Sphingolipids هي مستقلبات نشطة بيولوجيا لها أدوار راسخة في الأمراض البشرية. يمكن أن يكشف توصيف التغيرات في الأنسجة باستخدام قياس الطيف الكتلي عن أدوار في مسببات المرض أو تحديد الأهداف العلاجية. ومع ذلك ، فإن مركب OCT المستخدم للحفظ بالتبريد في المستودعات الحيوية يتداخل مع قياس الطيف الكتلي. نحدد طرقا لتحليل الدهون السفينغولية في الأنسجة البشرية المضمنة في OCT باستخدام LC-ESI-MS / MS.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحضير الأنسجة البشرية المضمنة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل لتحليل مطياف الكتلة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Sphingolipids هي مكونات خلوية لها أدوار راسخة في التمثيل الغذائي البشري والمرض. يمكن استخدام قياس الطيف الكتلي لتحديد ما إذا كانت الدهون السفينغولية تتغير في المرض والتحقيق فيما إذا كان يمكن استهداف السفينغوليبيدات سريريا. ومع ذلك ، فإن الدراسات المستقبلية التي تعمل بالطاقة بشكل صحيح والتي تكتسب الأنسجة مباشرة من الجناح الجراحي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ، وتحديا تقنيا ولوجستيا وإداريا. في المقابل ، يمكن للدراسات بأثر رجعي الاستفادة من العينات البشرية المحفوظة بالتبريد المتاحة بالفعل ، عادة بأعداد كبيرة ، في المستودعات الحيوية للأنسجة. تشمل المزايا الأخرى لشراء الأنسجة من المستودعات الحيوية الوصول إلى المعلومات المرتبطة بعينات الأنسجة بما في ذلك الأنسجة وعلم الأمراض وفي بعض الحالات المتغيرات السريرية المرضية ، والتي يمكن استخدامها جميعا لفحص الارتباطات مع بيانات الدهون. ومع ذلك ، فإن القيود التقنية المتعلقة بعدم توافق مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) المستخدم في الحفظ بالتبريد وقياس الطيف الكتلي هي حاجز تقني لتحليل الدهون. ومع ذلك ، فقد أظهرنا سابقا أنه يمكن إزالة OCT بسهولة من عينات المستودع الحيوي البشري من خلال دورات الغسيل والطرد المركزي دون تغيير محتواها من السفينغوليبيد. لقد أثبتنا سابقا أن الدهون السفينغولية في الأنسجة البشرية المحفوظة بالتبريد في OCT مستقرة لمدة تصل إلى 16 عاما. في هذا التقرير ، نحدد الخطوات وسير العمل لتحليل الدهون السفينغولية في عينات الأنسجة البشرية المضمنة في OCT ، بما في ذلك أنسجة الغسيل ، ووزن الأنسجة لتطبيع البيانات ، واستخراج الدهون ، وإعداد العينات للتحليل بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة التأين بالرش الكهربائي لقياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-ESI-MS / MS) ، تكامل بيانات قياس الطيف الكتلي ، تطبيع البيانات ، وتحليل البيانات.
المقدمة
Sphingolipids هي مستقلبات نشطة بيولوجيا معروفة بأدوارها في التمثيل الغذائي البشري والمرض 1,2. أنها تنظم العمليات الخلوية المعقدة مثل هجرة الخلايا ، وبقاء الخلية وموتها ، وحركة الخلايا ، والاتجار الحويصلي ، والغزو الخلوي وورم خبيث ، وتكوين الأوعية ، وإنتاج السيتوكينات1،2،3،4،5،6،7،8،9 . تساهم العيوب في تنظيم استق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على أنسجة الرئة البشرية غير المحددة الهوية من جامعة فرجينيا كومنولث (VCU) الأنسجة والحصول على البيانات وتحليلها الأساسية بموجب بروتوكول (IRB) المعتمد من مجلس المراجعة الداخلية (IRB) (#HM2471). تمت الموافقة على استخدام الفئران للبحث وحصاد أنسجة الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لجامعة فرجينيا كومنولث.
1. تحضير المواد
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوات قبل يوم واحد من غسل الأنسجة.
- قم بالتسمية المسبقة ووزن أنابيب الطرد المركزي المصنوعة من مادة البولي بروبيلين سعة 1.5 مل مع رموز معرف موجزة ولكن واضحة لكل عينة ستتم معالجتها في اليوم التالي. استخدم علامة دائمة مقاوم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذا البروتوكول ، نصف بالتفصيل طريقة لإزالة OCT من الأنسجة البشرية المحفوظة بالتبريد ووزن الأنسجة لتحليلها بواسطة LC-ESI-MS / MS. يتم سرد المواد المطلوبة لهذا الإجراء في جدول المواد. يظهر في الشكل 1 نتائج تجربة نموذجية حيث تم غسل 10 أورام غدية رئوية بشرية و 10 أنسجة مجاورة طبيعية لإزالة OCT وتحليلها بواسطة LC-ESI-MS / MS. الأهم من ذلك ، كما أوضحنا سابقا11 ، هناك أنواع مختلفة بطول السلسلة من السيراميد (الشكل 1 أ) وأحادي الهكسوسيل سيراميد (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
OCT هو عامل شائع للحفاظ على التبريد على المدى الطويل يستخدم في المستودعات الحيوية. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي OCT إلى قمع الأيونات عندما يتم تحليل الأنسجة بواسطة منصات قياس الطيف الكتلي المختلفة12،13،14،15 ، أو يؤدي إلى فقدان الإشارة عند تحليل العينات بواسطة LC-ESI-MS /MS 11. يمكن أن يتداخل OCT في الأنسجة المحفوظة بالتبريد أيضا مع طرق تطبيع الأنسجة مثل الوزن ومقايسات قياس ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تقديم الخدمات والدعم للمشروع البحثي من قبل مركز VCU Massey للسرطان للحصول على الأنسجة والبيانات وتحليلها الأساسية و VCU Lipidomics and Metabolomics Core ، والتي يتم دعمها جزئيا بتمويل من منحة دعم مركز السرطان NIH-NCI P30CA016059. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R21CA232234 (سانتياغو ليما).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 مل أطراف ماصة البولي بروبلين | NA | NA تستخدم لاسترداد العينات | |
| 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبلين | NA | NA NA | |
| 10 مل قارورة Erlenmeyer | VWR | 89091-116 | تستخدم لوزن الأنبوب والأنسجة |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | برنامج Sciex | NA | لتحليل ودمج بيانات MS |
| الأمونيوم | فيشر Scientific | A11550 | لمراحل LC المتنقلة |
| مقياس تحليلي | NA | مقياس دقيق حتى 0.1 مجم | |
| موزع علوي للزجاجة | Sartorius | LH-723071 | يستخدم لتوزيع المذيبات |
| C12-Ceramide (d18: 1 / C12: 0) ؛ N- (دوديكانويل) -sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | المعيار الداخلي |
| C12-glucosylceramide (d18: 1/12: 0) ؛ N- (دوديكانويل) -1- & بيتا ؛ -جلوكوزيل-سفينغ-4-إيين | أفانتي القطبية للدهون | LM2511 | المعيار الداخلي |
| C12-lactosylceramide (d18: 1/12: 0) ؛ N- (dodecanoyl) -1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | المعيار الداخلي |
| C12-Sphingomyelin (d18: 1 / C12: 0) ، N- (dodecanoyl) -sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | المعيار الداخلي |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal أغطية الاحتواء الحيوي | 75007309 علمي حراري | لمنع التلوث البيولوجي أثناء الطرد المركزي | |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | مزيل التلوث |
| CTO-20A / 20AC عمود فرن | Shimadzu | NA | ل LC |
| d17: 1-Sphingosine ؛ (2S ، 3R ، 4E) -2-aminoheptadec-4-ene-1،3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | المعيار الداخلي |
| d17: 1-Sphingosine-1-phosphate ؛ heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | معيار |
| داخلي DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| أنابيب الثقافة القابل للتصرف 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13x100 مم أنابيب |
| حمام مائي ساخن | NA | NA لاستخراج الدهون بين عشية وضحاها | |
| الخالط 150 | فيشر ساينتفيك | 15-340-167 | الأنسجة الثلاثية |
| الخالط البلاستيك المولد القابل للتصرف | مسبار فيشر Scientific | 15-340-177 | للتجانس |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | الأنسجة المختبرية المستخدمة في صنع الفتائل |
| الميثانول LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD نظام المضخة الثنائية | Shimadzu | NA | ل LC-MS |
| علامة دائمة | VWR | 52877-310 | |
| إغلاق الخيط اللولبي الفينولي ، Kimble Chase (أغطية لأنابيب الثقافة التي تستخدم لمرة واحدة) | VWR | 89001-502 | 13x100 مم أغطية الأنبوب العلوي اللولبي |
| الفوسفات المالح | الحراري العلمي | 10010023 | لاسترداد العينات من الأنابيب بعد الغسيل |
| ماصة مكرر | Eppendorf | 4987000118 | للاستغناء عن المعايير الداخلية LC-MS |
| أغطية لولبية ، أزرق ، أحمر PTFE / أبيض سيليكون | VWR | 89239-020 | أغطية قارورة حاقن ذاتي |
| قارورة زجاجية لولبية مع تصحيح معرف | VWR | 46610-724 | قوارير حاقن ذاتي |
| SIL-30AC حاقن ذاتي | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo | Scientific SPD2030P1220 | لتجفيف المذيبات |
| Supelco 2.1 (ID) × 50 مم Ascentis Express C18 العمود | Sigma Aldrich | 581300-U | ل LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS / MS SYSTEM | SCIEX | NA | ل LC-ESI-MS / |
| MS حمام مائي بالموجات فوق الصوتية | برانسون | موديل 2800 | لتجانس وإعادة تعليق الدهون المستخرجة والمجففة |
| Vortexer | NA | NA | ل sOCTrP وتعليق الدهون المجففة |
| VWR أنابيب ثقافة البورسليكات المتاح | VWR | 47729572 | أنابيب ثقافة الزجاج 13x100 |
| المياه Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
المراجع
- Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
