Summary
Her presenterer vi en protokoll for å analysere ultrastruktur av megakaryocyttene in situ ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Murine benmarger samles, festes, legges inn i epoksyharpiks og kuttes i ultratynne seksjoner. Etter kontrastfarging observeres benmargen under et TEM-mikroskop ved 120 kV.
Abstract
Differensiering og modning av megakaryocytter forekommer i nær tilknytning til de cellulære og ekstracellulære komponentene i benmargen. Disse prosessene er preget av gradvis utseende av essensielle strukturer i megakaryocytt cytoplasma som en polyploid og polylobulert kjerne, et internt membrannettverk kalt avgrensningsmembransystem (DMS) og de tette og alfagranulatene som finnes i sirkulerende blodplater. I denne artikkelen beskriver vi en standardisert protokoll for in situ ultrastrukturell studie av murine megakaryocytter ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM), noe som muliggjør identifisering av nøkkelegenskaper som definerer modningsstadiet og cellulær tetthet i benmargen. Benmarger skylles, festes, dehydreres i etanol, innebygd i plastharpiks og monteres for å generere tverrsnitt. Semitynne og tynne seksjoner er forberedt på henholdsvis histologiske og TEM observasjoner. Denne metoden kan brukes til en hvilken som helst benmargcelle, i ethvert EM-anlegg og har fordelen av å bruke små prøvestørrelser som tillater kombinasjonen av flere bildemetoder på samme mus.
Introduction
Megakaryocytter er spesialiserte store polyploide celler, lokalisert i benmargen, ansvarlig for blodplateproduksjon1. De stammer fra hematopoietiske stamceller gjennom en intrikat modningsprosess, hvor megakaryocyttforløpere gradvis øker i størrelse, mens de gjennomgår omfattende samtidige morfologiske endringer i cytoplasma og kjerne2. Under modning utvikler megakaryocytter en rekke skilles strukturelle elementer, inkludert: en polylobulert kjerne, invaginasjoner av overflatemembranen som danner avgrensningsmembransystemet (DMS), en perifer sone blottet for organeller omgitt av aktinbaserte cytoskeletalnettverk og mange organeller, inkludert α granulater, tette granulater, lysosomer og flere Golgi-komplekser. På ultrastrukturelt nivå er en stor modifikasjon observert den cytoplasmatiske oppdelingen i diskrete områder avgrenset av DMS3. Denne omfattende tilførselen av membraner vil gi drivstoff til forlengelsen av lange cytoplasmatiske prosesser i den første fasen av blodplateproduksjonen, som deretter vil omdannes til blodplater inne i sirkulasjonen. Eventuelle feil under megakaryocyttdifferensiering og modning kan påvirke blodplateproduksjonen når det gjelder blodplatetelling og / eller blodplatefunksjon.
Tynn lagoverføring elektronmikroskopi (TEM) har vært den valgte bildemetoden i flere tiår som gir ultrastruktur av megakaryocytter av høy kvalitet som har formet vår forståelse av fysiologien til trombopoiesis4,5. Dette dokumentet fokuserer på en standardisert TEM-metode som gjør det mulig å fange prosessen med blodplatebiogenese som forekommer in situ innenfor det opprinnelige benmargsmikromiljøet, som også kan tjene som grunnlag for å analysere hvilken som helst benmargscelletype. Vi gir ultrastrukturelle eksempler på utvikling av megakaryocytter fra umodne til fullt modne, som utvider cytoplasmatiske prosesser inn i mikrosirkulasjonen av bihuler6. Vi beskriver også en enkel prosedyre for å kvantifisere de forskjellige megakaryocyttmodningsstadiene, instruere på regenererings- og blodplateproduksjonskapasiteten til benmargen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med europeiske standarder 2010/63/EU og CREMEAS-komiteen for etikk for dyreforsøk ved Universitetet i Strasbourg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Protokollen vises skjematisk i figur 1.
1. Benmargssamling og fiksering ( Figur 1A)
FORSIKTIG: Denne prosedyren inkluderer kreftfremkallende, mutagene og/eller giftige stoffer og utføres under en kjemisk ekstraksjonshette. Bruk egnet verneutstyr som hansker og beskyttelsesbriller.
- Klargjør den fikseringsløsningen som består av 2,5 % glutaraldehyd i kaktokylatbuffer (se Tilleggsfil).
- Benmargssamling
- Bruk voksne C57BL/6 mus av begge kjønn 12-18 uker. Euthanize musene ved CO2 kvelning og Cervical dislokasjon.
- Med en tynn saks, kutt huden rundt låret og bruk pinsett for å skrelle huden av. Fjern ekstremiteten til poten og kutt deretter mellom hoften og låret. Løsne tibia fra lårbenet ved å kutte ved kneet artikulasjon og fjerne tilhengervev på tibias og lårben ved hjelp av en skalpell.
- Fjern epifysene med et skarpt barberblad. Mens du holder lårbenet med pinsett, bruk en 5 ml sprøyte fylt med kaktocylatbuffer med en 21 G nål for å skylle benmargen inn i et 15 ml rør fylt med 2 ml kaktocylatbuffer. For å gjøre dette, sett nålens skråkant inn i benmargsåpningen og trykk stempelet sakte til margen er utvist.
- Benmargsfiksering ved rask nedsenking i fixative.
- Umiddelbart etter spyling, bruk en plastpipette for å overføre benmargsylinderen til 1 ml fersk glutaraldehydfiksiv løsning (tidligere fremstilt i 1,1) i 60 minutter ved romtemperatur.
MERK: For å bevare vevet må du sørge for at hele prosessen, fra benavhandling til fikseringstrinn, fullføres på mindre enn 10 minutter. For fiksering, sørg for at fikseringsløsningen er ved romtemperatur for å unngå varmesjokk.
- Umiddelbart etter spyling, bruk en plastpipette for å overføre benmargsylinderen til 1 ml fersk glutaraldehydfiksiv løsning (tidligere fremstilt i 1,1) i 60 minutter ved romtemperatur.
2. Innbygging av benmarg i agarose
MERK: Margvev er ikke tilstrekkelig sammenhengende for å opprettholde sin integritet under de forskjellige vasketrinnene, og materialet kan lett gå tapt. For å overvinne dette problemet er margen dekket av en gel av agar før dehydrering.
- Forbered agaroseløsningen som beskrevet i tilleggsfilen.
- Vask den faste margen fra avsnitt 1.3 i kaktocylatbufferen og overfør den forsiktig til et glasssklie ved hjelp av en plastpipette. Bruk en varm pipette, bruk raskt en dråpe 2% flytende agar til benmargsylinderen.
MERK: Agaren størkner raskt under kjøling. For å sikre et homogent belegg av benmargen, må agaroppløsningen holdes varm til den er avsatt på lysbildet. - Plasser skredet raskt på is til agaren størkner (1-2 min).
- Under et mikroskop, bruk et skarpt barberblad for å kutte og kaste ekstremitetene til benmargsylinderen på grunn av mulig vevskompresjon i disse områdene. Overfør margblokkene i 1,5 ml mikrocentrifugerør som inneholder 1 ml kaktocylatbuffer.
3. Innebygging av benmarg i harpiks
FORSIKTIG: Harpikskomponenter er giftige; noen er kreftfremkallende og må håndteres med forsiktighet under en kjemisk ekstraksjonshette. Bruk egnet verneutstyr som hansker og beskyttelsesbriller. Osmium tetroxide er svært flyktig ved romtemperatur og dampene er svært skadelige for øyne, nese og hals. Før det kastes, må 2% osmium tetroxide nøytraliseres ved å legge til dobbelt så mye vegetabilsk olje.
- Forbered epoksyharpiksen som beskrevet i tilleggsfilen.
- Innebygging av harpiks
MERK: Oppbevar prøvene i de samme mikrosenterrørene under inkubasjoner i påfølgende bad av osmium, uranylacetat og etanol. Aspirer supernatantene med en Pasteur pipette. Volumet av løsning som brukes til hvert bad må være lik minst 10 ganger volumet av prøven.- Etterfiks blokkene med 1% osmium i kaktocylatbuffer i 1 t ved 4 °C, vask en gang i kaktolylatbuffer og deretter en gang i destillert vann.
- Flekk med 4% uranylacetat i destillert vann i 1 time, vask to ganger i destillert vann.
- Dehydrer gjennom en gradert serie etanol i destillert vann: 4 ganger i 75% etanol i 5 min, etterfulgt av 3 ganger i 95% etanol i 20 min og deretter 3 ganger i 100% etanol i 20 min. På dette trinnet, ta en sprøyte epoksyharpiks ut av fryseren.
MERK: Protokollen kan settes på pause i 100 % etanol i 1 time. - For å oppnå jevn infiltrasjon og polymerisering av epoksyharpiks inne i margen, inkuber først blokkene i 2 påfølgende bad av propylenoksid i 15 minutter.
- Tilsett en 1:1 blanding av 100% propylenoksid og epoksyharpiks og inkuber i 1 time. Plasser prøvene på en langsom roterende shaker ved romtemperatur.
- Tilsett 100% epoksyharpiks forlater prøven for inkubering over natten under agitasjon.
- Tilsett 100% epoksyharpiks for 2 timers inkubasjon, fortsatt under agitasjon.
- Under et mikroskop, plasser margblokkene i flate silikonformer. Orienter prøver for å tillate etterfølgende tverrgående seksjonering av hele benmargen. Fyll formene med epoksyharpiks og legg dem ved 60 °C i 48 timer.
MERK: Alle løsninger (unntatt etanol og propylenoksid) filtreres gjennom 0,22 μm filter for å unngå prøveforurensning. For å sikre tilstrekkelig polymerisering av harpiksen, unngå bobler mens du fyller formene.
4. Ultrathin seksjonering (Figur 1B)
MERK: Overføring EM krever tynne vevsseksjoner der elektroner kan passere og generere et projeksjonsbilde av det indre av celler, struktur og organisering av indre organeller (granulater, endoplasmisk retikulum, Golgi) og arrangementet av intracellulære cellemembraner.
- Monter prøveblokken i en ultramikrotomstøtte. Sett den på prøveholderen. Trim prøvene ved 45° for å fjerne overskuddet av harpiks rundt vevet med en roterende diamant eller wolframfreser.
- Monter prøvene på ultramikrotomet med et diamantknivblad utstyrt med en vanntank. Klipp tverrgående seksjoner på henholdsvis 500 nm og 100 nm tykkelse for histologiske og TEM-analyser. Samle flytende seksjoner på vannoverflaten med en løkke.
- Deponer den 500 nm tykke delen på en glasssklie og 100 nm tykke seksjoner på 200 mesh tynnstang kobbergitter med et papirfilter under. Forbered fem rutenett for en betingelse: flekk to rutenett først og hold de tre gjenværende rutenettene som en sikkerhetskopi om nødvendig.
5. Toluidin blå farging for histologi
MERK: Fargesnitt for histologi er viktig av tre grunner: 1) for å sikre at vevet faktisk kuttes og ikke harpiksen, 2) for å sjekke kvaliteten på inkluderingen, og 3) for raskt å evaluere margprøven. Hvis dette ikke er riktig, kutt dypere i blokken.
- Tørk de halvtynne delene på en varmeplate (60 °C).
- Tilsett filtrert 1% toluidinblå/1 % natriumskjeder i destillert vann på skliene og varm på en kokeplate (60 °C) i 1-2 min. Vask lysbildene med destillert vann og la det tørke på varmeplaten.
- Monter seksjoner på deksler med en dråpe Poly(butyl methacrylate-co-metylmetakrylat) monteringsmedium og undersøk under et lett mikroskop.
6. Tungmetallfarging for TEM-observasjon (Figur 1C)
MERK: For kontrasten er oversiden av gitteret invertert på 100 μL dråper av hvert påfølgende bad med en løkke. Før bruk er hver løsning 0,22 μm filtrert. Fjern overflødig væske mellom hvert bad ved å kontakte rutenettsiden forsiktig på et filterpapir.
- Flekk med 4% uranylacetat i destillert vann i 5 min.
- Vask 3 ganger i destillert vann i 5 min.
- Flekk med blysitrat i 3 min.
- Vask 3 ganger i destillert vann i 5 min.
- Deponer gitteret på undersiden i kontakt med filterpapiret for å la dem tørke.
MERK: Tungmetaller reagerer i nærvær av karbondioksid. For å minimere utfellingene, unngå luftforskyvning under kontrasten, ikke snakk, hold miljøet rolig og slå av klimaanlegget.
7. TEM (figur 1E)
MERK: Seksjonene innføres i et TEM-mikroskop og undersøkes ved 120 kV.
- Undersøk først seksjonene ved lav forstørrelse (< 500x) for å sette pris på det generelle aspektet av preparatet (fravær av hull i harpiks, folder / kompresjon i seksjonene, utfellinger på grunn av farging).
- Undersøk deretter seksjonene ved høyere forstørrelse (~ 2000x slik at du kan skille modningsstadiet). Tell megakaryocyttene manuelt fra hvert modningsstadium over hele tverrgående seksjoner (se Representative Results om hvordan identifiserer hvert trinn visuelt).
MERK: Hver firkant i gitteret er definert som et undersøkelsesområde (som tilsvarer 16000 μm2 for 200 mesh kobbergitter). - For å vurdere antall megakaryocytter, kvantifisere bare rutene som er fullt dekket med en seksjon. For å gjøre dette, bruk en modell basert på screening av områder. Vær oppmerksom på et første utvalg av firkanter fra en ekstremitet i seksjonen til et annet, deretter et annet område på samme måte, etc. Ved hjelp av denne prosedyren, skjerm fullt ut og systematisk hele margen tverrgående seksjon kvadrat for kvadrat.
- For hver firkant, score antall stage I, II eller III megakaryocytter.
MERK: Høyere forstørrelser kreves for å analysere granulatene, DMS-organisasjonen, størrelsen på cytoplasmatiske territorier og den polylobuerte kjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Benmargs histologi
Observasjon av benmargen toluidinblå histologi under et lett mikroskop er nøkkelen til raskt å analysere den generelle vevsarkitekturen når det gjelder for eksempel vevskomprimering, mikrovesselkontinuitet og størrelsen og formen på megakaryocytter (Figur 1D). Det utføres før ultratynne seksjoner for å bestemme behovet for å kutte dypere i benmargsblokken. På grunn av deres gigantiske størrelse og kjernefysiske lobulering, kan de mer modne megakaryocyttene lett visualiseres med et 40x mål. Dette gir en utmerket og rask oversikt over tettheten av modne megakaryocytter i vevet og deres relative lokalisering til mikrovesselene. Uregelmessigheter i megakaryocyttproliferasjon og modning kunne allerede påvises i slike halvtynne seksjoner.
Benmarg ultrastruktur
På grunnlag av distinkte ultrastrukturelle egenskaper er murine megakaryocytter delt inn i 4 stadier som representerer sekvensielle stadier i modningen (Figur 2A). Trinn I megakaryocytter er 10-15 μm i diameter med en stor kjerne som opptar det meste av cellen og inneholder rikelig ribosomer og grov endoplasmisk retikulum. Tilstedeværelsen av det tidligste detekterbare stadiet i DMS, kalt pre-DMS, er også et nøkkelkriterium for å skille fase I MKs i TEM-analyse3. I trinn II av modning begynner granulatformasjonen og utviklingen av DMS initieres. Megakaryocytter øker i størrelse, måler 15-25 μm i diameter og utvikler kjernefysisk lobulering. Eldre stadium III megakaryocytter er gigantiske celler 25-50 μm i diameter. Deres cytoplasma inneholder en velutviklet DMS med klart definerte cytoplasmiske territorier og en perifer sone uten organeller. På dette stadiet er kjernen generelt plassert eksentrisk og virker svært uregelmessig med kondensert kromatin plassert ved atommembranen. Det siste trinnet er preget av en naken kjerne, også kalt pyrenocytt, bestående av en stor kjerne omgitt av en plasmamembran etter at hoveddelen av cytoplasma er eliminert. I vill type C57BL/6 mus består benmargen av ca. 8% trinn I, 20% trinn II, 71% trinn III megakaryocytter og < 1% pyrenocytter. Gjennomsnittlig antall megakaryocytter er mellom 1,7 og 2,2 celler per kvadrat. Denne vilkårlige klassifiseringen gjør det mulig å enkelt overvåke en kontinuerlig prosess med celledifferensiering og oppdage mulige uregelmessigheter.
Ved siden av disse klassiske stadiene av modning, gjør observasjon av faste megakaryocytter i benmargen det mulig å analysere serien av hendelser som forekommer når megakaryocytter samhandler med den sinusformede veggen (Figur 2B). Megakaryocytter i kontakt med endotelcellene observeres ofte i tynne seksjoner. Noen ganger observerer man megakaryocytter som danner korte invasive fremspring som trer inn i endotelet eller utvider stor projeksjon av cytoplasma i den sinusformede lumen7,8. Bemerkelsesverdig viser disse intravaskulære cytoplasmatiske prosessene variable størrelser, lengder og diametre, noe som illustrerer den progressive blodplateoppussingen i sirkulasjonen. Blodplater som allerede er til stede i den generelle sirkulasjonen, med en diskoid form opprettholdt av omkrets mikrotubule spoler, er også synlige i lumen av sinusoidene. Denne typiske morfologien til blodplater indikerer riktig fiksering av prøven.
Transmisjonselektronmikroskopi har oppløsningsnivået som kreves for å visualisere ultrastrukturelle detaljer, for eksempel kjernefysisk lobulering, romlig organisering av DMS og granulater når det gjelder størrelse, form og distribusjon. Figur 2C er et eksempel på den perinukære regionen i en stadium III megakaryocytt som viser tilstedeværelsen av α granulater, Golgi-cisternae, mitokondrier og endoplasmic retikulum. Også bemerkelsesverdig i figur 2C er en multivesicular kropp, som representerer et mellomliggende stadium i dannelsen av alfa og tette granulater, som inneholder multipler eksosomer som måler mindre enn 200 Å i diameter9,10. Til slutt gjør transmisjonselektronmikroskopi det mulig å visualisere nøytrofiler og andre hematopoietiske celler som er tilstede inne i megakaryocyttene, (Figur 2D) etter en uvanlig prosess kalt emperipolesis der en celle trenger inn i en annen levende celle11. Denne prosessen, som gjelder 4% av megakaryocytter i normal fysiologisk tilstand, kan økes betydelig under visse patologiske forhold12.
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av det eksperimentelle oppsettet. (A) Innbyggingsprosedyre for benmarg. Benmargen skylles og festes ved rask nedsenking i glutaraldehydoppløsning. Fotografiet illustrerer det typiske utseendet til benmargsylinderen etter spyling. Etter 1 h fiksering ved romtemperatur er margen omgitt av agarose, post-fast i osmium tetroxide og inkubert i uranylacetat. Vevet skylles deretter i buffer, dehydreres i en serie gradert etanol, inkuberes i propylenoksid og infiltreres med epoksyharpiks. (B) Benmarger blokker seksjonering. Den innebygde benmargen er montert på en ultramikrotomholder, trimmet ved 45° og kuttet enten i halvtynne (500 nm) eller tynne (100 nm) seksjoner. For ultrastrukturelle studier plukkes de flytende seksjonene opp med en løkke og deponeres på rutenett med et papirfilter under. (C) Kontrastfarging for TEM-observasjoner. Gitter er invertert på uranylacetatdråper, vasket på destillerte vanndråper og inkubert på blysitrat før en annen vask. Etter tørking (oversiden med seksjonene) er prøvene klare til å undersøkes under TEM. (D) Histologi av en mus femoral marg seksjon farget med toluidin blå. De gigantiske cellene tilsvarer modne megakaryocytter (1), noen er i kontakt med bihuler (2). Bihulene møtes på en stor sentral sinusåre (3). Bar: 20 μm. Innfelt: Normalt utseende av en moden megakaryocytt ved 40x forstørrelse. (E) Representativt TEM-bilde av en benmargsseksjon ved lav forstørrelse. Cellene er tett pakket med lite ekstracellulær plass. Hver rutenetts firkant i seksjonen observeres fra en ekstremitet til en annen ved å følge den skjematiske pilbanen (røde piler). Bar: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative in situ-bilder av megakaryocytter ultrastruktur. (A) Karakteristiske modningsstadier av villtype megakaryocytter. Megakaryocytter er klassifisert i fire modningsstadier: Trinn I, en celle 10-15 μm i diameter med en stor kjerne; trinn II, en celle 15-30 μm i diameter som inneholder DMS under utvikling; trinn III, en 30-50 μm celle som inneholder et velutviklet avgrensningsmembransystem (DMS) som definerer cytoplasmiske territorier og har en organellfri perifer sone. En pyrenocytt tilsvarer den nakne polylobuerte kjernen som er igjen i benmargen etter full cytoplasmisk forlengelse. Stenger: 10 μm (B) Megakaryocyte-endotelial celle interaksjoner og intravaskulære cytoplasmiske prosesser. (i) Den perifere sonen (PZ) til en megakaryocytt er tett apposert til den abluminale overflaten av det sinusformede endotelet. (ii) En megakaryocytt som danner korte invasive fremspring som trenger dypt inn i endotellaget (pilspisser). (iii-v) Pilene indikerer cytoplasmatiske prosesser av megakaryocytter med varierende diametre, hvorav noen er svært store og har en perifer sone som kan representere fragmenter som nettopp har kommet inn i blodet. (vi) En typisk diskoid blodplate (P) observert i sinuslumen. I hver mikrograf indikerer den røde linjen den lysende siden av endotelbarrieren, og stjernen indikerer sinusoid lumen. Stenger: 2 μm. (C) Høyere forstørrelser av perinuclear regionen av en moden megakaryocyte. α, alfagranulat; rer, grov endoplasmic retikulum; G, golgi; MVB, multivesicular kropp; m, mitokondrier. Bar: 0,5 μm. (D) Eksempel på en megakaryocytt som viser emperipolesis. Den oppslukte nøytrofil vises morfologisk uendret av samspillet med megakaryocytter. Bar: 2 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil: Forberedelse av reagensene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Direkte undersøkelse av megakaryocytter i deres opprinnelige miljø er avgjørende for å forstå megakaryopoiesis og blodplatedannelse. I dette manuskriptet tilbyr vi en transmisjonselektronmikroskopimetode som kombinerer benmargspyling og fiksering ved nedsenking, slik at vi kan dissekere morfologiegenskapene til hele prosessen med megakaryocytt morfogenese som foregår i benmargen.
Rødme av benmargen er et kritisk trinn i denne metoden, da suksessen med en rødme av høy kvalitet avhenger av operatørens praksis og opplæring. Selv om det er delikat, er rødme benmargen den beste måten å unngå fjerning av mineralisert bein, som vanligvis krever en 2-ukers EDTA-behandling for fullstendig avkalking forbundet med betydelige gjenstander på megakaryocyttmorfologien. I tillegg er en stor fordel med å samle hele uløste benmarger fra tibia og lårben evnen til å kombinere flere avbildningsmetoder til samme mus. I praksis er det bare nødvendig med en enkelt benmarg for den ultrastrukturelle studien, de tre andre prøvene er tilgjengelige for komplementære analyser. Den andre benmargen kan deretter brukes til fremstilling av friske benmargsutløp, for å studere i sanntid dynamikken i proplateletdannelse av innfødte megakaryocytter6. Den tredje prøven er vanligvis designet for immundempende studier på tykke seksjoner, noe som gir 3D-avbildning og distribusjon av megakaryocytter i sitt naturlige miljø. Den siste prøven kan fryses og lagres for videre studier ved immunogold elektronmikroskopi, hvor subcellulær lokalisering av proteiner undersøkes ved høy oppløsning4. Disse kombinerte avbildningsmetodene, sammen med tilgjengeligheten av målrettet sletting / mutasjon av gener i en mus, gir et viktig middel for å avgrense in situ den biologiske rollen til et gitt protein i trombopoiesis. Det skal imidlertid påpekes her at en begrensning av denne metoden er tilbaketrekking av epifysene som trengs for å skylle margen. Epifyser er kjent for å være viktige områder for hematopoiesis, og fjerning hindrer derfor enhver mulighet for å analysere hematopoietiske stamceller og de første fasene av engasjement13. En annen begrensning er at forfedre av megakaryocytter før det umodne stadiet jeg ikke kan identifiseres fordi disse cellene ikke har spesifikke ultrastrukturelle egenskaper. For å overvinne denne begrensningen kan en EM-immunogold tilnærming brukes.
Det andre viktige trinnet i metoden er benmargsfiksering ved nedsenking. Når det utføres under forholdene som er beskrevet her, det vil si fiksering umiddelbart etter spyling av den kompakte benmargssylinderen, har den følgende fordeler: (i) den er rask og enkel å utføre, (ii) den bevarer en ultrastruktur nær den observerte etter fiksering ved perfusjon6, og (iii) den opprettholder gratis megakaryocyttprosesser og blodplater i sinusoid blodomløp som ellers skylles ut / går tapt etter perfusjon. Med denne teknikken er det mulig å undersøke oppføring av megakaryocytter i sinusformet sirkulasjon og å karakterisere alle mellomliggende former for cytoplasmiske prosesser hvorfra blodplater oppstår8. I tråd med dette har det nylig blitt rapportert at de store fremspringene intravaserende fra megakaryocytter in vivo er strukturelt forskjellig fra de tynne utvidelsene dannet av megakaryocytter in vitro, med spesielt et annet arrangement av mikrotubulene7. På samme måte har vi nylig vist at mekanismen som styrer blodplater formasjon in vivo er forskjellig fra det identifiserte in vitro14.
Viktige ultrastrukturelle forskjeller blir i økende grad anerkjent mellom in vitro kultivert og in vivo generert innfødte megakaryocytter, understreker behovet for benmargsmikromiljøet for en full megakaryocytt differensiering / modning. Etter kombinasjon av benmargspyling og fiksering ved nedsenking beskrevet i denne artikkelen, er konvensjonell overføringselektronmikroskopi fortsatt et uvurderlig verktøy for å studere megakaryocyttbiologi og blodplatedannelse, under fysiologiske og patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), EU gjennom European Regional Development Fund (ERDF) og av Grant ANR-17-CE14-0001-01 til H.d.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
