Целью этого протокола является объяснение и демонстрация разработки трехмерной (3D) микрофлюидной модели высокоровневой сердечной ткани человека, состоящей из кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, совместно культивируемых с сердечными фибробластами (FF) в биомиметическом гидрогеле на основе коллагена, для применения в инженерии сердечной ткани, скрининге лекарств и моделировании заболеваний.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Разработка 3D-организованной сердечной ткани человека в рамках микрофлюидной платформы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Основной причиной смерти во всем мире по-прежнему является сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ). Тем не менее, моделирование физиологической и биологической сложности сердечной мышцы, миокарда, как известно, трудно выполнить in vitro. В основном, препятствия заключаются в потребности в кардиомиоцитах человека (КМ), которые либо являются взрослыми, либо демонстрируют взрослые фенотипы и могут успешно воспроизводить клеточную сложность миокарда и сложную 3D-архитектуру. К сожалению, из-за этических проблем и отсутствия доступной первичной сердечной ткани человека, полученной от пациента, в сочетании с минимальным распространением КМ, поиск жизнеспособных человеческих КМ был ограничивающим шагом для инженерии сердечной ткани. С этой целью большинство исследований перешли к сердечной дифференцировке индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) в качестве основного источника ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ СМ, что привело к широкому включению hiPSC-CMs в анализы in vitro для моделирования сердечной ткани.
Здесь, в этой работе, мы демонстрируем протокол для разработки 3D-зрелой сердечной ткани человека, полученной из стволовых клеток, в микрофлюидном устройстве. Мы специально объясняем и визуально демонстрируем производство 3D-модели анизотропной сердечной ткани in vitro на чипе из КМ, полученных из hiPSC. Мы в первую очередь описываем протокол очистки для выбора для КМ, ко-культуру клеток с определенным соотношением путем смешивания КМ с человеческими ХФ (hCF) и суспензию этой кокультуры в гидрогеле на основе коллагена. Далее мы демонстрируем инъекцию нагруженного клетками гидрогеля в наше четко определенное микрофлюидное устройство, встроенное в шахматном порядке эллиптические микропосты, которые служат топографией поверхности, чтобы вызвать высокую степень выравнивания окружающих клеток и гидрогелевой матрицы, имитируя архитектуру нативного миокарда. Мы предполагаем, что предлагаемая 3D-анисотропная модель сердечной ткани на чипе подходит для фундаментальных биологических исследований, моделирования заболеваний и, благодаря ее использованию в качестве инструмента скрининга, фармацевтического тестирования.
Введение
В последние годы широко изучены подходы к тканевой инженерии для сопровождения клинических результатов in vivo в регенеративной медицине и моделировании заболеваний1,2. Значительное внимание было уделено моделированию сердечной ткани in vitro из-за присущих трудностей в поиске первичной сердечной ткани человека и производстве физиологически значимых суррогатов in vitro, ограничивая фундаментальное понимание сложных механизмов сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ)1,3. Традиционные модели часто включали 2D-анализы монослойной к....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Выполнять все обработки клеток и подготовку реагентов в шкафу биобезопасности. Убедитесь, что все поверхности, материалы и оборудование, которые вступают в контакт с клетками, стерильны (т. Е. Распыляйте 70% этанола). Клетки следует культивировали в увлажненный инкубатор при 37 °C, 5% CO2. Вся культура и дифференциация hiPSC выполняется в 6-скважинных пластинах.
1. Создание микрофлюидного устройства (приблизительная продолжительность: 1 неделя)
-
фотолитография
ПРИМЕЧАНИЕ: Маска, разработанная с использованием файла CAD (предоставляется в виде дополнительного файла 1),содержит констру....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для получения высокоочищеной популяции КМ из hiPSCs используется модифицированная версия, включающая комбинацию протокола дифференциацииЛиан 33 и этапов очистки Тохьямы34 (см. Фиг.1A для экспериментальной временной шкалы). HiPSCs должны быть колониеобразными, ~85% слизыми и равномерно распространяться по всей культуре хорошо через 3-4 дня после прохождения, в начале дифференциации CM(рисунок 1B). В частности, в Ден.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Формирование модели сердечной ткани человека in vitro с усиленными клеточными взаимодействиями и биомиметической 3D-структурой является обязательным для фундаментальных сердечно-сосудистых исследований и соответствующих клинических применений1. Этот описанный протокол объясняет развитие 3D-анизотропной сердечной ткани человека в микрофлюидном устройстве с использованием кокультуры КМ, полученных из стволовых клеток, с соединительными КФ, инкапсулированными в гидрогель коллагена, служащими.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC), New Investigator Award (ADHS18-198872) и Flinn Foundation Award за предоставление источников финансирования для этого проекта. Линия hiPSC, SCVI20, была получена от Джозефа С. Ву, доктора медицинских наук, доктора философии в Стэнфордском сердечно-сосудистом институте, финансируемом NIH R24 HL117756. Линия hiPSC, IMR90-4, была получена из WiCell Research Institute55,56.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифужные пробирки объемом 0,65 мл | VWR | 87003-290 | |
| 1 мм Биопсийный пуансон | VWR | 95039-090 | |
| 1,5 мм Биопсийный пуансон | VWR | 95039-088 | |
| 15 мл Соколиные пробирки | VWR | 89039-670 | |
| 18x18 мм покровные стекла | VWR | 16004-308 | Покровные стекла должны быть No 1, чтобы обеспечить большое увеличение изображения |
| 4% параформальдегид | ThermoFisher | 101176-014 | |
| 6-луночный плоский боттом для тканевых культуральных планшетов | VWR | 82050-844 | |
| B27 минус инсулин | LifeTech | A1895602 | |
| B27 плюс инсулин | LifeTech | 17504001 | |
| CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
| Коллаген I, крысиный хвост | Corning | 47747-218 | |
| DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
| DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
| E8 | ThermoFisher | A1517001 также может быть изготовлен на месте | |
| EDTA | VWR | 45001-122 | |
| Этанол | |||
| FGM3 | VWR | 10172-048 | |
| GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
| Глицин | Сигма | G8898-500G Сыворотка | |
| для коз | VWR | 10152-212 | |
| hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
| IPA | |||
| IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
| Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
| MTCS | Sigma | 440299-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
| чашка Петри (150x15мм) | VWR | 25384-326 | |
| Чашка Петри (60x15мм) | VWR | 25384-092 | |
| Фенол красный | Сигма | P3532-5G | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
| RPMI 1640 минус глюкоза | VWR | 45001-110 | |
| Кремниевые пластины (100 мм) | University Wafer | 1196 | |
| Лактат натрия | Sigma | L4263-100ML | |
| SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 Проявитель | ThermoFisher | NC9901158 | |
| Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
| T75 колбы | VWR | 82050-856 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
| трипсин-ЭДТА (0,5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Y-27632 | Технологии стволовых клеток | 72304 | |
| EVG620 Выравниватель | EVG | ||
| Очиститель плазмы PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Zeiss AxioObserver Z1 Микроскоп | Nikon | ||
| Leica SP8 Конфокальный микроскоп | Leica |
Ссылки
- Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
- Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimen....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
