Colorazione del Citoplasmatico Ca²⁺ con Fluo-4/AM in Polpa di Mela

Summary

Protoplasti isolati di cellule di polpa di mela sono stati caricati con un reagente fluorescente di calcio per rilevare la concentrazione citoplasmatica di Ca^2+.

Abstract

Cytosolic Ca²⁺ svolge un ruolo chiave nello sviluppo delle piante. L'imaging del calcio è il metodo più versatile per rilevare i cambiamenti dinamici nel Ca²⁺ nel citoplasma. In questo studio, abbiamo ottenuto protoplasti vitali di cellule pulpare mediante idrolisi enzimatica. I protoplasti isolati sono stati incubati con il reagente fluorescente a piccola molecola (Fluo-4/AM) per 30 minuti a 37 °C. Le sonde fluorescenti hanno colorato con successo il catosolico Ca²⁺ ma non si sono accumulate nei vacuoli. La^3+,un bloccante dei canali Ca^2+, ha diminuito l'intensità della fluorescenza citoplasmatica. Questi risultati suggeriscono che Fluo-4 / AM può essere utilizzato per rilevare cambiamenti nel Ca^{2 +} citosolico nella polpa del frutto. In sintesi, presentiamo un metodo per isolare efficacemente i protoplasti dalle cellule carnise del frutto e rilevare Ca²⁺ caricando un reagente fluorescente di calcio a piccola molecola nel citoplasma delle cellule della polpa.

Introduction

Ca²⁺ svolge un ruolo importante nella trasduzione del segnale vegetale e nel metabolismo^1,2. Inoltre, regola i tratti di qualità della frutta^3,4, tra cui durezza, contenuto di zucchero e suscettibilità a disturbi fisiologici durante la conservazione^5,6. Il Ca²⁺ citoplasmatico svolge un ruolo importante nella trasduzione del segnale e regola la crescita e lo sviluppo delle piante⁷. Il disturbo dell'omeostasi cellulare del calcio può indurre la fossa amara nelle mele⁸, la malattia delle macchie marroni nelle pere⁹e il marciume ombelicale nei pomodori¹⁰, influenzando la qualità della frutta e causando gravi perdite economiche^3,11. L'imaging del calcio ha una risoluzione spaziale e temporale sufficiente ed è un metodo importante per osservare la dinamica di Ca²⁺ nelle cellule viventi^12,13.

Allo stato attuale, ci sono due metodi principali per l'imaging intracellulare del calcio nelle cellule vive: uno impiega sonde fluorescenti chimiche a piccole molecole¹⁴e l'altro è il sensore di codifica genica (GECI)^15,16. Data la difficoltà di stabilire un sistema transgenico stabile negli alberi da frutto e uno sviluppo più lungo dei frutti, GECI_S non è adatto per l'imaging a fluorescenza Ca²⁺ della frutta.

Le sonde fluorescenti a piccole molecole come Fluo-4 / AM hanno un vantaggio particolare: la loro forma di estere AM (derivato dell'estere acetoximetilico permeabile alle cellule) può essere facilmente caricata in massa nelle cellule viventi senza la necessità di trasfezione, il che la rende flessibile, rapida e non citotossica¹⁷. Fluo-4 / AM potrebbe essere caricato con successo nel tubo pollinico di Pyrus pyrifolia¹⁸ e Petunia,¹⁹ così come nelle cellule di guardia²⁰ e nei capelli radicali di Arabidopsis²¹.

Allo stato attuale, ci sono pochi rapporti sulla colorazione a fluorescenza di calcio delle cellule della polpa²². Come importante elemento minerale, il calcio svolge un ruolo chiave nella crescita e nel controllo di qualità dei frutti degli alberi come le mele. I meli sono riconosciuti a livello mondiale come un'importante specie economica e le mele sono considerate un alimento sano²³. In questo studio, abbiamo ottenuto protoplasti vitali dalla polpa del frutto della mela attraverso l'idrolisi enzimatica e poi caricato reagenti fluorescenti a piccole molecole nel citoplasma per rilevare Ca^{2 +.}

Protocol

1. Estrazione di protoplasti

1. Preparare la soluzione di base: 20 mM CaCl₂, 5 mM 2-(N-morfolino)acido etanosolfonico e 0,4 M D-sorbitolo.
   NOTA: il pH della soluzione di base è stato regolato a 5,8 con tampone Tris da 0,1 M, filtrato attraverso filtri solubili in acqua da 0,22 μm e conservato a 4 °C.
2. Preparare la soluzione enzimatica: Mescolare lo 0,3% (p/v) di Macerozima R-10 e lo 0,5% (p/v) di cellulasi R-10 con la soluzione di base.
3. Aggiungere 0,5 mL di soluzione enzimatica in un tubo centrifugo da 1,5 mL. Scegli una mela sana e matura. Quindi affettare la polpa in formato 10 x 5 x 1 mm³ (Figura 1A-1C).
4. Posizionare i pezzi di polpa di frutta di mela in un tubo di centrifuga da 1,5 ml contenente soluzione enzimatica e quindi chiudere il tubo (Figura 1D).
5. Incubare il tubo a 28 °C per 1 ora, agitando a 70 giri/min in uno shaker al buio.
6. Lavare i pezzi di polpa. Aspirare tutta la soluzione enzimatica e quindi aggiungere 0,5 ml della soluzione di base.
7. Centrifugare a 300 x g per 2 minuti a temperatura ambiente.
8. Per ottenere una sospensione di protoplasto, aspirare la soluzione dal fondo del tubo della centrifuga (Figura 1E).

2. Colorazione a fluorescenza a ioni di calcio a piccola molecola

1. Preparare la soluzione di carico Fluo-4/AM con 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 e 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS:80 mM Na₂HPO_4,1,36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄e 26 mM KCI) in un rapporto 1:1:2.
2. Aggiungere 1 μL di soluzione di carico Fluo-4/AM a 99 μL della sospensione di protoplasto presente nei tubi della centrifuga da 1,5 mL. Assicurarsi che la concentrazione finale del colorante fluorescente sia di 5 μM. Mescolare la soluzione e quindi chiudere il tubo.
3. Trattamento La^3+: Preparare 100 μM la soluzione La³⁺ con 98 μL di sospensione protoplasta, 1 μL di 10 mM La³⁺e 1 μL di soluzione di carico Fluo-4/AM. Mescolare la soluzione e chiudere il tubo.
4. Incubare per 30 minuti a 37 °C al buio.
5. Lavare i protoplasti per centrifugazione a 300 x g per 2 minuti a temperatura ambiente. Aspirare 70 μL della soluzione e aggiungere 70 μL della soluzione di base.
6. Incubare la sospensione di protoplasto a 37 °C per 30 minuti per de-esterificare completamente.
7. Aspirare 15 μL della sospensione del protoplasto e gocciolare su un vetrino.
8. Osservare al microscopio a fluorescenza (Figura supplementare S1).
   NOTA: utilizzare una fotocamera a colori con alta sensibilità, ovvero sensore CMOS da 3,2 MP (2048 x 1536) con risoluzione pixel di 3,45 μm.
9. Selezionare il canale GFP per l'imaging (20x). Impostare la luminosità su 0,5.
   NOTA: l'illuminazione è un cubo di luce a LED ad intensità regolabile con un set di filtri hard-coated integrato. La lunghezza d'onda di eccitazione di Fluo-4/AM è di 490 nm.

3. Saggio di vitalità del protoplasto

1. Preparare la soluzione madre di fluoresceina diacetato (FDA): Sciogliere FDA in acetone fino a quando la concentrazione finale è di 1 mg/ml.
2. Preparare la soluzione di lavoro FDA con 1 μL della soluzione stock e 99 μL di acetone.
3. Aggiungere 1 μL di soluzione di lavoro FDA a 99 μL di sospensione di protoplasto. Mescolare la soluzione tubando su e giù e quindi chiudere il tubo.
   NOTA: La concentrazione finale della FDA è di 100 μg/L.
4. Macchiare a temperatura ambiente per 5 minuti al buio.
5. Preparare i vetrini e osservare al microscopio a fluorescenza.
6. Selezionare il canale GFP per l'imaging (Figura 1F).

4. Analisi delle immagini

1. Analizza le immagini acquisite utilizzando l'analisi delle immagini e il software per fogli di calcolo (ad esempio, Image-Pro Plus ed Excel 2010).
2. Selezionare due diametri verticali dai protoplasti per calcolare l'intensità di fluorescenza (Figura supplementare S2). È stata misurata l'intensità di fluorescenza di tutti i protoplasti sotto diversi trattamenti. Per l'elaborazione finale, utilizzare un software di fotoritocco.

5. Analisi statistica

1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software statistici (Figura supplementare S3). I dati sono presentati in Mean ± SD. Il t-testdello studente è stato utilizzato per analizzare le differenze tra i gruppi sperimentali.

Representative Results

Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo utilizzato il metodo enzimatico per ottenere protoplasti vitali dalla polpa (Figura 1). Alcuni protoplasti avevano vacuoli, mentre altri no. Mentre i protoplasti non hanno mostrato fluorescenza quando l'indicatore fluorescente Ca^{2 +} non è stato caricato in essi. Quando Fluo-4/AM è stato caricato nei protoplasti, il citoplasma, ma non il vacuolo, è diventato fluorescente (Figura 2). Questo risultato ha indicato che Fluo-4/AM ha colorato con successo Ca²⁺ nel citoplasma e che non è stata osservata alcuna compartimentazione^24. I protoplasti sono stati colorati con la FDA per 5 minuti e hanno mostrato fluorescenza citoplasmatica. Ciò ha indicato che l'alta temperatura (37 °C) non influisce sulla vitalità del protoplasto.

La^3+,un agente bloccante del canale Ca^{2+ 25,}è stato aggiunto quando Fluo-4/AM è stato caricato in protoplasti. A 100 μM, La³⁺ ha diminuito l'intensità di fluorescenza del calcio (Figura 3).

Figura 1: Protoplasti ottenuti per idrolisi enzimatica. (A) Un pezzo è stato tagliato da una mela matura. (B) I protoplasti sono stati estratti da pezzi di polpa. (C) La polpa è stata tagliata in 10 × 5 × 1 mm³ pezzi. (D) I pezzi di polpa sono stati posti in tubi di centrifuga contenenti 0,5 ml di soluzione enzimatica. (E) Protoplasti. Le punte di freccia puntano al protoplasto e le frecce indicano il vacuolo nel protoplasto. (F) I protoplasti sono stati colorati con FDA per 5 minuti a temperatura ambiente. (Questa cifra è stata modificata dal riferimento ²² [Ricerca orticola: caricamento di sonde fluorescenti di calcio in protoplasti per rilevare il calcio nelle cellule del tessuto della carne di Malus domestica]. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Caricamento di Fluo-4/AM e La³⁺ nei protoplasti. (A) Controllo: Protoplasto intatto senza alcuna sonda fluorescente caricata. (B) Protoplasti caricati con Fluo-4/AM. (C) La³⁺ è stato aggiunto quando i protoplasti sono stati caricati con Fluo-4/AM. La concentrazione finale di La³⁺ era di 100 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi statistica dell'intensità di fluorescenza nei protoplasti. Indicare una differenza significativa come da t-testdello studente (P <0.001). Le barre verticali indicano ± SD. Ogni punto dati rappresenta la media di 20 protoplasti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Microscopio a fluorescenza. (A) L'aspetto generale del microscopio a fluorescenza. (B) Pagina Impostazioni. Seleziona obiettivo 20x, canale GFP e regola uniformemente la luminosità a 0,5. (C) Regione di eccitazione della fluorescenza. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Passaggi utilizzati per calcolare l'intensità difluorescenza di Ca²⁺ al protoplasto della cellula fruttifera. Le unità di intensità di fluorescenza utilizzate in questo studio si basano su precedenti rapporti^26,27,28,29. Il processo di calcolo è il seguente: (A) Aprire l'immagine di fluorescenza del protoplasto nel software. Fare clic sullo strumento Misura. Dal menu a discesa selezionare Linea profilo. (B) Selezionate Cerchio (Circle) nella finestra Profilo linea (Line Profile). Usando questo disegnare un'ellisse al protoplasto. (C) Nella finestra Profilo linea ora selezionare File | Esporta dati (D) Assicurarsi che il foglio di calcolo vuoto sia aperto e importare i dati facendo clic su Esporta dati. Utilizzare la funzione "media" per calcolare l'intensità media della fluorescenza. Ogni trattamento è stato ripetuto tre volte con più di 20 protoplasti ciascuno. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: Le statistiche dei dati sono state eseguite utilizzando un software di analisi statistica. Incollare i dati nella tabella e fare clic su Analizza per l'analisi dei dati. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S4: Estrazione di protoplasti dalla polpa di altre varietà di mele. (A) Dounan. (B) Miele croccante. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

In questo studio, protoplasti vitali sono stati ottenuti mediante idrolisi enzimatica. Si noti che questo metodo richiede mele fresche. Il presente protocollo consente il rapido isolamento di un gran numero di protoplasti dalla polpa di frutta per l'uso in studi di ricerca. L'applicabilità di questo metodo non è limitata a 'Fuji'; anche i protoplasti della polpa di mela di 'Dounan' e 'Honey Crisp' possono essere estratti attraverso lo stesso protocollo (Figura supplementare S4). La soluzione di protoplasto dopo l'enzimalisi contiene detriti cellulari, che è stato leggermente migliorato rispetto ai metodi precedenti. Come materiale cellulare essenziale, i protoplasti della polpa di mela possono essere utilizzati per la tecnologia di espressione delle proteine cellulari, il sequenziamento di singole cellule e altre ricerche.

Esistono molti metodi per quanto riguarda la colorazione chimica dei reagenti fluorescenti nelle cellule vegetali³⁰. Ad esempio, Fluo-3 / AM è stato caricato a bassa temperatura (4 ° C), in modo tale che entrasse nelle celle della punta della radice³¹. Fluo-3/AM può anche essere caricato ad alta temperatura (37 °C) nel tubo polline³². Fluo-4/AM ha caricato con successo nel tubo polline di Pyrus pyrifolia (25 °C per 15 min)¹⁸ e nei peli radicali di Arabidopsis (4 °C per 30 min)³³. Tuttavia, questi metodi non sono adatti per colorare i protoplasti della polpa di mela. In questo studio, abbiamo caricato con successo sonde fluorescenti in protoplasti ad alta temperatura (37 °C). Inoltre, il metodo attuale è semplice, veloce, preciso e non influisce sulla vitalità del protoplasto. Un passo fondamentale nel metodo proposto è quello di lavare i protoplasti colorati e incubarli per 30 minuti. Dopo la colorazione, i protoplasti devono essere lavati. Il lavaggio ridurrà la fluorescenza di fondo durante l'osservazione in modo che l'intensità di fluorescenza dei protoplasti possa essere contata in modo più accurato. Incubare per 30 minuti per consentire il caricamento di più sonde nei protoplasti. Si noti che è essenziale evitare l'esposizione alla luce durante il carico.

La³⁺ è uno strumento importante per studiare Ca²⁺. Si lega al sito catalitico Mg²⁺ sulla membrana citoplasmatica Ca²⁺-ATPasi, inibendo così il turnover allo stato stazionario di Ca²⁺-ATPasi e bloccando il funzionamento della transmembrana Ca^{2+ 34}. Il trattamento^{con trattamento} con^{catico 2+}ridotto e Fluo-4/AM potrebbe riflettere questo cambiamento, escludendo l'interferenza di altri cationi bivalenti e verificando la fattibilità dei reagenti chimici di fluorescenza.

Sebbene questo metodo di caricamento offra maggiori vantaggi rispetto ad altri metodi, deve ancora essere ulteriormente migliorato nella trasformazione dei risultati dei dati. Qui, abbiamo stimato il contenuto relativo di Ca²⁺ citoplasmatico rilevando il valore di fluorescenza dei protoplasti, che è un dato qualitativo piuttosto che quantitativo. Pertanto, è particolarmente importante tradurre i risultati della colorazione in specifici contenuti citoplasmatici di Ca²⁺ in studi futuri, che potrebbero fornire una base di ricerca per l'analisi della segnalazione di Ca²⁺ di frutta.

In sintesi, il metodo qui descritto è in grado di rilevare il Ca²⁺ citoplasmatico nelle cellule della polpa di mela, fornendo così supporto tecnico per gli studi correlati sul calcio delle cellule della polpa del frutto.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.