Summary
メラノーマは、すぐに他の臓器に広がる非常に攻撃的な病気です。このプロトコルは、転移性黒色腫のBraf/Ptenマウスモデルにおける鼠径リンパ節の体積を監視するために、3Dレンダリングと組み合わせた超高周波超音波イメージングの適用を説明する。
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox遺伝子操作マウス(Braf/Ptenマウス)は、転移性黒色腫のin vivoモデルとして広く使用されている。原発性腫瘍がタモキシフェン治療によって誘導されると、誘導後4〜6週間以内に転移性負荷の増加が観察される。この論文は、超高周波超音波(UHFUS)イメージングを利用して、鼠径リンパ節の体積の増加を測定することによって、鼠径リンパ節の転移性関与の増加を監視する方法を示す。
UHFUSシステムは、UHFUSリニアプローブ(22-55MHz、軸分解能40μm)で麻酔マウスをスキャンするために使用されます。鼠径リンパ節(左右両側)からのBモード画像は、短軸ビューで取得され、動物を背側臥位に位置決めする。超音波記録は、電動機械式アームの44μmステップサイズを使用して取得されます。その後、2次元(2D)Bモード取得が超音波画像後処理用のソフトウェアプラットフォームにインポートされ、取得した断面2D画像において鼠径リンパ節が識別され、半自動的にセグメント化される。最後に、3次元(3D)体積の全再構成が、リンパ節体積のレンダリングとともに自動的に得られ、これも絶対測定値として表される。
この非侵襲的な in vivo 技術は、非常に忍容性が高く、同じ実験動物上で2週間にわたって複数のイメージングセッションをスケジュールすることができます。したがって、転移性疾患に対する薬理学的治療の影響を評価することが理想的である。
Introduction
メラノーマは、しばしば他の皮膚部位(皮下転移)だけでなく、リンパ節、肺、肝臓、脳、骨にも広がる攻撃的な形態の皮膚癌です1。過去10年間で、新薬が臨床現場に導入され、転移性黒色腫患者の平均余命の改善に貢献してきました。しかし、応答までの時間や程度の変動、重篤な副作用、獲得した抵抗の反乱など、限界が残っています1。したがって、転移性の広がりを初期段階、すなわち局所リンパ節に到達したときに検出することが重要です。
局所リンパ節(センチネルリンパ節)の生検は、通常、黒色腫細胞の存在を確認するために行われる。しかし、超音波イメージングは、臨床評価を凌駕し、不必要な生検を回避するのに役立つため、転移性関与を検出する非侵襲的な方法として定着しています2,3,4。さらに、超音波画像は、リンパ節の監視、特に高齢および/または併存疾患の場合に適切であると思われる5,6。超音波分析によって検出され、正常リンパ節と転移性リンパ節の区別を可能にする特徴は、サイズ(体積)の増加、楕円形から円形への形状の変化、不規則なマージン、エコー発生パターンの変化、および変化した(増加した)血管新生7。
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox遺伝子操作マウス(Braf/Ptenマウス)は、転移性黒色腫の組織特異的で誘導可能なモデルとして最近科学界に利用可能になりました8。この動物モデルでは、原発性腫瘍は非常に迅速に発症する:野生型(wt)BrafからBrafV600Eへの切り替えおよびPtenの喪失の誘導後2〜3週間以内に目に見えるようになり、4週間以内に50〜100mm3の体積に達する。次の2週間で、原発性腫瘍の増殖は、他の皮膚部位、リンパ節、および肺における転移性負荷の漸進的な増加を伴う。
Braf/Ptenマウスは、メラノーマ発生に関与するシグナル伝達経路の解剖9,10、起源のメラノーマ細胞の同定11,12,13、標的療法と免疫療法の両方の観点からの新しい治療選択肢の試験など、複数の目的で広く使用されています8,14,15,16。.具体的には、Braf/Ptenマウスを用いて、弱毒化リステリア・モノサイトゲネス(Lmat)が抗黒色腫ワクチンとして作用することを実証した。治療環境で全身投与した場合、Lmatは腫瘍部位に選択的に蓄積するため、全体的な毒性とは関連しない。さらに、原発性黒色腫量の顕著な減少およびリンパ節および肺における転移性負荷の減少を引き起こす。分子レベルでは、Lmatはメラノーマ細胞のアポトーシス死滅を引き起こし、これは少なくとも部分的には、非細胞自律活性(CD4+およびCD8+ Tリンパ球の部位での動員)に起因する16。
Braf/Ptenマウスをメラノーマモデリングに使用すると、原発性腫瘍および皮下転移の増殖をノギス測定によってモニターすることができる。しかし、リンパ節と肺の関与は、代替技術、おそらく研究者が時間の経過とともに同じ動物を追跡できる非侵襲的な技術を使用して調査する必要があります。この論文では、鼠径リンパ節のサイズ(体積)の増加の縦断的モニタリングのための、得られたデータのその後の3D体積分析と相まって、超音波イメージング(図1)の使用について説明する。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、イタリア保健省(動物プロトコル#754/2015-PRおよび#684/2018-PR)によって承認されています。
1. メラノーマ誘発
注:6週齢のTyr::CreER+、BrafCA/+、Ptenlox/lox マウス[B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ(Braf/Pten)]を本研究に使用した(材料表参照)。
- 前述のように、背中上部の剃毛した皮膚に3μLの5mM 4-HTを3日間連続して塗布することにより、マウスを4-ヒドロキシタモキシフェン(4-HT)で治療する11、16、17。
注:これにより、Cre酵素が活性化され、wt BrafからBrafV600Eへの切り替えとPtenの損失が発生します。これらの2つのヒットは、メラノーマ形成を誘発するのに十分である。 - 原発性腫瘍が2〜3週間で皮膚塗装部位に発症し、4週間で50〜100mm3の体積に達することを観察する。また、この時点で他の皮膚部位、リンパ節、肺への転移を観察した(t0)。
- ノギスを使用して原発腫瘍および皮下転移の体積を測定し、超音波イメージングを使用して鼠径リンパ節の体積を測定する。これらの測定を1週間後(t1、皮膚塗装後5週間後)および2週間後(t2、皮膚塗装後6週間後)に繰り返す。
- 最後の時点で、ガス状のセボランを過剰摂取してマウスを安楽死させる。
- 原発性腫瘍およびリンパ節を目視検査によって分析し、次いで、in16で報告されたように、組織学的研究のためにそれらを切除する。
2. 撮影手順
- マウスをガス麻酔用の誘導チャンバーに入れ、動物が完全に麻酔されるまで純酸素中の3%イソフルランを供給する。足のピンチに対する反応の欠如によって麻酔の深さを確認する。
- 動物を加熱したボード(UHFUSイメージングステーションの構成部分)に移し、動物を仰臥位に保ちます。ワセリンで潤滑された直腸プローブを使用して体温を測定します。ボード温度を調整して、マウスの体温を生理学的範囲(36 ± 1°C)に維持します。
- 麻酔中の乾燥を防ぐために獣医軟膏でマウスの目を湿らせます。麻薬性ガス(純酸素中の1.5%イソフルラン)をマウスの鼻マスクを通して供給する。イソフルランの割合を調整して、麻酔の正しい深さを維持します。
- 前足と後足を導電性ペーストでコーティングし、ボードに埋め込まれたECGプレート電極にテープで貼り付けます。生理学的パラメータ(心拍数、呼吸信号、深部体温)が正しく取得され、表示されていることを確認してください。
- 脱毛剤を塗布して両方の鼠径部から脱毛し、音響結合媒体でそれらをコーティングする。
- UHFUSリニアプローブ(40MHzの中心周波数)をUHFUSイメージングステーションに埋め込まれた特殊な3Dモータにクランプし、プローブの自動的かつ段階的な移動を可能にします。
- 超音波プローブの位置を適切に向き、調整して鼠径リンパ節の短軸画像(左/右)を取得し、関心領域を焦点ゾーンに配置します。
- 鼠径リンパ節の全体積を、前述のように、一連の2D Bモード画像としてスキャンします18。マイクロメートルスケールのステップサイズでトランスデューサを直線移動させることによりリンパ節の複数のレベルで画像を取得し、自動的に呼吸および心臓依存性シネループの観点から3Dデータを生成する。
- 次のパラメータで画像記録を設定します:スキャン距離範囲を2〜5mm(リンパ節のサイズによって異なります)。ステップサイズは44μmで、結果は46〜114スキャンステップ/リンパ節スライス、取得時間は動物あたり1〜3分です。取得した画像を生フォーマット(DICOM)でデジタル保存し、オフライン分析をさらに進めます。
- イメージングセッションの最後に、ガス麻酔を中止し、動物が胸骨リカンブルで加熱ボード上で回復するのを許します。それが臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物の世話をしてください。
3. 超音波画像の後処理
- 超音波画像の後処理のためのソフトウェアプラットフォームで左右の鼠径リンパ節のDICOM 3D画像のデータセットを開きます。
- セグメンテーション：
- 「マルチスライス方法」を選択すると、3D 取得中にキャプチャされた各画像に対応するすべてのフレームの現在のフレームとサムネイルの両方が視覚化されます。
- 最初のフレームのサムネールを選択して、輪郭ビューに読み込みます。輪郭ビューで、マウスを左クリックしてリンパ節の境界に沿ってポイントをドロップします。必要なポイント数(範囲 10 ~ 15)を設定したら、右クリックして輪郭を完成させます。
- 最初の輪郭が完成したら、サムネイルビューを使用して、輪郭を描く次の画像を選択します。必要に応じて、輪郭間の複数の画像(平均3フレーム)をスキップして、各3Dボリュームに必要な手動トレースの数を減らします。
注:超音波画像後処理用のソフトウェアプラットフォームは、手動トレース間の輪郭を自動的に生成し、それによって分析時間を短縮します。 - ボリューム全体の輪郭が描かれるまで、このプロセスを繰り返します。完了したら、[ 完了]をクリックします。
- 3Dワイヤーフレームの生成と体積測定:
- 3Dモードウィンドウワークスペースで、画像表示領域の下にある体積測定アイコンをクリックして、サーフェスビューをアクティブにします。
メモ: サーフェスビューは、ユーザーが生成したボリュームを取得したイメージにマップするコンパイルビューを作成します。サーフェスビューは、任意の位置に回転させることができます。 - 立方体ビューの左下隅にリストされている体積測定値を書き留めます。
注:セグメンテーションと3Dボリューム生成は、カスタム開発のソフトウェアおよび/または一般的な画像処理用の自由に入手可能な/商用ソフトウェアを使用して取得することもできます。手動セグメンテーションから始めて、ソフトウェアはリンパ節輪郭の数学的および/またはピクセルレベルの記述を提供する必要があります。これらの輪郭は、リンパ節の外面をレンダリングするために3D空間で結合される。画像化手順および超音波画像の後処理で説明されるすべてのステップは、 図2に要約される。
- 3Dモードウィンドウワークスペースで、画像表示領域の下にある体積測定アイコンをクリックして、サーフェスビューをアクティブにします。
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Representative Results
Tyr::CreER+、BrafCA/+、Ptenlox/loxマウスの4-HTの皮膚塗装後、Cre活性が誘導され、そのためにゲノムレベルでwt BrafからBrafV600Eへのスイッチがあり、Ptenは失われる(図3A)。2〜3週間で、マウスは100%の浸透度を有するオンサイト原発性腫瘍を発症する。4-HT治療(t0)から4週間後、原発性腫瘍は50〜100mm3の体積に達し、その増殖はノギスによってさらに2週間測定することができる((t1およびt2;図3B、上パネル)。腫瘍が非常に大きくなり、マウスが安楽死を必要とするため、後の時点に達することはできません。
転移性負担に関する限り、4-HT治療から4〜6週間以内に鼠径リンパ節において色素沈着の漸進的な増加が観察される(図3B、下パネル)。このような色素沈着の増加は、メラニン沈着物の存在によるものであり、メラニンを除去することなく行うヘマトキシリンおよびエオジン染色によって確認することができる。次に、メラニン沈着物は、メラノーマ抗原MLANAおよびBRAFV600Eの免疫組織化学的(IHC)染色によって確認されるように、転移したメラノーマ細胞の存在に常に起因する(図3C)。
鼠径リンパ節内の色素性黒色腫細胞の蓄積は、目視検査によって明らかなように、それらの体積の漸進的な増加を伴う(図3B、下パネル)。超音波イメージングは、前述のように、各実験マウスにおいて、このような増加を縦方向に定量化するユニークな機会を提供する16。体積測定、セグメンテーション結果、および3Dレンダリングはすべて、代表的なケースを参照して 図4に示されています。各リンパ節の体積は、3Dスキャン中に取得された軸方向切片の手動セグメンテーションによって得られる。
セグメンテーション段階の終わりに、全ての切片はリンパ節の外部輪郭のオーバーレイを示す(図4A)。これらの輪郭はレンダリングフェーズでフレームごとに接続され、リンパ節全体の外面が3D空間に投影されます。代表例として、t0、t1、およびt2で分析された右鼠径リンパ節の3Dレンダリングを、それぞれ図4B、図4C、および図4Dに示す。図4Eのグラフは、同じ動物の左右の鼠径リンパ節によって表示される体積の増加を経時的に定量化する。
図1:メラノーマのBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルにおける鼠径リンパ節の体積の増加を監視するために使用される超音波画像化システム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:超音波画像のイメージング手順と後処理のステップバイステップの概要。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスの組織特異的および誘導性Braf/Pten転移性黒色腫モデルにおける鼠径リンパ節の目視検査および組織学的解析。 (A)Cre酵素は、wt BrafのBrafV600Eへの切り替えおよびPtenの喪失(エクソン4および5の切除)を引き起こす。この系がメラノサイト特異的なのは、Cre酵素の発現がメラニン合成に関与する酵素であるチロシナーゼのプロモーターの制御下にあるからである。したがって、2つの発癌性ヒットは、メラニン球系に限定される。Creはエストロゲン受容体との融合タンパク質として発現し、4-HTによる皮膚の塗毛を核に転座させ、そこでその機能を発揮できるため、この系も誘導可能である。(B)4-HT治療後4、5、6週間後の原発性黒色腫腫瘍(上段の写真)および鼠径リンパ節(下の写真)の出現(それぞれt0、t1、およびt2)。リンパ節では、メラニンの蓄積およびサイズの増加が目視によって検出される。スケールバー = 0.5 cm (上の画像);0.2センチメートル(下の写真)。(C)4-HT治療後6週間の鼠径リンパ節の組織学的解析。(左上)H&E染色:メラニン沈着物は、スライスを1%KOHおよび3%H2O2と共にインキュベートすることによって除去される。 (右上)メラニン検出は、1%KOHおよび3%H2O2処理なしでH&E染色によって行われる。(左下)免疫ペルオキシダーゼ染色(DAB色原体基質およびヘマトキシリン対比染色)によるMLANA検出。(右下)免疫ペルオキシダーゼ染色(DAB色原体基質およびヘマトキシリン対比染色)によるBRAFV600E検出。すべてのパネルについて、元の倍率:40倍。スケールバー = 20 μm。省略形: wks = 週;wt = 野生型;4-HT=4-ヒドロキシタモキシフェン;H&E = ヘマトキシリンおよびエオジン;DAB=3,3'-ジアミノベンジジン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マウスの組織特異的および誘導性Braf/Pten転移性黒色腫モデルにおける鼠径リンパ節の体積の測定、セグメンテーション、および3Dレンダリング。 (A)手動セグメンテーションによって得られた4つの代表的なスキャン切片における右鼠径リンパ節の外部輪郭のオーバーレイ。(B-D)4-HT処置後4、5、および6週目で測定した右鼠径リンパ節の3D体積のレンダリング(それぞれt0、t1、およびt2時点)。体積の数値も報告されます(mm3)。(e)t0、t1、およびt2時点における同じ動物の左(黒丸)および右(白丸)鼠径リンパ節の体積。略語: 3D = 3次元;4-HT=4-ヒドロキシタモキシフェン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究で得られたデータは、転移性黒色腫のBraf/Ptenマウスモデルの鼠径リンパ節の転移性関与を監視する超音波イメージングの能力を証明している。前に示したように16、この技術は、薬物治療の有効性を評価するのに特に有用である。これは、t1および t2で収集された測定値をt0で収集された測定値と比較することによって、同じ動物におけるリンパ節容積の経時的な変化のモニタリングを可能にするからである。これは、マウス間の変動性および基底リンパ節のサイズに影響を与える可能性のある他の要因がすべて考慮されるため、得られた結果のロバスト性の増加に寄与する。さらに、超音波イメージングは、実験群あたりの動物数を減らすことによって、3R原理への準拠を可能にする。
Braf/Ptenマウスでは、鼠径部だけでなく、上腕および腋窩リンパ節も転移性拡散の部位である。しかし、他のものは原発性腫瘍部位に近すぎるため、鼠径リンパ節に焦点を当てることが賢明であり、原発性腫瘍自体の発症中にその局在および形態が通常変化する。あるいは、上腕リンパ節と腋窩リンパ節は、耳や足などの腫瘍誘発の異なる部位が選択された場合、超音波イメージングに適している可能性があります8。他の転移部位に関する限り、肺は、組織内に空気が存在するため、超音波画像を使用して研究することはできない。理論的には、胸膜界面に到達する表在性肺転移のみがこの技術で視覚化され得る。代わりにマイクロコンピュータ断層撮影/陽電子放射断層撮影法(CT/PET)を使用することもできますが、このアプローチには、高いコストと限られた可用性を含むいくつかの欠点があります。さらに、電離放射線に基づいているため、マイクロCT/PETは複数の時点での縦断測定とほとんど互換性がありません。逆に、超音波イメージングは皮下転移の研究に容易に適用することができ、体積と血管新生の両方の測定を可能にします16。
2週間の時間枠が短すぎて研究中の薬物の効果を理解できない場合、より末梢誘導部位(例えば、尾の先端9,11)または腫瘍を起こしにくい遺伝子型(Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/+マウスではなく、Tyr::CreER+、BrafCA/+、Ptenlox/+マウス)を選択することができます9。.どちらの場合も、原発巣の増殖ははるかに遅くなると予想され、4-HTによる誘導後6週間をはるかに超える転移モニタリングを可能にする。
より技術的な観点からは、超音波画像の2Dセグメンテーションは、3Dボリュームの測定に影響を与える可能性があるため、このプロトコルの最も重要なステップであることに注意することが重要です。幸いなことに、Braf/Pten動物モデルでは、リンパ節と周囲の組織のコントラストが非常に顕著であるため、手動セグメンテーションによるリンパ節境界の輪郭は比較的簡単です。しかし、セグメンテーションプロセスは、ソノグラファーによって取得された高品質の超音波画像によって促進されるべきであり、ソノグラファーは、異なる時点で実行されるスキャンセッションにおいても、リンパ節の同じ超音波投影を取得することに高い経験と焦点を当てるべきである。
Bモード超音波イメージングは、がん細胞を直接強調表示することはできません。代わりに、それは鼠径リンパ節の体積の増加からそれらの存在の推論を可能にする。この情報に照らして、超音波イメージングをリンパ節の適切なIHC染色と組み合わせて、癌細胞の存在を分子レベルで確認することが推奨される。しかし、誘導されたBraf/Ptenマウスで観察されたリンパ節拡大は、典型的には、癌の蔓延に起因するものであり、他の何らかの原因、例えば進行中の感染に起因するものではない。これは、超音波イメージングに使用される実験マウスが制御された条件下で飼育され、日常的に衛生スクリーニングを受けるため、病気が迅速に発見され治療されるためである可能性が高い。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、動物の処置に関する彼女の支援について、S. Burchielli(FTGM、Pisa)に感謝したい。この作業は、LPへのISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologicaの機関資金によって支援されました。MFAG #17095 AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro が LP に授与。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
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