Summary
Melanom är en mycket aggressiv sjukdom som snabbt sprider sig till andra organ. Detta protokoll beskriver tillämpningen av ultra-högfrekvent ultraljud imaging, tillsammans med 3D rendering, för att övervaka volymen av inguinallymfknutor lymfkörtlar i Braf/Pten mus modell av ögonbevarande melanom.
Abstract
Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox genetiskt konstruerade möss (Braf/Pten möss) används ofta som en in vivo-modell av metastaserat melanom. När en primär tumör har framkallats av tamoxifenbehandling observeras en ökning av metastaserad börda inom 4-6 veckor efter induktion. Detta dokument visar hur Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) imaging kan utnyttjas för att övervaka ökningen av metastaserad inblandning av de inguinallymfknutna lymfkörtlarna genom att mäta ökningen av deras volym.
UHFUS-systemet används för att skanna bedövade möss med en UHFUS linjär sond (22-55 MHz, axiell upplösning 40 μm). B-lägesbilder från de inguinallymfknutna lymfkörtlarna (både vänster och höger sida) förvärvas i en kortaxlig vy, placera djuren i dorsala recumbency. Ultraljudsjournaler förvärvas med hjälp av en stegstorlek på 44 μm på en motoriserad mekanisk arm. Efteråt importeras tvådimensionella (2D) B-läge förvärv till mjukvaruplattformen för ultraljud bild efterbehandling, och inguinallymfknutor lymfkörtlar identifieras och segmenteras semi-automatiskt i de förvärvade tvärsnitts 2D-bilderna. Slutligen erhålls en total rekonstruktion av den tredimensionella (3D) volymen automatiskt tillsammans med renderingen av lymfkörtelvolymen, som också uttrycks som en absolut mätning.
Denna icke-invasiva in vivo-teknik tolereras mycket väl och möjliggör schemaläggning av flera bildbehandlingssessioner på samma försöksdjur under 2 veckor. Det är därför idealiskt att bedöma effekten av farmakologisk behandling på metastaserad sjukdom.
Introduction
Melanom är en aggressiv form av hudcancer som ofta sprider sig till andra hudplatser (subkutana metastaser), liksom till lymfkörtlar, lungor, lever, hjärna och ben1. Under det senaste decenniet har nya läkemedel introducerats i klinisk praxis och har bidragit till att förbättra livslängden för metastaserande melanompatienter. Begränsningar kvarstår dock, inklusive variabel tid till och grad av svar, allvarliga biverkningar och uppror av förvärvad resistens1. Därför är det viktigt att upptäcka metastaserad spridning i dess tidiga skeden, det vill säga när det kommer till de lokala lymfkörtlarna.
En biopsi av de lokala lymfkörtlarna (sentinel lymfkörtlar) utförs vanligtvis för att kontrollera förekomsten av melanomceller. Ultraljud imaging håller dock på att få fäste som en icke-invasiv metod för att upptäcka ögonbevarande engagemang, eftersom det överträffar klinisk utvärdering och kan bidra till att undvika en onödig biopsi2,3,4. Dessutom verkar ultraljud imaging lämpligt för lymfkörteln övervakning, särskilt vid hög ålder och/eller samsjuklighet5,6. De funktioner som detekteras genom ultraljud analys och tillåter differentiering mellan normala och ögonbevarande lymfkörtlar omfattar ökad storlek (volym), förändring av form från oval till rund, oregelbunden marginal, förändrat ekogent mönster och förändrad (ökad) vaskulärisering7.
Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox genetiskt modifierade möss (Braf/Pten möss) har nyligen gjorts tillgängliga för forskarsamhället som en vävnadsspecifik och inducerbar modell för metastaserat melanom8. I denna djurmodell utvecklas primära tumörer mycket snabbt: de blir synliga inom 2-3 veckor efter induktion av övergången från wild-type (wt) Braf till BrafV600E och förlusten av Pten, medan de når en volym på 50-100 mm3 inom 4 veckor. Under de följande 2 veckorna åtföljs tillväxten av den primära tumören av en progressiv ökning av metastaserad börda i andra hudplatser, lymfkörtlar och lungor.
Braf/Pten möss har använts i stor utsträckning för flera ändamål, inklusive dissekering av signalvägar involverade i melanomgenes9,10, identifiering av melanomceller av ursprung11,12,13 och testning av nya terapeutiska alternativ när det gäller både riktad terapi och immunterapi8,14,15,16 . Specifikt använde vi Braf/Pten möss för att visa att försvagade Listeria monocytogenes (Lmat) fungerar som ett anti-melanom vaccin. När det administreras systemiskt i den terapeutiska inställningen är Lmat inte associerad med övergripande toxicitet eftersom den selektivt ackumuleras på tumör platser. Dessutom orsakar det en anmärkningsvärd minskning av primär melanom massa och en minskning av metastaserad börda i lymfkörtlar och lungor. På molekylär nivå orsakar Lmat apoptotisk avlivning av melanomceller, vilket åtminstone delvis beror på icke-cell-autonoma aktiviteter (rekrytering på plats av CD4+ och CD8 + T lymfocyter)16.
När Braf/Pten möss används för melanom modellering, tillväxten av primära tumörer och subkutana metastaser kan övervakas av caliper mätningar. Lymfkörtlarnas och lungornas inblandning måste dock undersökas med hjälp av en alternativ teknik, möjligen en icke-invasiv teknik som gör det möjligt för forskare att följa samma djur över tid. Detta dokument beskriver användningen av ultraljud imaging (figur 1), tillsammans med en efterföljande 3D volymetrisk analys av erhållna data, för longitudinell övervakning av ökningen av storlek (volym) av inguinallymfknutor lymfkörtlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av det italienska hälsoministeriet (djurprotokollen #754/2015-PR och #684/2018-PR).
1. Melanominduktion
OBS: Sex veckor gamla Tyr::CreER+, BrafCA/+,Ptenlox/lox möss [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] användes i denna studie (se tabellen över material).
- Behandla mössen med 4-hydroxitamoxifen (4-HT) genom att applicera 3 μL 5 mM 4-HT på ~1 cm2 rakad hud på övre delen av ryggen, enligt beskrivningen tidigare11,16,17, under 3 dagar i rad.
OBS: Detta aktiverar Cre-enzymet och orsakar en övergång från wt Braf till BrafV600E och förlust av Pten. Dessa två träffar är tillräckliga för att inducera melanombildning. - Observera att primära tumörer utvecklas på platsen för hudmålningen om 2-3 veckor och når en volym på 50-100 mm3 på 4 veckor. Observera också metastaser till andra hudplatser, lymfkörtlar och lungor vid denna tidpunkt (t0).
- Använd kalibrar för att mäta volymen av den primära tumören och subkutana metastaser och ultraljudsavbildning för att mäta volymen av de inguinallymfknutna lymfkörtlarna. Upprepa dessa mätningar efter en vecka (t1, 5 veckor efter hudmålning) och efter två veckor (t2, 6 veckor efter hudmålning).
- Vid den sista tidpunkten avliva mössen genom att överdosera med gasformig sevoran.
- Analysera den primära tumör och lymfkörtlar genom visuell inspektion, sedan punkt dem för histologiska studier, som rapporterats i16.
2. Bildbehandlingsprocedur
- Placera musen i en induktionskammare för gasanestesi och leverera 3% isofluran i rent syre tills djuret är helt bedövt. Verifiera anestesidjupet genom brist på svar på tassnypa.
- Överför djuret till en uppvärmd bräda - en konstituerande del av UHFUS bildstation - som håller djuret i en supin position. Använd en rektal sond smörjd med petroleumgel för att mäta kroppstemperaturen. Justera brädtemperaturen för att bibehålla musens kroppstemperatur i det fysiologiska intervallet (36 ± 1 °C).
- Fukta musens ögon med veterinärsalva för att förhindra torrhet under anestesi. Leverera narkotisk gas (1,5% isofluran i rent syre) genom en muss näsmask. Justera procentandelen isofluran för att bibehålla rätt anestesidjup.
- Täck fram- och bakpottarna med ledande pasta och tejpa fast dem på EKG-plattelektroderna inbäddade i brädan. Kontrollera att de fysiologiska parametrarna (hjärtfrekvens, andningssignal och kärnkroppstemperatur) förvärvas och visas korrekt.
- Ta bort hår från båda inguinallymfknutor genom att applicera ett depilatoriskt medel och täck dem med ett akustiskt kopplingsmedium.
- Kläm fast UHFUS linjära sond (40 MHz centrumfrekvens) i en specialiserad 3D-motor inbäddad i UHFUS-bildstationen, vilket möjliggör automatisk och stegvis rörelse av sonden.
- Korrekt orientera och justera positionen för ultraljudssonden för att få kortaxliga bilder av den inguinallymfknutor lymfkörteln (vänster/höger) och placera den region som är av intresse i fokuszonen.
- Skanna hela volymen av den inguinallymfknutor lymfkörteln som en sekvens av 2D B-läge bilder, som beskrivits tidigare18. Skaffa bilder på flera nivåer av lymfkörteln genom linjär rörelse av givaren med stegstorlekar på en mikrometerskala, för att generera 3D-data när det gäller automatiskt andnings- och hjärtportade cine-slingor.
- Ställ in bildinspelningen med följande parametrar: skanningsavstånd mellan 2 och 5 mm (beroende på lymfkörtelstorlek); stegstorlek 44 μm, med ett resultat av 46-114 skanningssteg/lymfkörtelskivor och en förvärvstid på 1-3 min per djur. Lagra de förvärvade bilderna digitalt i raw format (DICOM) för ytterligare offlineanalyser.
- I slutet av avbildningssessionen, avbryt gasbedövningen och låt djuret återhämta sig på värmebrädan i sternal recumbency. Ta hand om djuret tills det har återfått tillräckligt medvetande för att bibehålla den benägna positionen.
3. Efterbehandling av ultraljudsbilder
- Öppna datauppsättningen för DICOM 3D-bilder av vänster/höger inguinallymfknutor lymfkörteln i mjukvaruplattformen för ultraljud bild efterbehandling.
- Segmentering:
- Välj Metod med flera segment om du vill visualisera både aktuella bildrutor och miniatyrbilder för alla bildrutor som motsvarar varje bild som togs under 3D-förvärvet.
- Markera miniatyren av den första bildrutan för att läsa in den i konturvyn. I konturvyn vänsterklickar du på musen för att släppa punkter längs lymfkörtelns kant. När önskat antal punkter har angetts (intervall 10-15) högerklickar du för att slutföra konturen.
- När den första konturen är klar använder du miniatyrvyn för att välja nästa bild för konturering. Om det behövs hoppar du över flera bilder (i genomsnitt 3 bildrutor) mellan konturerna för att minska antalet manuella spår som behövs för varje 3D-volym.
OBS: Mjukvaruplattformen för efterbehandling av ultraljudsbilder genererar automatiskt konturer mellan manuella spår, vilket minskar analystiden. - Upprepa den här processen tills hela volymen har beskrivits. När du är klar klickar du på Slutför.
- Generering av 3D-trådram och volymmätning:
- I 3D-lägesfönstret klickar du på ikonen Volymmätning under bildvisningsområdet för att aktivera ytvyn.
Ytvyn skapar en kompileringsvy som mappar den användargenererade volymen till den förvärvade bilden. Ytvyn kan roteras i önskat läge. - Notera volymmätningen som anges i kubvyns nedre vänstra hörn.
OBS: Segmentering och 3D-volymgenerering kan också erhållas med hjälp av specialutvecklad programvara och/ eller fritt tillgänglig / kommersiell programvara för allmän bildbehandling. Från och med manuell segmentering bör programvaran ge en matematisk och/eller pixelnivå beskrivning av lymfkörtelkonturerna. Dessa konturer skulle kombineras i ett 3D-utrymme för att återge lymfkörtlarnas yttre yta. Alla steg som beskrivs i bildbehandlingsproceduren och efterbehandlingen av ultraljudsbilder sammanfattas i figur 2.
- I 3D-lägesfönstret klickar du på ikonen Volymmätning under bildvisningsområdet för att aktivera ytvyn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter hudmålning av Tyr::CreER+, BrafCA/+,Ptenlox/lox möss med 4-HT induceras Cre-aktivitet, på grund av vilken det finns en strömbrytare på genomisk nivå från wt Braf till BrafV600E, medan Pten går förlorad (figur 3A). På 2-3 veckor utvecklar möss primära tumörer på plats med 100% penetrance. Efter fyra veckor från 4-HT behandling (t0), primära tumörer nå en volym av 50-100 mm3, och deras tillväxt kan mätas med calipers för ytterligare 2 veckor ((t1 och t2; Bild 3B, övre paneler). Senare tidpunkter kan inte nås eftersom tumören blir så stor att mössen kräver dödshjälp.
När det gäller den metastaserande bördan observeras en gradvis ökning av pigmentering i de inguinallymfknutna lymfkörtlarna inom 4-6 veckor från 4-HT behandling (figur 3B, lägre paneler). En sådan ökning av pigmentering beror på närvaron av melaninavlagringar, vilket kan bekräftas av hematoxylin och eosinfärgning som utförs utan att ta bort melanin. Melaninavlagringarna beror i sin tur alltid på förekomsten av metastaserade melanomceller, vilket bekräftas av immunohistokemisk (IHC) färgning av melanomantigenet MLANA och BRAFV600E (figur 3C).
Ackumuleringen av pigmenterade melanomceller inuti inguinallymfknutor lymfkörtlar åtföljs av en progressiv ökning av deras volym, vilket framgår av visuell inspektion (figur 3B, nedre paneler). Ultraljudsavbildning erbjuder den unika möjligheten att kvantifiera en sådan ökning längsgående, i varje experimentell mus, som beskrivits tidigare16. Volymetriska mätningar, segmenteringsresultat och 3D-rendering, som alla refererar till ett representativt fall, visas i figur 4. Volymen av varje lymfkörtel erhålls genom manuell segmentering av de axiella sektioner som förvärvats under en 3D-skanning.
I slutet av segmenteringsfasen visar alla sektioner överlägget av lymfkörtelns yttre kontur (figur 4A). Dessa konturer är anslutna bildruta för ram i renderingsfasen, och den yttre ytan av hela lymfkörteln projiceras i 3D-utrymmet. Som ett representativt exempel visas 3D-renderingen av en höger inguinallymfknutor lymfkörtel analyseras vid t0, t1 och t2 i figur 4B, figur 4C respektive figur 4D. Diagrammet i figur 4E kvantifierar den volymökning som visas av vänster och höger inguinallymfknutor hos samma djur över tiden.
Bild 1: Ultraljudsavbildningssystemet som används för att övervaka volymökningen av de inguinallymfknutna lymfkörtlarna i Braf/Pten genetiskt konstruerade musmodell av melanom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Steg-för-steg sammanfattning av bildbehandlingsproceduren och efterbehandlingen av ultraljudsbilder. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Visuell inspektion och histologiska analyser av inguinallymfknutor i den vävnadsspecifika och inducerbara Braf/Pten metastaserande melanommodellen i musen. (A) Cre enzym orsakar omkopplaren av wt Braf till BrafV600E och förlust av Pten (excision av exons 4 och 5). Detta system är melanocytspecifikt eftersom uttrycket av Cre-enzymet kontrolleras av promotorn för tyrosinas, ett enzym som är involverat i melaninsyntesen. Därför är de två onkogena träffarna begränsade till den melanocytiska härstamningen. Detta system är också inducible, därför att Cre uttrycks som ett fusionprotein med östrogenreceptorn och kräver flårmålning med 4-HT för att translocated in i kärnan, var det kan utöva dess fungerar. (B) Utseendet på primära melanom tumörer (övre bilder) och inguinallymfknutor lymfkörtlar (nedre bilder) efter 4, 5 och 6 veckor efter 4-HT behandling (t0, t1, respektive t2). I lymfkörtlar detekteras ökningen av melanin ackumulering och storlek genom visuell inspektion. Skalningsstaplar = 0,5 cm (övre bilder); 0,2 cm (nedre bilder). (C) Histologiska analyser av inguinallymfknutor lymfkörtlar, 6 veckor efter 4- HT behandling. (övre vänstra) H&E-färgning: melaninavlagringar avlägsnas genom inkubation av skivor med 1% KOH och 3% H2O2. (övre högra) Melanin detektion utförs av H&E färgning utan 1% KOH och 3% H2O2 behandling. (längst ner till vänster) MLANA påvisande genom immunoperoxidasfärgning (DAB kromogensubstrat och hematoxylin kontrataining). (längst ner till höger) BRAFV600E påvisande genom immunoperoxidasfärgning (DAB kromogensubstrat och hematoxylin kontrastaining). För alla paneler, ursprunglig förstoring: 40x; skalstänger = 20 μm. Förkortningar: wks = weeks; wt = vild typ; 4-HT = 4-hydroxytamoxifen; H&E = hematoxylin och eosin; DAB = 3,3'-diaminobenzidine. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Mätningar, segmentering och 3D-rendering av volymen av de inguinallymfknutna lymfkörtlarna i den vävnadsspecifika och inducerbara Braf/Pten metastaserande melanommodellen i musen. (B-D) Återgivning av 3D-volymen av rätt inguinallymfknutor, mätt vid 4, 5 respektive 6 veckor efter 4- HT-behandling (t0, t1 respektive t2- tidpunkter). Volymens numeriska värde rapporteras också (i mm3). E) Volymen av den vänstra (svarta cirkeln) och den högra (vita cirkeln) inguinallymfknutor hos samma djur vid t0-, t1- och t2-tidspunkter. Förkortningar: 3D = tredimensionell; 4-HT = 4-hydroxytamoxifen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De data som erhålls i denna studie intygar förmågan av ultraljud imaging att övervaka den metastaserande medverkan av inguinallymfknutor lymfkörtlar i Braf/Pten mus modell av metastaserad melanom. Som visats tidigare16 är denna teknik särskilt användbar för att bedöma effekten av läkemedelsbehandling. Detta beror på att det gör det möjligt att övervaka förändringen i lymfkörtelvolymen hos samma djur över tiden, genom att jämföra de mätningar som samlats in vid t1 ocht2 med de som samlats in vid t0. Detta bidrar i sin tur till en ökning av robustheten hos de erhållna resultaten, eftersom variabilitet mellan mus och andra faktorer som kan påverka basal lymfkörtelstorlek alla redovisas. Dessutom möjliggör ultraljudsavbildning överensstämmelse med 3R-principen genom att minska antalet djur per experimentell grupp.
I Braf/ Pten möss, inte bara inguinal, men också brachial och axillära lymfkörtlar är platser för metastaserande spridning. Det är dock lämpligt att fokusera på inguinallymfknutor lymfkörtlar eftersom de andra är för nära den primära tumörplatsen, vilket vanligtvis ändrar deras lokalisering och morfologi under utvecklingen av den primära tumören själv. Alternativt kan brachial och axillära lymfkörtlar bli lämpliga för ultraljud imaging om en annan plats för tumör induktion väljs, såsom öron eller tassar8. När det gäller andra metastaserande platser kan lungor inte studeras med ultraljudsavbildning på grund av närvaron av luft i vävnaden. Teoretiskt sett kunde endast ytliga lungmetastaser som når pleuragränssnittet visualiseras med denna teknik. Även om mikro datortomografi/positron emission tomografi (CT/PET) kan användas i stället, har detta tillvägagångssätt flera nackdelar, inklusive höga kostnader och begränsad tillgänglighet. Eftersom mikro CT/PET bygger på joniserande strålning är det knappast kompatibelt med longitudinella mätningar vid flera tidpunkter. Omvänt kan ultraljudsavbildning enkelt tillämpas på studien av subkutana metastaser och möjliggör mätning av både volym och kärlbildning16.
Om en 2-veckors tidsram är för kort för att uppskatta effekterna av det läkemedel som studeras, kan en mer perifer induktionsplats (t.ex. spetsen på svansen9,11) eller en mindre tumörbenägen genotyp (Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/+ möss istället för Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox möss) väljas9 . I båda fallen förväntas tillväxten av den primära tumören vara mycket långsammare, vilket möjliggör metastasering övervakning i mycket mer än 6 veckor efter induktion med 4-HT.
Ur en mer teknisk synvinkel är det viktigt att notera att 2D-segmentering av ultraljudsbilder är det mest kritiska steget i detta protokoll, eftersom det kan påverka mätningen av 3D-volym. Lyckligtvis, i Braf / Pten djurmodell, är kontrasten mellan lymfkörtlar och omgivande vävnader ganska markerad, så att skisseringen av lymfkörtelgränserna genom manuell segmentering är relativt enkel. Segmenteringsprocessen bör dock underlättas av den höga kvaliteten på ultraljudsbilderna som förvärvats av sonografen, som i sin tur bör vara mycket erfaren och fokuserad på att förvärva samma ultraljudsprojektion av lymfkörteln, även i skanningssessioner som utförs vid olika tidpunkter.
B-läge ultraljud imaging kan inte markera cancerceller direkt; Istället tillåter det slutsatsen av deras närvaro från ökningen av volymen av inguinallymfknutor lymfkörtlar. Mot bakgrund av denna information rekommenderas att ultraljud imaging kopplas till lämplig IHC färgning av lymfkörtlarna, så att förekomsten av cancerceller kan bekräftas på molekylär nivå. En lymfkörtelförstoring som observerats i en inducerad Braf/Pten mus kan dock vanligtvis hänföras till cancerspridning och inte till någon annan orsak , t.ex. en pågående infektion. Detta beror sannolikt på att experimentella möss som används för ultraljudsavbildning uppföds under kontrollerade förhållanden och rutinmässigt utsätts för sanitära screening, så att sjukdom omedelbart upptäcks och behandlas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka S. Burchielli (FTGM, Pisa) för hennes hjälp med djurprocedurer. Detta arbete stöddes av ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutionell finansiering till LP; MFAG #17095 tilldelas av AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro till LP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
