التباين، لا تتكلم، حافظ على هدوء البيئة وأطفئ تكييف الهواء.
7. TEM (الشكل 1E)
ملاحظة: يتم إدخال المقاطع في مجهر TEM وفحصها عند 120 كيلو فولت.
- أولا فحص الأقسام في التكبير منخفضة (< 500x) لتقدير الجانب العام لإعداد (عدم وجود ثقب في الراتنج، طيات / ضغط في الأقسام، ويترسب بسبب تلطيخ).
- ثم فحص المقاطع في التكبير أعلى (~ 2000x السماح للتمييز بين مرحلة النضج). عد يدويا الخلايا الضخمة من كل مرحلة من مراحل النضج على أقسام عرضية كاملة (انظر النتائج التمثيلية حول كيفية تحديد بصريا كل مرحلة).
ملاحظة: يتم تعريف كل مربع من الشبكات كمنطقة للفحص (والتي تساوي 16000 ميكرومتر مربع ل 200 شبكة نحاسية شبكية). - لتقييم عدد الخلايا الضخمة، قم بتحديد المربعات التي يتم تغطيتها بالكامل بقسم فقط. للقيام بذلك، استخدم نموذجا يستند إلى فحص النطاقات. مراقبة مجموعة أولى من المربعات من أقصى القسم إلى آخر، ثم مجموعة أخرى بنفس الطريقة، الخ. باستخدام هذا الإجراء، الشاشة بشكل كامل ومنهجي كامل نخاع المقطع العرضي مربع بمربع.
- لكل مربع، يسجل عدد من المرحلة الأولى والثانية والثالثة megakaryocytes.
ملاحظة: مطلوب تكبيرات أعلى لتحليل الحبيبات، وتنظيم DMS، وحجم الأراضي السيتوبلازمية والنواة متعددة الأضلاع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أنسجة نخاع العظم
مراقبة النسيج الأزرق التولويدين نخاع العظم تحت المجهر الخفيف هو المفتاح لتحليل بسرعة بنية الأنسجة الشاملة من حيث مثل، ضغط الأنسجة، واستمرارية microvessel، وحجم وشكل megakaryocytes (الشكل 1D). يتم إجراؤه قبل أقسام فائقة لتحديد الحاجة إلى قطع أعمق في كتلة نخاع العظام. نظرا لحجمها العملاق والفصى النووي ، يمكن تصور الخلايا الضخمة الأكثر نضجا بسهولة بهدف 40x. وهذا يعطي نظرة عامة ممتازة وسريعة على كثافة الخلايا العملاقة الناضجة في الأنسجة وتوطينها النسبي للmicrovessels. ويمكن بالفعل الكشف عن حالات شاذة في انتشار الخلايا الضخمة ونضجها في مثل هذه الأقسام شبه الرقيقة.
البنية الفوقية لنخاع العظم
على أساس خصائص البنية الفائقة المتميزة ، تنقسم الخلايا العملاقة المورينية إلى 4 مراحل تمثل مراحل متتابعة في نضجها (الشكل 2A). المرحلة الأولى megakaryocytes هي 10-15 ميكرومتر في القطر مع نواة كبيرة تحتل معظم الخلية وتحتوي على الريبوسومات وفيرة و reticulum endoplasmic الخام. وجود مرحلة مبكرة يمكن الكشف عنها من DMS، ودعا قبل DMS، هو أيضا معيار رئيسي للتمييز بين المرحلة الأولى MKs في تحليل TEM3. في المرحلة الثانية من النضج ، يبدأ تكوين الحبيبات ويبدأ تطوير DMS. زيادة ميغاكاريوسيتس في الحجم، وقياس 15-25 ميكرومتر في القطر وتطوير الفصية النووية. المرحلة الناضجة الثالثة من الخلايا العملاقة هي خلايا عملاقة قطرها 25-50 ميكرومتر. السيتوبلازم يحتوي على DMS متطورة مع مناطق السيتوبلازمية محددة بوضوح ومنطقة المحيطية خالية من العضيات. في هذه المرحلة ، تقع النواة بشكل عام بشكل غريب الأطوار وتبدو غير منتظمة للغاية مع الكروماتين المكثف الموجود في الغشاء النووي. وتتميز الخطوة الأخيرة من قبل نواة عارية، وتسمى أيضا الخلايا النارية، وتتكون من نواة كبيرة محاطة غشاء البلازما بعد أن تم القضاء على الجزء الأكبر من السيتوبلازم. في الفئران البرية C57BL/6 ، يتكون نخاع العظم من حوالي 8٪ المرحلة الأولى ، 20٪ المرحلة الثانية ، 71٪ المرحلة الثالثة من الخلايا الضخمة < 1٪ الخلايا النارية. يتراوح متوسط عدد الخلايا الضخمة بين 1.7 و 2.2 خلية لكل مربع. يسمح هذا التصنيف التعسفي بمراقبة عملية مستمرة من تمايز الخلايا واكتشاف شذوذها المحتمل.
بجانب هذه المراحل الكلاسيكية من النضج ، تسمح مراقبة الخلايا الضخمة الثابتة في نخاع العظام بتحليل سلسلة الأحداث التي تحدث مع تفاعل الخلايا الضخمة مع الجدار الجيبي (الشكل 2B). وكثيرا ما لوحظت الخلايا الضخمة في اتصال مع الخلايا البطانية في أقسام رقيقة. في بعض الأحيان يلاحظ المرء megakaryocytes تشكيل نتوءات الغازية قصيرة اختراق بطانة الرحم أو توسيع إسقاط كبير من السيتوبلازم في التجويف الجيوب الأنفية7،8. بشكل ملحوظ ، هذه العمليات السيتوبلازمية داخل الأوعية الدموية تعرض أحجاما وأطوالا وأقطارا متغيرة ، مما يوضح إعادة عرض الصفائح الدموية التدريجية في الدورة الدموية. الصفائح الدموية الموجودة بالفعل في الدورة الدموية العامة ، وجود شكل discoid التي تحتفظ بها لفائف microtubule محيطي ، هي أيضا مرئية في تجويف الجيوب الأنفية. هذا المورفولوجيا النموذجية للصفائح الدموية يدل على التثبيت الصحيح للعينة.
التحليل المجهري للإلكترون الإرسال لديه مستوى الدقة المطلوبة لتصور التفاصيل فائقة البنية، مثل الفصوص النووية، والتنظيم المكاني ل DMS والحبيبات من حيث الحجم والشكل والتوزيع. الشكل 2C هو مثال على المنطقة المحيطة بالنوى في المرحلة الثالثة من الخلايا الضخمة التي تظهر وجود حبيبات α ، غولجي سيسترناي ، الميتوكوندريا ، و الشبكية الإنتوبلازمية. الجدير بالذكر أيضا في الشكل 2C هو جسم متعدد المركبات، والذي يمثل مرحلة وسيطة في تشكيل حبيبات ألفا وكثيفة، تحتوي على مضاعفات إكسوسومات قياس أقل من 200 ألف في القطر9،10. وأخيرا، يتيح المجهر الإلكتروني الإرسال لتصور العدلات وغيرها من الخلايا الدموية الموجودة داخل megakaryocytes، (الشكل 2D) بعد عملية غير شائعة تسمى emperipolesis حيث تخترق الخلية خلية حية أخرى11. هذه العملية ، التي تتعلق بنسبة 4 ٪ من الخلايا الضخمة في حالة فسيولوجية طبيعية ، يمكن زيادتها بشكل كبير في بعض الحالات المرضية12.
الشكل 1:رسم تخطيطي للإعداد التجريبي. (أ) إجراء تضمين نخاع العظم. يتم مسح نخاع العظم وإصلاحه عن طريق الغمر السريع في محلول الجلوتارالدهيد. توضح الصورة المظهر النموذجي لاسطوانة نخاع العظم بعد التنظيف. بعد تثبيت 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، يحيط النخاع في الآغروز ، بعد إصلاحه في tetroxide osmium واحتضانه في خلات أورانيل. ثم يتم شطف الأنسجة في العازلة، المجففة في سلسلة من الإيثانول متدرج، واحتضانها في أكسيد البروبيلين وتسللت مع راتنج الايبوكسي. (ب) كتل نخاع العظم تقسيم. يتم تركيب نخاع العظم المدمج على حامل البروتينات الفائقة، ويتم تشذيبه عند 45 درجة وقطعه إما في أقسام شبه رقيقة (500 نانومتر) أو رقيقة (100 نانومتر). بالنسبة للدراسات البنية الفائقة ، يتم التقاط الأقسام العائمة بحلقة وإيداعها على الشبكات مع فلتر ورق تحتها. (ج) تلطيخ التباين لملاحظات TEM. يتم عكس الشبكات على قطرات خلات أورانيل ، وغسلها على قطرات الماء المقطر واحتضانها على سترات الرصاص قبل تشغيل آخر من الغسيل. بعد التجفيف (الجانب العلوي مع الأقسام) ، تكون العينات جاهزة لفحصها تحت TEM. (د) الأنسجة من قسم نخاع الفخذ الماوس ملطخة الأزرق toluidine. تتوافق الخلايا العملاقة مع الخلايا الضخمة الناضجة (1) ، وبعضها على اتصال مع الجيوب الأنفية (2). تلتقي الجيوب الأنفية على وريد الجيوب الأنفية المركزي الكبير (3). شريط: 20 ميكرومتر. Inset: المظهر الطبيعي للخلايا العملاقة ناضجة في التكبير 40x. (E) صورة TEM التمثيلية لقسم نخاع العظم عند التكبير المنخفض. الخلايا معبأة بإحكام مع مساحة صغيرة خارج الخلية. كل مربع شبكة من المقطع يتم ملاحظته من طرف إلى آخر باتباع المسار المخطط السهمي (الأسهم الحمراء). شريط: 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ممثل في صور الموقع من megakaryocytes ultrastructure. (أ) مراحل النضج المميزة من نوع البرية megakaryocytes. وتصنف الخلايا الضخمة في أربع مراحل نضوج: المرحلة الأولى، وهي خلية قطرها 10-15 ميكرومتر مع نواة كبيرة؛ المرحلة الأولى، خلية قطرها 10-15 ميكرومتر مع نواة كبيرة؛ المرحلة الأولى، خلية قطرها 10-15 ميكرومتر مع نواة كبيرة. المرحلة الثانية، وهي خلية قطرها 15-30 ميكرومتر تحتوي على DMS قيد التطوير؛ المرحلة الثالثة، خلية 30-50 ميكرومتر تحتوي على نظام غشاء ترسيم متطور (DMS) يحدد الأراضي السيتوبلازمية ووجود منطقة محيطية خالية من العضيات. تتوافق الخلايا النارية مع النواة العارية المتعددة الأضلاع المتبقية في نخاع العظام بعد التمديد السيتوبلازمي الكامل. القضبان: 10 ميكرومتر(ب)تفاعلات الخلايا البطانية Megakaryocyte والعمليات السيتوبلازمية داخل الأوعية الدموية. (1) يتم تطبيق المنطقة الطرفية (PZ) من megakaryocyte عن كثب إلى السطح المائل من بطانة الرحم الجيبية. '2' خلية كريات عملاقة تشكل نتوءات غازية قصيرة تخترق عمق الطبقة البطانية (رؤوس الأسهم). '3' v تشير الأسهم إلى العمليات السيتوبلازمية للخلايا الضخمة ذات الأقطار المختلفة ، وبعضها كبير جدا ولها منطقة محيطية قد تمثل شظايا دخلت للتو مجرى الدم. '6' صفيحة نمطية من الديسكويد (P) لوحظت في تجويف الجيوب الأنفية. في كل ميكروجراف، يشير الخط الأحمر إلى الجانب الإنارة من الحاجز البطاني ويشير النجم إلى التجويف الجيبي. القضبان: 2 ميكرومتر (C) تكبيرات أعلى للمنطقة المحيطة بالنوى من megakaryocyte ناضجة. α، حبيبة ألفا. rer, إعادة إعادة التشنج التشنجى الخام; G, غولجي; MVB, جسم متعدد المركبات; م، الميتوكوندريا. شريط: 0.5 ميكرومتر(D) مثال على كريات الدم الضخمة التي تظهر emperipolesis. العدلات الغارقة يبدو غير قابل للتغيير من الناحية الشكلية من خلال التفاعل مع الخلايا العملاقة. شريط: 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملف تكميلي: إعداد الكواشف. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفحص المباشر للخلايا الضخمة في بيئتها الأصلية أمر ضروري لفهم الخلايا الضخمة وتشكيل الصفائح الدموية. في هذه المخطوطة، نقدم طريقة المجهر الإلكتروني انتقال الجمع بين مسح نخاع العظم والتثبيت عن طريق الغمر، مما يسمح لتشريح في الموقع خصائص مورفولوجيا العملية برمتها من مورفوجينيسيس megakaryocyte تجري في نخاع العظام.
يعد مسح نخاع العظم خطوة حاسمة في هذه الطريقة ، حيث يعتمد نجاح التنظيف عالي الجودة على ممارسة وتدريب المشغل. على الرغم من حساسية, مسح نخاع العظام هو أفضل وسيلة لتجنب إزالة العظام المعدنية, الأمر الذي يتطلب عادة 2-أسبوع EDTA العلاج لشارات كاملة المرتبطة القطع الأثرية الهامة على مورفولوجيا megakaryocyte. بالإضافة إلى ذلك ، ميزة رئيسية لجمع نخاع العظم غير المثبتة كاملة من عظم الساق وعظم الفخذ هو القدرة على الجمع بين العديد من نهج التصوير لنفس الماوس. في الممارسة العملية ، مطلوب فقط نخاع عظمي واحد للدراسة فوق الهيكلية ، والعينات الثلاث الأخرى متاحة للتحليلات التكميلية. نخاع العظم الثاني يمكن أن تستخدم بعد ذلك لإعداد explants نخاع العظم الطازجة، لدراسة في الوقت الحقيقي ديناميات تشكيل البربليت من megakaryocytes الأصلي6. عادة ما يتم تصميم العينة الثالثة لدراسات الاحتواء المناعي على أقسام سميكة ، وتوفير التصوير ثلاثي الأبعاد وتوزيع الخلايا العملاقة داخل بيئتها الطبيعية. يمكن تجميد العينة الأخيرة وتخزينها لمزيد من الدراسات عن طريق المجهر الإلكتروني المناعي ، حيث يتم التحقيق في توطين البروتينات دون الخلوية بدقة عالية4. وتوفر طرق التصوير المشتركة هذه، إلى جانب توافر الحذف/الطفرة المستهدفة للجينات في الفأر، وسيلة هامة لتحديد الدور البيولوجي لبروتين معين في الجلطات الدموية في الموقع. ومع ذلك ، تجدر الإشارة هنا إلى أن أحد قيود هذه الطريقة هو سحب الصرع اللازم لطرد النخاع. ومن المعروف أن Epiphyses هي مجالات هامة لالتهاب الدم ، وبالتالي فإن إزالتها تعيق أي إمكانية لتحليل الخلايا الجذعية الدموية والمراحل الأولية من المشاركة13. وهناك قيد آخر هو أن السلف من megakaryocytes قبل مرحلة غير ناضجة لا يمكن تحديد لي لأن هذه الخلايا ليس لديها ميزات محددة ultrastructural. للتغلب على هذا القيد، يمكن استخدام نهج em immunogold.
الخطوة الثانية الهامة من هذه الطريقة هي تثبيت نخاع العظم عن طريق الغمر. عند تنفيذها في ظل الظروف الموصوفة هنا ، أي التثبيت مباشرة بعد طرد أسطوانة نخاع العظم المدمجة ، فإن لها المزايا التالية: (1) أنها سريعة وسهلة الأداء ، (2) تحافظ على بنية فائقة قريبة من تلك التي لوحظت بعد التثبيت عن طريق التشويش6، و (3) تحافظ على عمليات megakaryocyte حرة والصفائح الدموية في مجرى الدم الجيبي التي يتم مسحها / فقدانها بعد اليرطان. مع هذه التقنية من الممكن التحقيق في دخول megakaryocytes في الدورة الدموية sinusoidal وتوصيف جميع الأشكال الوسيطة من العمليات السيتوبلازمية التي تنشأ الصفائح الدموية8. وتمشيا مع هذا، فقد أفيد مؤخرا أن نتوءات كبيرة داخل من megakaryocytes في الجسم الحي هي متميزة هيكليا من التمديدات رقيقة شكلتها megakaryocytes في المختبر،مع ترتيب مختلف لا سيما من microtubules7. وبالمثل، أظهرنا مؤخرا أن الآلية التي تحكم تكوين الصفائح الدموية في الجسم الحي تختلف عن تلك التي تم تحديدها في المختبر14.
يتم التعرف على الاختلافات الهيكلية الفائقة الهامة بشكل متزايد بين الخلايا العملاقة الأصلية المستزرعة في المختبر وفي الجسم الحي ، مما يؤكد الحاجة إلى البيئة الدقيقة لنخاع العظم لتمايز / نضوج الخلايا الضخمة الكاملة. بعد الجمع بين مسح نخاع العظم والتثبيت عن طريق الغمر الموصوف في هذه المقالة ، لا يزال المجهر الإلكتروني التقليدي ناقل الحركة أداة لا تقدر بثمن لدراسة بيولوجيا الخلايا الضخمة وتكوين الصفائح الدموية ، في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح يعلنون عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا فابيان بروامر وجان إيف رينكل وديفيد هوفمان ومونيك فرويند على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل الرابطة الأوروبية للتنمية الإقليمية والاتحاد الأوروبي من خلال الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية ومنظمة المنحة ANR-17-CE14-0001-01 إلى H.D.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
