Summary
黑色素瘤是一种非常具有侵袭性的疾病，可迅速扩散到其他器官。该协议描述了超高频超声成像的应用，结合3D渲染，以监测转移性黑色素瘤Braf / Pten小鼠模型中腹股沟淋巴结的体积。
Abstract
Tyr：：CreER+，BrafCA/+，Ptenlox/lox基因工程小鼠（Braf/Pten小鼠）被广泛用作转移性黑色素瘤的体内模型。一旦原发性肿瘤被他莫昔芬治疗诱导，诱导后4-6周内观察到转移负担增加。本文展示了如何利用超高频超声（UHFUS）成像通过测量腹股沟淋巴结体积的增加来监测腹股沟淋巴结转移性受累的增加。
UHFUS系统用于使用UHFUS线性探针（22-55 MHz，轴向分辨率40μm）扫描麻醉小鼠。从腹股沟淋巴结（左侧和右侧）的B模式图像以短轴视图获取，将动物定位在背卧位。超声波记录是在电动机械臂上使用44μm步长获取的。之后，将二维（2D）B模式采集导入软件平台进行超声图像后处理，并在获取的横截面2D图像中识别和半自动分割腹股沟淋巴结。最后，随着淋巴结体积的渲染，自动获得三维（3D）体积的总重建，这也表示为绝对测量值。
这种非侵入性体内技术具有非常好的耐受性，并允许 在 2周内对同一实验动物安排多次成像会话。因此，评估药物治疗对转移性疾病的影响是理想的选择。
Introduction
黑色素瘤是一种侵袭性皮肤癌，通常扩散到其他皮肤部位（皮下转移），以及淋巴结、肺、肝脏、脑和骨骼1。在过去十年中，新药已被引入临床实践，并有助于提高转移性黑色素瘤患者的预期寿命。然而，局限性仍然存在，包括不同的反应时间和程度，严重的副作用以及获得性耐药性的激增1。因此，在早期阶段检测转移扩散至关重要，即当它到达局部淋巴结时。
通常进行局部淋巴结（前哨淋巴结）的活检以检查黑色素瘤细胞的存在。然而，超声成像作为检测转移性受累的非侵入性方法正在发挥作用，因为它优于临床评估，并且可以帮助避免不必要的活检2，3，4。此外，超声影像学检查似乎适用于淋巴结监测，特别是在高龄和/或合并症的情况下5，6。通过超声分析检测并允许区分正常和转移性淋巴结的特征包括增加大小（体积），形状从椭圆形变为圆形，不规则边缘，回声模式改变和血管形成改变（增加）7。
Tyr：：CreER+，BrafCA/+，Ptenlox/lox基因工程小鼠（Braf/Pten小鼠）最近已作为转移性黑色素瘤的组织特异性诱导模型8提供给科学界。在这种动物模型中，原发性肿瘤发展得非常快：在诱导从野生型（wt）布拉夫到布拉夫600E的转换以及Pten的损失后2-3周内，它们在2-3周内变得可见，而它们在4周内达到50-100 mm3的体积。在接下来的2周内，原发性肿瘤的生长伴随着其他皮肤部位，淋巴结和肺部转移负担的逐渐增加。
Braf / Pten小鼠已被广泛用于多种目的，包括解剖参与黑色素瘤发生的信号通路9，10，鉴定起源的黑色素瘤细胞11，12，13，以及根据靶向治疗和免疫疗法测试新的治疗方案8，14，15，16.具体来说，我们使用Braf / Pten小鼠来证明减毒 单核细胞增多性李斯特菌 （Lmat）作为抗黑色素瘤疫苗有效。当在治疗环境中全身给药时，Lmat与整体毒性无关，因为它选择性地积聚在肿瘤部位。此外，它导致原发性黑色素瘤肿块显着减少，淋巴结和肺部转移负担减少。在分子水平上，Lmat引起黑色素瘤细胞的凋亡性杀伤，这至少部分是由于非细胞自主活动（CD4 +和CD8 + T淋巴细胞现场募集）16。
当Braf / Pten小鼠用于黑色素瘤建模时，可以通过卡尺测量来监测原发性肿瘤和皮下转移的生长。然而，淋巴结和肺部的受累需要使用替代技术进行调查，可能是一种非侵入性的技术，允许研究人员随着时间的推移跟踪同一动物。本文描述了使用超声成像（图1），加上随后获得的数据的3D体积分析，用于腹股沟淋巴结大小（体积）增加的纵向监测。
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Protocol
此处描述的所有方法均已获得意大利卫生部的批准（动物协议#754 / 2015-PR和#684 / 2018-PR）。
1. 黑色素瘤诱导
注意：六周龄的Tyr：：CreER+，BrafCA/+，Ptenlox/lox小鼠[B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg（Tyr-cre/ERT2）13Bos/BosJ（Braf/Pten）]在本研究中使用（见材料表）。
- 如前所述，通过在上背部约1 cm2的剃须皮肤上施用3μL5mM 4-HT来治疗小鼠1-羟基他莫昔芬（4-HT），连续3天。
注意：这将激活Cre酶并导致从wt Braf到BrafV600E的切换以及Pten的损失。这两次打击足以诱导黑色素瘤的形成。 - 观察原发性肿瘤在2-3周内在皮肤涂漆部位发展，并在4周内达到50-100mm 3 的体积。此外，观察此时点（t0）转移到其他皮肤部位，淋巴结和肺部。
- 使用卡尺测量原发性肿瘤和皮下转移的体积，并使用超声成像测量腹股沟淋巴结的体积。在皮肤涂漆后一周（t1，皮肤涂漆后5周）和两周后（皮肤涂漆后t2，6周）后重复这些测量。
- 在最后一个时间点，通过过量使用气态sevorane对小鼠实施安乐死。
- 如16中所述，通过目视检查分析原发性肿瘤和淋巴结，然后将其切除以进行组织学研究。
2. 成像程序
- 将小鼠置于诱导室进行气体麻醉，并在纯氧中提供3%异氟醚，直到动物完全麻醉。通过对爪子捏缺乏反应来验证麻醉深度。
- 将动物转移到加热板上 - UHFUS成像站的组成部分 - 将动物保持在仰卧位置。使用用凡士林润滑的直肠探头测量体温。调节板温，将鼠标的体温保持在生理范围内（36±1°C）。
- 用兽医软膏润湿老鼠的眼睛，以防止麻醉期间干燥。通过小鼠的鼻罩提供麻醉气体（纯氧中的1.5%异氟醚）。调整异氟醚的百分比以保持正确的麻醉深度。
- 用导电膏涂覆前爪和后爪，并用胶带将其贴在嵌入板中的ECG板电极上。检查生理参数（心率、呼吸信号和核心体温）是否正确获取和显示。
- 通过施用脱毛剂去除腹股沟区域的毛发，并用声耦合介质涂覆它们。
- 将UHFUS线性探头（40 MHz中心频率）夹在嵌入UHFUS成像站中的专用3D电机中，允许探头自动和逐步移动。
- 正确定位和调整超声探头的位置，以获得腹股沟淋巴结（左/右）的短轴图像，并将感兴趣区域放置在焦点区域。
- 扫描腹股沟淋巴结的整个体积作为2D B模式图像序列，如前所述18。通过以微米级步长的换能器的线性运动获取淋巴结多个级别的图像，以自动呼吸和心脏门控电影回路的形式生成3D数据。
- 使用以下参数设置图像记录：扫描距离在2到5毫米之间（取决于淋巴结大小）;步长为44μm，结果为46-114个扫描步骤/淋巴结切片，采集时间为每只动物1-3分钟。以原始格式 （DICOM） 数字方式存储采集的图像，以便进一步进行离线分析。
- 在成像过程结束时，停止气体麻醉，让动物在胸骨卧位的加热板上恢复。照顾动物，直到它恢复足够的意识来保持俯卧姿势。
3. 超声图像的后处理
- 在软件平台中打开左/右腹股沟淋巴结的DICOM 3D图像数据集，进行超声图像后处理。
- 分割：
- 选择 “多切片方法 ”可可视化当前帧以及与 3D 采集期间捕获的每个图像相对应的所有帧的缩略图。
- 选择第一帧的缩略图以将其加载到轮廓视图中。在轮廓视图中，左键单击鼠标以沿淋巴结边界放置点。设置所需点数（范围 10-15）后，单击鼠标右键完成等值线。
- 完成第一个轮廓后，使用缩略图视图选择要轮廓的下一个图像。如果需要，请在轮廓之间跳过多个图像（平均 3 帧），以减少每个 3D 体积所需的手动迹线数。
注：超声图像后处理软件平台将自动生成人工迹线之间的轮廓，从而缩短分析时间。 - 重复此过程，直到勾勒出整个卷。完成后，单击“ 完成”。
- 生成 3D 线框和体积测量值：
- 在 3D 模式 窗口工作区中，单击图像显示区域下方的 体积测量 图标以激活 表面视图。
注： 曲面视图创建一个编译视图，该视图将用户生成的卷映射到获取的图像。曲面视图可以旋转到任何所需位置。 - 记下多维数据集视图左下角列出的体积测量值。
注：分割和3D体积生成也可以使用定制开发的软件和/或免费/商业软件进行一般图像处理。从手动分割开始，软件应提供淋巴结轮廓的数学和/或像素级描述。这些轮廓将在3D空间中组合，以渲染淋巴结的外表面。 图2总结了成像过程中描述的所有步骤和超声图像的后处理。
- 在 3D 模式 窗口工作区中，单击图像显示区域下方的 体积测量 图标以激活 表面视图。
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Representative Results
在 对Tyr：：CreER+，BrafCA/+，Ptenlox/lox小鼠进行4-HT的皮肤涂漆后，诱导Cre活性，因此在基因组水平上从wt Braf 切换到BrafV600E，而Pten丢失（图3A）。在2-3周内，小鼠发生100%外显率的现场原发性肿瘤。从4-HT治疗（t0）四周后，原发性肿瘤达到50-100 mm3的体积，并且可以通过卡尺再测量2周（（t1 和t2; 图3B，上图）。后来的时间点无法到达，因为肿瘤变得如此之大，以至于小鼠需要安乐死。
就转移负担而言，在4-HT治疗后4-6周内观察到腹股沟淋巴结色素沉着逐渐增加（图3B，下图）。色素沉着的这种增加是由于黑色素沉积的存在，这可以通过在不去除黑色素的情况下进行的苏木精和曙红染色来证实。反过来，黑色素沉积物总是由于转移的黑色素瘤细胞的存在，正如黑色素瘤抗原MLANA和BRAFV600E的免疫组织化学（IHC）染色所证实的那样（图3C）。
腹股沟淋巴结内色素沉着的黑色素瘤细胞的积累伴随着其体积的逐渐增加，如目视检查所示（图3B，下图）。超声成像提供了独特的机会来量化每只实验小鼠的这种纵向增加，如前所述16。体积测量、分割结果和 3D 渲染（均参考一个代表性案例）如图 4 所示。每个淋巴结的体积是通过手动分割在3D扫描期间获得的轴向切片获得的。
在分割阶段结束时，所有部分都显示了淋巴结外部轮廓的覆盖（图4A）。这些轮廓在渲染阶段逐帧连接，整个淋巴结的外表面投影在3D空间中。作为代表性示例，在t0，t1和t2 处分析的右腹股沟淋巴结的3D渲染分别如图 4B， 图4C和 图4D所示。 图4E 中的图表量化了同一动物的左腹股沟淋巴结和右腹股沟淋巴结随时间推移而显示的体积增加。
图 1：用于监测 Braf/Pten 基因工程黑色素瘤小鼠模型中腹股沟淋巴结体积增加的超声成像系统。请单击此处查看此图的放大版本。
图 2：成像过程和超声图像后处理的分步摘要。请单击此处查看此图的放大图。
图3：小鼠组织特异性和诱导性Braf / Pten转移性黑色素瘤模型中腹股沟淋巴结的目视检查和组织学分析。（A）Cre酶导致wt Braf切换到BrafV600E和Pten（切除外显子4和5）。该系统是黑素细胞特异性的，因为Cre酶的表达受到酪氨酸酶（一种参与黑色素合成的酶）的启动子的控制。因此，两种致癌命中仅限于黑素细胞谱系。该系统也是诱导的，因为Cre表达为与雌激素受体的融合蛋白，并且需要带有4-HT的皮肤涂漆才能转移到细胞核中，在那里它可以发挥其功能。（B）4-HT治疗（分别为t0，t1和t2）后4，5和6周后原发性黑色素瘤肿瘤（上图）和腹股沟淋巴结（下图）的出现。在淋巴结中，通过目视检查检测到黑色素积累和大小的增加。比例尺 = 0.5 厘米（上图）;0.2厘米（下图）。（C）4-HT治疗后6周腹股沟淋巴结的组织学分析。（左上）H&E染色：通过孵育具有1%KOH和3%H2O2的切片来去除黑色素沉积物。 （右上）通过H&E染色进行黑色素检测，无需1%KOH和3%H2O2处理。（左下）通过免疫过氧化物酶染色（DAB染色原底物和苏木精复染）检测MLANA。（右下角）通过免疫过氧化物酶染色（DAB染色原底物和苏木精复染）检测BRAFV600E。对于所有面板，原始放大倍率：40x;比例尺 = 20 μm。缩写：wks = 周;wt = 野生型;4-HT = 4-羟基他莫昔芬;H&E = 苏木精和曙红;DAB = 3，3'-二氨基联苯胺。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：小鼠组织特异性和可诱导性Braf / Pten转移性黑色素瘤模型中腹股沟淋巴结体积的测量，分割和3D渲染。（B-D）在4-HT治疗后4，5和6周（分别为t0，t1和t2时间点）测量的右腹股沟淋巴结的3D体积的渲染。还报告了体积的数值（以 mm3 为单位）。（E）同一动物的左（黑圈）和右（白圈）腹股沟淋巴结在t0，t1和t2时间点的体积。缩写：3D =三维;4-HT = 4-羟基他莫昔芬。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
本研究获得的数据证明了超声成像监测转移性黑色素瘤Braf / Pten小鼠模型腹股沟淋巴结转移性受累的能力。如前所述16，该技术对于评估药物治疗的疗效特别有用。这是因为它允许通过比较在t1和 t2收集的测量值与在t0处收集的测量值来监测同一动物中淋巴结体积随时间的变化。反过来，这有助于增加所获得结果的稳健性，因为小鼠间变异性和其他可能影响基底淋巴结大小的因素都被考虑在内。此外，超声成像通过减少每个实验组的动物数量来符合3R原理。
在Braf / Pten小鼠中，不仅腹股沟，而且肱骨和腋窝淋巴结都是转移扩散的部位。然而，建议将重点放在腹股沟淋巴结上，因为其他淋巴结离原发性肿瘤部位太近，这通常会在原发性肿瘤本身的发展过程中改变它们的定位和形态。或者，如果选择不同的肿瘤诱导部位（例如耳朵或爪子），臂和腋窝淋巴结可能适合超声成像8。就其他转移部位而言，由于组织中存在空气，因此无法使用超声成像来研究肺部。从理论上讲，只有到达胸膜界面的浅表肺转移才能用这种技术可视化。虽然可以使用微型计算机断层扫描/正电子发射断层扫描（CT/ PET），但这种方法有几个缺点，包括成本高和可用性有限。此外，基于电离辐射，微型CT / PET几乎与多个时间点的纵向测量相容。相反，超声成像可以很容易地应用于皮下转移的研究，并允许测量体积和血管形成16。
如果2周的时间范围太短而无法理解所研究药物的效果，则可以选择更外周的诱导位点（例如，尾部尖端9，11）或不太容易发生肿瘤的基因型（Tyr：：CreER+，BrafCA/+，Ptenlox/+小鼠而不是Tyr：：CreER+，BrafCA/+，Ptenlox/lox小鼠）9.在这两种情况下，原发性肿瘤的生长预计要慢得多，允许在4-HT诱导后进行转移监测远远超过6周。
从更技术的角度来看，重要的是要注意超声图像的2D分割是该协议中最关键的步骤，因为它可能会影响3D体积的测量。幸运的是，在Braf / Pten动物模型中，淋巴结和周围组织之间的对比度非常明显，因此通过手动分割来勾勒淋巴结边界的轮廓相对简单。然而，超声医师获得的高质量超声图像应促进分割过程，而超声医师又应具有丰富的经验，并专注于获取淋巴结的相同超声投影，即使在不同时间点进行的扫描过程中也是如此。
B型超声成像不能直接突出癌细胞;相反，它允许从腹股沟淋巴结体积的增加推断它们的存在。根据这些信息，建议将超声成像与淋巴结的适当IHC染色相结合，以便在分子水平上确认癌细胞的存在。然而，在诱导的Braf/Pten小鼠中观察到的淋巴结肿大通常归因于癌症扩散，而不是其他原因，例如持续感染。这可能是因为用于超声成像的实验小鼠是在受控条件下繁殖的，并且常规接受卫生筛查，以便及时发现和治疗疾病。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢S. Burchielli（FTGM，比萨）在动物手术方面的帮助。这项工作得到了ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica机构对LP的资助;MFAG #17095由AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro授予LP。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
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