Farvning af cytoplasmisk Ca²⁺ med Fluo-4/AM i Apple Pulp

Summary

Isolerede protoplaster af æblemasseceller blev lastet med et calcium fluorescerende reagens for at detektere cytoplasmisk Ca^{2+-koncentration.}

Abstract

Cytosolic Ca²⁺ spiller en central rolle i planteudvikling. Calcium imaging er den mest alsidige metode til at opdage dynamiske ændringer i Ca^{2 +} i cytoplasmaet. I denne undersøgelse opnåede vi levedygtige protoplaster af pulpceller ved enzymatisk hydrolyse. Isolerede protoplaster blev inkuberet med det lille molekyle fluorescerende reagens (Fluo-4/AM) i 30 min ved 37 °C. De fluorescerende sonder med succes plettet cytosolic Ca^{2 +,} men ikke ophobes i vakuoler. La^{3 +,}en Ca^{2 +} kanal blocker, nedsat cytoplasmisk fluorescens intensitet. Disse resultater tyder på, at Fluo-4/AM kan bruges til at opdage ændringer i cytosolic Ca^{2 +} i frugtkødet. Sammenfattende præsenterer vi en metode til effektivt at isolere protoplaster fra kødceller af frugten og detektere Ca^{2 +} ved at indlæse et lille molekyle calcium fluorescerende reagens i cytoplasmaet af pulpceller.

Introduction

Ca²⁺ spiller en vigtig rolle i plantesignaltransduktion og metabolisme^1,2. Desuden regulerer den frugtkvalitetsegenskaber^3,4, herunder hårdhed, sukkerindhold og modtagelighed for fysiologiske lidelser under opbevaring^5,6. Cytoplasmisk Ca²⁺ spiller en vigtig rolle i signaltransduktion og regulerer plantevækst og -udvikling⁷. Forstyrrelse af cellulær calcium homøostase kan fremkalde bitter pit i æbler⁸, brun pletsygdom i pærer⁹og navle råddenskab i tomater¹⁰, påvirker frugtkvaliteten og forårsager alvorlige økonomiske tab^3,11. Calciumbilleddannelse har tilstrækkelig rumlig og tidsmæssig opløsning og er en vigtig metode til at observere Ca^2+-dynamik i levende celler^12,13.

På nuværende tidspunkt er der to hovedmetoder til intracellulær calciumbilleddannelse i levende celler: den ene anvender kemiske små molekylære fluorescerende sonder¹⁴, og den anden er genkodningssensoren (GECI)^15,16. I betragtning af vanskeligheden ved at etablere et stabilt transgent system i frugttræer og længere frugtudvikling er GECI_S uegnet til frugt Ca²⁺ fluorescensbilleddannelse.

Små-molekyle fluorescerende sonder såsom Fluo-4/AM har en særlig fordel: deres AM ester form (celle-permeable acetoxymethyl ester derivat) kan let bulk-læsset i levende celler uden behov for transfection, hvilket gør det fleksibelt, hurtig og ikke-cytotoksisk¹⁷. Fluo-4/AM kunne med succes lastes i pollen rør af Pyrus pyrifolia¹⁸ og Petunia,¹⁹ samt i vagtceller²⁰ og rod hår arabidopsis²¹.

På nuværende tidspunkt er der få rapporter om calcium fluorescens farvning af papirmasse celler²². Som et vigtigt mineralelement spiller calcium en central rolle i væksten og kvalitetskontrol af træfrugter som æbler. Æbletræer er globalt anerkendt som en vigtig økonomisk art, og æbler betragtes som en sund mad²³. I denne undersøgelse opnåede vi levedygtige protoplaster fra æblefrugtmasse gennem enzymatisk hydrolyse og læssede derefter småmolekyler fluorescerende reagenser i cytoplasmaet for at opdage Ca²⁺.

Protocol

1. Protoplastudvinding

1. Den grundlæggende opløsning forberedes: 20 mM CaCl₂, 5 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonsyre og 0,4 M D-sorbitol.
   BEMÆRK: Basisopløsningens pH-fejl blev justeret til 5,8 med 0,1 M Tris buffer, filtreret gennem 0,22 μm vandopløselige filtre og opbevaret ved 4 °C.
2. Forbered den enzymatiske løsning: Bland 0,3% (w/v) Macerozyme R-10 og 0,5% (w/v) cellulase R-10 med basisopløsningen.
3. Der tilsættes 0,5 mL enzymatisk opløsning i et 1,5 mL centrifugerør. Vælg et sundt og modent æble. Skær derefter pulpen i 10 x 5 x 1 mm³ størrelse (Figur 1A-1C).
4. Æblefrugtmassestykkerne placeres i et 1,5 mL centrifugerør, der indeholder enzymatisk opløsning, og luk derefter røret (Figur 1D).
5. Inkuberes ved 28 °C i 1 time og rystes ved 70 omdr./min. i en shaker i mørke.
6. Vask papirmassestykkerne. Aspirere alle de enzymatiske løsning og derefter tilføje 0,5 mL af den grundlæggende løsning.
7. Centrifuge ved 300 x g i 2 min ved stuetemperatur.
8. For at opnå en protoplastaffjedring skal opløsningen suges ud fra bunden af centrifugrøret (Figur 1E).

2. Farvning af calciumion med små molekyler

1. Forbered Fluo-4/AM-lasteopløsningen med 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 og 10x fosfatbuffered saltvand (PBS:80 mM Na₂HPO₄, 1,36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄og 26 mM KCI) i et 1:1:2-forhold.
2. Der tilsættes 1 μL Fluo-4/AM-læsseopløsning til 99 μL af den protoplastaffjedring, der findes i de 1,5 mL centrifugerør. Sørg for, at den endelige koncentration af fluorescerende farvestof er 5 μM. Bland opløsningen og luk derefter røret.
3. La³⁺ behandling: Klargør 100 μM La³⁺ opløsning med 98 μL af protoplastaffjedringen, 1 μL på 10 mM La³⁺og 1 μL fluo-4/AM loading solution. Bland opløsningen og luk røret.
4. Inkuberes i 30 min ved 37 °C i mørke.
5. Protoplasterne vaskes ved centrifugering ved 300 x g i 2 min ved stuetemperatur. Aspirat 70 μL af opløsningen og tilsættes 70 μL af basisopløsningen.
6. Inkuberes protoplastaffjedringen ved 37 °C i 30 min for helt at af-esterificere.
7. Aspirere 15 μL af protoplast suspension og dryp på et dias.
8. Overhold under et fluorescensmikroskop (supplerende figur S1).
   BEMÆRK: Brug et farvekamera med høj følsomhed, dvs. 3,2 MP (2048 x 1536) CMOS-sensor med 3,45 μm pixelopløsning.
9. Vælg GFP-kanalen til billedbehandling (20x). Indstil lysstyrken til 0,5.
   BEMÆRK:Belysning er led-lyskuber med justerbar intensitet med et integreret hårdt belagt filtersæt. Excitation bølgelængden af Fluo-4/AM er 490 nm.

3. Protoplast levedygtighed assay

1. Forbered fluorescein diacetate (FDA) lageropløsning: Opløs FDA i acetone, indtil den endelige koncentration er 1 mg / ml.
2. Fda-arbejdsløsningen forberedes med 1 μL af lageropløsningen og 99 μL acetone.
3. Der tilsættes 1 μL FDA-arbejdsopløsning til 99 μL protoplastaffjedring. Bland opløsningen ved at pipetter op og ned og derefter lukke røret.
   BEMÆRK: Den endelige koncentration af FDA er 100 μg/L.
4. Plet ved stuetemperatur i 5 minutter i mørket.
5. Forbered dias og observere under et fluorescensmikroskop.
6. Vælg GFP-kanalen til billedbehandling (Figur 1F).

4. Billedanalyse

1. Analyser de erhvervede billeder ved hjælp af billedanalyse og regnearkssoftware (f.eks. Image-Pro Plus og Excel 2010).
2. Vælg to lodrette diametre fra protoplasterne for at beregne fluorescensintensiteten (Supplerende figur S2). Der blev målt fluorescensintensiteten for alle protoplaster under forskellige behandlinger. Til endelig behandling skal du bruge fotoredigeringssoftware.

5. Statistisk analyse

1. Udfør statistisk analyse ved hjælp af statistisk software (Supplerende figur S3). Data præsenteres i Mean ± SD. Den studerendes t-testblev brugt til at analysere forskellene mellem de eksperimentelle grupper.

Representative Results

Efter den ovenfor beskrevne protokol brugte vi enzymatisk metode til at opnå levedygtige protoplaster fra pulpen (Figur 1). Nogle protoplaster havde vakuoler, mens andre ikke gjorde. Mens protoplasterne udviste ingen fluorescens, når Ca^{2 +} fluorescerende indikator ikke blev indlæst i dem. Når Fluo-4/AM blev læsset i protoplasterne, cytoplasma, men ikke vakuol, blev fluorescerende (Figur 2). Dette resultat viste, at Fluo-4/AM med succes farvede Ca²⁺ i cytoplasmaet, og at der ikke blev observeret nogen opdeling²⁴. Protoplaster blev farves med FDA i 5 min og viste cytoplasmisk fluorescens. Dette indikerede, at høj temperatur (37 °C) ikke påvirker protoplastens levedygtighed.

La^{3 +,}en blokering agent af Ca^{2 +} kanal²⁵, blev tilføjet, når Fluo-4/AM blev indlæst i protoplaster. Ved 100 μM reducerede La³⁺ calciumfluescensintensiteten (Figur 3).

Figur 1: Protoplaster fremstillet ved enzymatisk hydrolyse. (A) Et stykke er skåret af et modent æble. (B) Protoplaster blev udvundet af papirmassestykker. (C) Pulpen blev skåret i 10 × 5 × 1 mm³ stykker. (D) Papirmassestykkerne blev anbragt i centrifugerør indeholdende 0,5 mL enzymopløsning. (E) Protoplaster. Pilespidser peger på protoplasten, og pilene angiver vakuolen i protoplasten. (F) Protoplaster var farves med FDA i 5 min ved stuetemperatur. (Dette tal er blevet ændret fra reference ²² [Gartneriforskning: Loading calcium fluorescerende sonder i protoplaster til at opdage calcium i kødvævscellerne i Malus domestica]. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Lastning fluo-4/AM og La³⁺ i protoplasterne. (A) Kontrol: Intakt protoplast uden nogen lastet fluorescerende sonde. (B) Protoplaster lastet med Fluo-4/AM. (C) La³⁺ blev tilføjet, da protoplasterne var lastet med Fluo-4/AM. Den endelige koncentration af La³⁺ var 100 μM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Statistisk analyse af fluorescensintensiteten i protoplasterne. Angiv signifikant forskel i henhold til Elevens t-test(P <0.001). Lodrette søjler angiver ± SD. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet af 20 protoplaster. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur S1: Fluorescensmikroskop. (A) Fluorescensmikroskopets samlede udseende. (B) Siden Indstillinger. Vælg 20x-målsætning, GFP-kanal, og juster lysstyrken ensartet til 0,5. (C) Fluorescens excitation region. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Trin, der anvendes til at beregne fluorescensintensiteten^{ca. 2+} ved protoplast af frugtcelle. Fluorescensintensitetsenheder , der anvendes i denne undersøgelse , er baseret på tidligere rapporter^26,27,28,29. Beregningsprocessen er som følger: (A) Åbn protoplast fluorescens billedet i softwaren. Klik på måleværktøjet. Vælg Profillinjei rullemenuen . (B) Vælg Cirkel i vinduet Linjeprofil. Brug denne ellipse ved protoplasten. (C) I vinduet Linjeprofil skal du nu vælge | Eksporter data (D) Kontroller, at det tomme regneark åbnes, og importer data ved at klikke på Dataeksport. Brug funktionen 'gennemsnit' til at beregne den gennemsnitlige fluorescensintensitet. Hver behandling blev gentaget tre gange med mere end 20 protoplaster hver. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Datastatistikken blev udført ved hjælp af statistisk analysesoftware. Indsæt dataene i tabellen, og klik på Analyser til dataanalyse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: Udvinding af protoplaster fra papirmassen af andre sorter af æbler. (A) Dounan. (B) Honning Sprød. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I denne undersøgelse blev levedygtige protoplaster opnået ved enzymatisk hydrolyse. Bemærk, at denne metode kræver friske æbler. Denne protokol giver mulighed for hurtig isolering af et stort antal protoplaster fra frugtmasse til brug i forskningsundersøgelser. Anvendelsen af denne metode er ikke begrænset til »Fuji«. protoplasterne på æblemassen af »Dounan« og »Honey Crisp« kan også udvindes ved samme protokol (supplerende figur S4). Protoplastopløsningen efter enzymolyse indeholder celleaffald, som blev noget forbedret i forhold til tidligere metoder. Som et vigtigt cellemateriale kan æblemasseprotoplaster bruges til celleproteinudtryksteknologi, enkeltcellet sekventering og anden forskning.

Der er mange metoder vedrørende kemisk fluorescerende reagens farvning i planteceller³⁰. For eksempel blev Fluo-3/AM indlæst ved en lav temperatur (4 °C), således at den ville komme ind i rodspidscellerne³¹. Fluo-3/AM kan også lastes ved en høj temperatur (37 °C) i pollenrøret³². Fluo-4/AM har med succes lagt i pollenrøret af Pyrus pyrifolia (25 °C i 15 min)¹⁸ og rodhår af Arabidopsis (4 °C i 30 min)³³. Disse metoder er dog ikke egnede til farvning af æblemasseprotoplaster. I denne undersøgelse har vi med succes læsset fluorescerende sonder i protoplaster ved en høj temperatur (37 °C). Derudover er den nuværende metode enkel, hurtig, præcis og påvirker ikke protoplast vitalitet. Et kritisk skridt i den foreslåede metode er at vaske de farvede protoplaster og inkubere dem i 30 minutter. Efter farvning skal protoplasterne vaskes. Vask vil reducere baggrunden fluorescens under observation, således at fluorescens intensiteten af protoplaster kan tælles mere præcist. Inkuber i 30 min for at tillade, at flere sonder indlæses i protoplasterne. Bemærk, at det er vigtigt at undgå lyseksponering under lastningen.

La³⁺ er et vigtigt værktøj til at studere Ca²⁺. Det binder sig til Mg^{2 +} katalytisk sted på den cytoplasmatiske membran Ca^{2 +}-ATPase, hvilket hæmmer steady-state omsætning ca^{2 +}-ATPase og blokerer Ca^{2 +} transmembrane funktion³⁴. La³⁺ behandling reduceret cytoplasmisk Ca²⁺og Fluo-4/AM kunne afspejle denne ændring, eksklusive interferens af andre divalente kationer og kontrollere muligheden for kemisk fluorescens reagenser.

Selv om denne indlæsningsmetode giver flere fordele end andre metoder, skal den stadig forbedres yderligere med hensyn til at transformere dataresultater. Her estimerede vi det relative cytoplasmaiske Ca^2+-indhold ved at detektere fluorescensværdien af protoplaster, som er kvalitative data snarere end kvantitative. Derfor er det særligt vigtigt at oversætte farvningsresultaterne til specifikt cytoplasmisk Ca^2+-indhold i fremtidige undersøgelser, hvilket kan give et forskningsgrundlag for analyse af frugt Ca²⁺ signalering.

Sammenfattende kan den metode, der er beskrevet heri, detektere cytoplasmisk Ca²⁺ i æblemasseceller og derved yde teknisk støtte til de relaterede undersøgelser af frugtmassecelle calcium.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.