Summary
本プロトコールでは、細胞周期のS/G2期におけるDNA二本鎖末端切除を免疫蛍光ベースの方法を用いて可視化する方法を実証する。
Abstract
DNA損傷応答(DDR)の研究は複雑で不可欠な分野であり、がん治療にDDR標的薬を使用することで重要性が増しています。これらの標的はポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PRP)であり、様々な形態のDNA修復を開始する。PARP阻害剤(PARPi)を用いてこれらの酵素を阻害することは、乳癌1型(BRCA1)、BRCA2、またはBRCA2のパートナーおよび局在化器(PALB2)の変異による相同組換え(HR)欠損細胞に治療上の脆弱性を与えることによって合成致死性を達成する。
PARPiで処理された細胞は、DNA二本鎖切断(DSB)を蓄積する。これらの切断はDNA末端切除機構によって処理され、一本鎖(ss)DNAの形成およびその後のDNA修復につながる。BRCA1欠損の状況では、53BP1やDYNLL1などのDNA切除阻害剤の変異を介してDNA切除を再活性化すると、PARPi耐性が引き起こされます。したがって、 セルロ のDNA切除をモニターできることは、DNA修復経路のより明確な理解と、PARPi耐性を克服するための新しい戦略の開発にとって重要です。免疫蛍光(IF)ベースの技術により、DNA損傷後のグローバルDNA切除のモニタリングが可能になります。この戦略には、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)によるロングパルスゲノムDNA標識が必要です。DNA損傷およびDNA末端切除に続いて、得られた一本鎖DNAは、天然条件下で抗BrdU抗体によって特異的に検出される。さらに、DNA切除は、細胞周期の様々な段階を区別するために細胞周期マーカーを用いて研究することもできる。S/G2期の細胞はHR内の末端切除の研究を可能にするが、G1細胞は非相同末端結合(NHEJ)の研究に使用することができる。細胞周期弁別に結合されたこのIF法の詳細なプロトコルは、この論文に記載されている。
Introduction
DNA修復因子の調節は、特にDNA DSB修復不全腫瘍環境において、がん治療のための絶えず進化する方法である。特定の修復因子の阻害は、DNA損傷物質に対して癌細胞を感作するために使用される独創的な戦略の1つである。何十年にもわたる研究の結果、DNA修復遺伝子のさまざまな変異が、治療戦略の選択のためのバイオマーカーとして同定されました1。その結果、DNA修復分野は、幅広い治療を確実にするための医薬品開発のハブとなり、個別化医療の概念を強化しています。
DSBは、NHEJとHR2の2つの主要な経路によって修復されます。NHEJ経路はエラーが発生しやすく、DNAエンドプロセシングをほとんどまたはまったく行わずに2つのDNA末端を迅速にライゲーションし、プロテインキナーゼ(DNA-PKcs)、Ku70/80複合体、53BP1、およびRIF1タンパク質3が関与します。対照的に、HRはBRCA14によって開始された忠実なメカニズムです。HR修復に不可欠なステップはDNA末端切除プロセスであり、これは3'-OH末端を有する一本鎖(ss)DNAにつながる切断末端の分解である。BRCA1は、5'~3'DNA切除に関与する切除体MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1を形成する下流タンパク質のリクルートを促進します5。
初期末端切除は、MRE11のエンドヌクレアーゼ活性を介して達成され、DNA2およびEXO1ヌクレアーゼによるさらなる処理を可能にする。生成されたssDNAオーバーハングは、レプリケーションプロテインA(RPA)によって迅速にコーティングされ、さらなる処理から保護されます。続いて、BRCA2、PALB2、およびBRCA1は、RPAの変位および相同性指向性修復機構に必要なRAD51ヌクレオフィラメントの組み立てを媒介するために関与する。NHEJとHRの使用の微妙なバランスは、ゲノム完全性の最適な維持のために必要である。経路の選択は、細胞周期の段階に依存する。HRは、DNA切除が最高レベルにあるS期からG2期にかけて優先的に使用され、姉妹染色分体が適切な修復を確実にするために利用可能である。
ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1(PARP-1)は、DSBにリクルートされた最も初期のタンパク質の1つである。これは、切除活性とNHEJ5,6に関与する下流エフェクターの組み立ての両方を調節する。PARP-1は、複製中のDNA一本鎖切断修復にも必要です7,8。DNA修復におけるその重要な役割のために、PARP阻害剤(PARPi)は癌治療として使用されている。いくつかのHR欠損がんにおいて、PARPi治療は、代替経路を介して蓄積された損傷を修復するHR欠損細胞の能力がないため、合成致死的応答をもたらす9,10。現在、FDAが承認したPARPiは、オラパリブ、ルカパリブ、ニリパリブ、タラゾパリブ(BMN 673とも呼ばれる)の4種類で、乳がんや卵巣がんのさまざまな治療に使用されています11。しかし、PARPi耐性は一般的であり、1つの潜在的な原因は、HR能力の再獲得によって生じる12。照射の存在下でのPARP−1の喪失または阻害は、切除体機構を調節不全にし、より長いssDNA経路の蓄積をもたらす13。したがって、インビボでのDNA切除の詳細な研究は、DNA修復経路のより明確な理解と、その後のがん治療およびPARPi耐性を克服するための新しい戦略の開発にとって重要である。
DNA切除イベントを検出するためにいくつかの方法が採用されています5。そのような方法の1つは、抗RPA抗体を使用してストレス誘発DSB後に切除されたDNAの間接染色および可視化を可能にする古典的なIFベースの技術である。ゲノムDNAを5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)で標識し、ssDNAのみを検出することは、DNA切除事象の直接測定です。これは、DNA複製などの複数の細胞プロセスに関与するRPAのモニタリングを回避します。本明細書に記載の方法では、単一細胞周期の間BrdUと共にインキュベートされた細胞は、BrdUが複製細胞DNAの1本の鎖に組み込まれることを可能にする。切除に続いて、IF染色は、抗BrdU抗体の使用により、ssDNA形態においてのみBrdU検出を可能にする条件下で行われる。この抗体は、露出したBrdUヌクレオチドにのみアクセスでき、二本鎖DNAに組み込まれたものは検出しません。蛍光顕微鏡を用いて、切除されたDNAを点状BrdU/ssDNA病巣の形で可視化することができる。これらの病巣の核強度は、DNA損傷後の切除を定量化するための読み出しとして使用することができる。この論文では、ほとんどの哺乳動物細胞株に適用できるこの方法のプロセスを段階的に説明します。この方法は、セル ロのDNA末端切除をモニタリングする簡単な方法として、概念実証として幅広い有用性を持つべきである。
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Protocol
1. 細胞培養、処理、およびカバースリップの準備
注: すべての細胞プレーティング、トランスフェクション、および処理は、照射を除き、滅菌細胞培養フードの下で行う必要があります。
- 1日目
- 6 ウェルプレートに、各ウェルに 1 つのカバースリップを 1 つの条件だけ配置し、必要な条件だけ配置します。必要に応じて、トランスフェクションまたは薬物処理のための〜150,000個のHeLa細胞をプレート化します。
注: トランスフェクションを行う場合は、めっき時に逆方向トランスフェクションを行うか、めっきの数時間後に順方向トランスフェクションを実行して付着性を保つことをお勧めします。逆トランスフェクションは、細胞が加えられる前にトランスフェクションミックスをカバースリップに加えることによって達成されます。したがって、トランスフェクションは細胞が接着し始める前に開始されます。対照的に、フォワードトランスフェクションは、通常翌日に表面に付着後のトランスフェクションミックスを添加することです。しかし、細胞が接着するのに十分な時間が与えられれば、これを同じ日に行うことができる。 - この方法のために、4つのウェルを使用する:ウェル1:siRNAコントロール(siCTRLと呼ばれる);ウェル2:PARP−1に対するsiRNA(siPARP−1);ウェル3:未処理;ウェル4:照射の1時間前に5 μM BMN673で処理する細胞。
注:このプロトコルでは、すべてのテストは照射条件下で実施されました(セクション1.3を参照)。 - トランスフェクションプロトコルでは最大3日間のインキュベーションが可能ですが、5% CO2加 湿インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。BrdU処理前のインキュベーション時間は、siRNAトランスフェクション効率に依存する。トランスフェクションがない場合、16時間のインキュベーションでカバースリップへの付着と細胞増殖を可能にするのに十分です。
注:インキュベーターの条件は、使用する細胞株に応じて変更することができます。
- 6 ウェルプレートに、各ウェルに 1 つのカバースリップを 1 つの条件だけ配置し、必要な条件だけ配置します。必要に応じて、トランスフェクションまたは薬物処理のための〜150,000個のHeLa細胞をプレート化します。
- 2日目
- 適切な培養培地に終濃度10μMのBrdUを添加し、16時間(1細胞周期)インキュベートする。
注:BrdU溶液はジメチルスルホキシド中で調製される。使用した原液は10mMであり、-20°Cでアリコートに貯蔵される。
- 適切な培養培地に終濃度10μMのBrdUを添加し、16時間(1細胞周期)インキュベートする。
- 3日目
- プレートに総線量5GyのX線照射(例えば、小動物用照射器とベンチトップ型照射器など、照射器の種類によって照射線量が異なります)を照射します。使用した照射器のブランドとモデルについては、 材料表 を参照してください。
- プレートをインキュベーターに戻し、3時間細胞を解放する。
- 3時間のインキュベーション期間中、2つの緩衝液、AおよびB、ならびに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に調製する。
注:緩衝液AおよびBおよびスクロースは、汚染を防ぐために新鮮なスクロース溶液を使用して、固定の日に新鮮に調製する必要があります。- 緩衝液A(抽出前緩衝液)を、 表1に記載の順序(30mL)に従って調製する。
注:1Mスクロースは、汚染を防ぐために使用日に準備する必要があります。 - 表1に記載の順序に従って緩衝液B(細胞骨格剥離緩衝液)(30mL)を調製する。
注:緩衝液Bは、Tween-20およびデオキシコール酸ナトリウム溶液の沈殿を防ぐために、引用された順序で調製されなければならない。 - 4%PFA、1条件あたり2mL(10mL)を、化学フードの下で調製する(表1)。
- 緩衝液A(抽出前緩衝液)を、 表1に記載の順序(30mL)に従って調製する。
2. 事前抽出と固定
注:すべての事前抽出および固定は、氷上または4°Cで組織培養プレートに残っているカバースリップで行われます。カバースリップは、取り付けの最後のステップでのみ持ち上げられます(説明を参照)。
- 抽出前
- 培地を吸引し、細胞を1x PBSで2回注意深く洗浄し、PBSを除去した。2mLの抽出前バッファーAを加え、直ちに4°Cで10分間インキュベートする。
注:バッファー A でのインキュベーション時間が延長されないことが重要です。抽出前バッファーでの長時間のインキュベーションは、カバースリップから剥離した細胞の数の増加をもたらすでしょう。あるいは、4°Cでのインキュベーションの代わりに、氷上でインキュベーションを行うこともできます。 - 吸引によってバッファAを除去します。
メモ: バッファ A を取り外した後はカバースリップを洗わないでください。次の手順に進みます。 - 2mLの細胞骨格ストリッピングバッファーBを加え、直ちに4°Cで10分間インキュベートする。バッファーBを注意深く吸引し、1x PBSで細胞を1回慎重に洗浄する。1x PBSを慎重に吸引します。
- 培地を吸引し、細胞を1x PBSで2回注意深く洗浄し、PBSを除去した。2mLの抽出前バッファーAを加え、直ちに4°Cで10分間インキュベートする。
- 固定
- 化学フードの下に2mLの4%PFAを加えて細胞を固定する。
注:PFAは有毒であり、化学的フードの下で操作する必要があります。 - 細胞を室温で20分間インキュベートする。カバースリップを1x PBSで2回洗い、余分なものを吸引します。
- カバースリップを100%冷メタノールで覆い、-20°Cで5分間インキュベートします。1x PBSで2回洗ってください。
メモ: プロトコルはここで一時停止できます。カバースリップは、1x PBSで4°Cで保存し、必要に応じてプレートをアルミホイルで包むことができます。細胞は、IFプロトコルを継続する前に5日以上保持してはならない。
- 化学フードの下に2mLの4%PFAを加えて細胞を固定する。
3. 透過処理
- 細胞を、0.5% Triton X-100を含む2 mLの1x PBSと共に室温で15分間インキュベートする。カバースリップを2mLの1x PBSで3回洗ってください。
4. 免疫染色
- ブロック手順
- カバースリップあたり 2 mL を使用するのに十分な新鮮なブロッキングバッファー (1x PBS 中の 3% BSA) を準備します。
注: 抗体溶液を作るために、ブロッキングバッファーを 5mL 余分に用意してください。 - 各ウェルに2mLのブロッキングバッファーを加え、室温で1時間インキュベートする。
- カバースリップあたり 2 mL を使用するのに十分な新鮮なブロッキングバッファー (1x PBS 中の 3% BSA) を準備します。
- 一次抗体インキュベーション
- 一次抗体溶液を新鮮なブロッキングバッファーで調製する:BrdU RPN202 1:1000および増殖細胞核抗原(PCNA)1:500、カバースリップあたり100 μL。
注: 抗体を保存するために、22 x 22 mm カバースリップの場合は 75 ~ 100 μL、18 x 18 mm カバースリップの場合は 50 ~ 75 μL と、より小さな容量を使用できます。 - 各カバースリップに、100μLの一次抗体溶液を加える。ピンセットを使用してカバースリップを正方形のパラフィルムで覆い、泡が出ないようにパラフィルムを慎重に配置します。
- プレートをアルミ箔で覆い、加湿チャンバー内で一次抗体を4°Cで一晩インキュベートした。
- パラフィルムの正方形を取り出し、カバースリップを2mLの滅菌1x PBSで3回洗浄する。
- 一次抗体溶液を新鮮なブロッキングバッファーで調製する:BrdU RPN202 1:1000および増殖細胞核抗原(PCNA)1:500、カバースリップあたり100 μL。
- 二次抗体インキュベーション
- 新鮮なブロッキングバッファー中に十分な二次抗体溶液を調製する:抗マウス488蛍光二次A11011(BrdU用)希釈1:800および抗ウサギ568蛍光二次A11011(PCNA用)希釈1:800。
注:使用される色は、実験的なニーズに合わせて変更することができます。使用される特定のブランドは、 材料表に記載されています。 - 各カバースリップに100μLの二次抗体溶液を加え、ピンセットを使用して正方形のパラフィルムでカバースリップを覆い、気泡なしでパラフィルムを慎重に配置する。
- 二次抗体を、アルミニウム箔で覆われたプレートで室温で1時間インキュベートする。
- カバースリップを2mLの1x PBSで3回洗ってください。
- 新鮮なブロッキングバッファー中に十分な二次抗体溶液を調製する:抗マウス488蛍光二次A11011(BrdU用)希釈1:800および抗ウサギ568蛍光二次A11011(PCNA用)希釈1:800。
- 核染色
- 終濃度1 μg/mL(1:1000)で4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む1x PBSのカバースリップあたり2mLの容量を調製する。
- 各カバースリップに2mLのDAPI溶液を加える。カバースリップを室温で10分間インキュベートし、プレートをアルミホイルで覆った。カバースリップを1x PBSで2回洗ってください。
- カバースリップを 1x PBS で覆い、針または細かいピンセットを使用してカバースリップをウェルの底から持ち上げます。余分な液体を拭き取って、片方の端をペーパータオルで軽く叩いて慎重に拭き取ります。
メモ: スライドを落とさないように、または付着セルのある平らな面が用紙に触れないように注意してください。 - 10~20 μLのIF特異的マウント媒体を使用して、カバースリップをスライドに取り付けます。
5. 画像の取得と解析
メモ:画像取得は、いくつかのタイプの蛍光顕微鏡で行うことができます。63倍の油対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡を使用した。ブランドとモデル の材料表 を参照してください。Zスタックは必須ではありませんが、細胞株およびミトコンドリア染色のレベルに応じて使用できます。
- 画像解析
- 画像ごとに、複数の tiff ファイルを作成します。すべての平面をマージしますが、カラーチャンネルは別々に保ちます。これらのファイルをセルプロファイラ(The Broad Institute https://cellprofiler.org/home)にインポートし、スペックルカウントパイプライン(補足ビデオ1)を使用して分析します。
- 画像をアップロードする(補足図S1A)。
- プロジェクトの作成を開始するには、スペックルカウントパイプラインをプログラムにロードし、提供された領域で分析する画像をロードします。
- NamesAndTypes モジュールを使用して、他のモジュールが参照する意味のある名前を各イメージに割り当てます-C01: BrdU チャンネルの表現;C02: PCNA チャネルを表す;C03: DAPI チャネルを表します。
注:これらの識別子は顕微鏡によって異なります。ファイル名には、チャネルを区別するための識別子が必要です。
- 核を識別するために使用するファイルを特定し、それに名前を付けます (必要に応じてこの名前を変更します) (補足図 S1B および補足図 S1C を参照)。
- オブジェクトの直径を 50 ~ 300 ピクセル単位で選択します。これは、核の許容可能なサイズ範囲ですが、画像内の核に合わせて値を変更します。
注: 50 は値が大きすぎて、より小さい核が識別できない可能性があります。同様に、300は、核の大きなグループを1として数えることを可能にするかもしれない。 - 直径範囲外のオブジェクトを破棄して、基準に一致するオブジェクトのみがカウントされるようにします。
- 罫線に接触するオブジェクトを破棄して、フィールド内に部分的にしか存在しないセルを削除します。
- 特定の画像に合わせてしきい値を適用します。例として、次の設定に注意してください。しきい値設定戦略の厳格さに基づいて、しきい値調整係数を変更します。その他の設定には、しきい値戦略が含まれます: グローバル;閾値化方法:大津;2つのクラスまたは3つのクラスのしきい値:2つのクラス。しきい値平滑化スケール: 1;しきい値平滑化係数: 1;しきい値の下限と上限: 0.0 および 1.0;凝集したオブジェクトを区別する方法:形状;凝集したオブジェクト間に分割線を引く方法:伝播。
注: 各パラメーターについて、セル・プロファイラーは、変数設定に補完的な定義と使用可能な可能性を提供します。
- オブジェクトの直径を 50 ~ 300 ピクセル単位で選択します。これは、核の許容可能なサイズ範囲ですが、画像内の核に合わせて値を変更します。
- 病巣を特定する一次対象を特定する(補足図S2A)。
- 次の設定を使用します: 入力画像を選択します: マスクドグリーン;識別されるプライマリオブジェクトに名前を付けました: BrdUFoci;オブジェクトの典型的な直径:1-15;直径範囲外のオブジェクトを破棄します:はい。画像の境界線に触れるオブジェクトを破棄します:いいえ。しきい値戦略:適応性;閾値化方法:大津;2つのクラスまたは3つのクラスのしきい値:3つのクラス。しきい値平滑化スケール: 1;しきい値平滑化係数: 3;平滑化フィルターのサイズ:4。
- 強度を測定する(補足図S2B)。
- 測定する画像を選択します:オリッググリーン。
- [ 別の画像を追加]をクリックします。測定する画像(PCNA)を選択します。測定するオブジェクトを選択します: Nuclei。
注: これは、BrdU および PCNA 強度 (グラフ化される最終データ) を測定するために使用されます。
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Representative Results
このプロトコールでは、ブロモデオキシウリジン(BrdU)ベースのアッセイを使用して、放射線誘発損傷に対するHeLa細胞の切除応答を定量的に測定した。生成されたssDNAトラックは、免疫蛍光染色後に別個の病巣として可視化される(図1A)。次いで、同定された病巣を定量化し、核におけるBrdU染色の総積分強度として表した(図1B、補足図S1、補足図S2、および補足図S3)。病巣数または平均病巣強度を測定することは可能ですが、これは総核強度よりも信頼性が低く、主にBrdU病巣の可変サイズに大きく依存します。
NHEJの結果としての短距離切除とHRの長期切除とを区別するために、抗PCNA抗体を用いて共染色を行い、S期を経る細胞を同定した(図1 および 補足図S4)。PCNAは、DNAポリメラーゼのプロセス性因子として作用し、複製に不可欠なDNAクランプを構成する。PCNAは核内で顕著であり、細胞周期のS期の間に最大発現に達する。したがって、初期のS相では、PCNA信号は低く、粒度の分布を有する。対照的に、後期S相では、PCNA染色は非常に強い(図1A)。PCNA(S相)信号を最初に分析するときは、核を特定し、PCNA強度を測定する必要があります。
得られた値は、次に、PCNA陽性核とPCNA陰性核を区別するためのカットオフ強度を最もよく決定するために散布図としてプロットされる(補足図S4A)。PCNA陰性の結果はデータセットから削除され、条件に関係なくBrdU信号が低いため、BrdU強度ベースの解析が可能になります(補足図S4B)。これらの実験条件において、PCNA陰性核は、900単位の任意の単位(A.U.)のBrdU病巣の基礎積分強度を有する。しかし、この値はPCNA陽性核では1800 A.U.に達する(図1B)。これは、BrdU病巣の積分信号の量が100%増加したことを表す。BrdU強度の増加は、DNA切除の増加と相関することができ、これは、細胞がS期およびG2期を通過して照射されるときにより顕著かつ効率的である。
このプロトコールでは、照射後のDNA切除(5Gy)の増加を実証するために、siRNAノックダウン条件を用いたPARP−1の喪失を介して、またはタラゾパリブ(BMN673)を用いたPARP−1の強力な阻害後に、PARP−1活性を調節した(図2 および 補足図S5)。各条件において切除されたDNAの量を、IF後に定量した(図2B)。非摂動状態(siCTRL)では、核当たりのBrdU病巣の積分強度は、PCNA陽性核において約1500A.U.である(図2A、B)。siRNAを用いたPARP-1の効率的なノックダウン(図2C)の後、BrdU病巣の強度の約1900 A.U.までの有意な増加が観察され、これは強度の26%の増加(p ˂ 0.0001)に相当する。同様に、BMN673(5μM最終濃度)を用いたPARP−1の阻害後、病巣の強度は約1750から2500A.U.に増加し、病巣強度の43%増加(p ˂ 0.0001)に相当する。したがって、PARP−1の喪失は、以前に報告されたようにDNA切除を調節不全にする13。
BMN-673はPARP-1の活性を阻害し、DNAにトラップすること、そしてこの処理の効果は細胞にとってはるかに有害であり、その結果、siRNA処理細胞よりもBrdU強度のより大きな増加をもたらすことを覚えておくことが重要です。未処理強度とsiCTRL強度のわずかな違いは、siRNAトランスフェクションなどの任意の処理がアッセイの応答と出力にどのように影響するかを示しています。さらに、各条件に対して適切なコントロールを使用することの重要性を示すことができます。
図1:BrdU病巣形成は、複製細胞よりもPCNA陽性細胞においてより起こりやすい 。 (A)5Gy照射および3時間放出後のBrdU病巣形成およびPCNA染色の代表的な画像。マークされたBrdU病巣を示すズームインされた正方形が、各BrdU画像の隅に存在する。(B)未処理(BMN-673を含まない)HeLa細胞におけるBrdU核強度の定量化。データは、s.e±平均(マン・ホイット ニーU検定).m示す。略語: BrdU = 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン;PCNA = 増殖する細胞核抗原;IR = 照射;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;A.U. = 任意の単位;s.e.m. = 平均の標準誤差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ-1のノックダウンまたは阻害は、複製細胞におけるBrdU病巣形成の増加をもたらす 。 (A)5μM BMN-673、siCTRL、およびsiPARP−1で処理し、続いて5Gy照射および3時間放出した未処理HeLa細胞におけるBrdU病巣形成およびPCNA染色の代表的な画像。マークされたBrdU病巣を示すズームインされた正方形が、各BrdU画像の隅に存在する。(B)5μM BMN-673、siCTRL、およびsiPARP−1で処理した未処理HeLa細胞におけるBrdU核強度の定量化、続いて5Gy照射、データ±平均s.e.mを示す(Mann-Whitney U-test)。(c) PARP−1のsiRNAノックダウンを検証するためのウェスタンブロット。F1-23 PARP−1抗体は、BMN-673処理サンプルにおけるsiCTRLバンドの塗抹された外観および触媒的に阻害されたPARP-1の固体外観をもたらす自己修飾PARP−1を認識する。略語: PARP-1 = ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ 1;BrdU = 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン;PCNA = 増殖する細胞核抗原;IR = 照射;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;A.U. = 任意の単位;siCTRL = siRNAコントロール;siPARP-1 = PARP−1をノックダウンするsiRNA;s.e.m. = 平均の標準誤差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 緩衝液A(抽出前緩衝液)30mL | ||
| 試薬 | 容積 | 最終濃度 |
| H2O | 18キロリットル | |
| パイプ (pH 7, 500 mM) | 600 μL | 10ミリオンメートル |
| ナクル (4 M) | 750 μL | 100ミリアンペア月間 |
| マグネシウムCl2 (1 M) | 90 μL | 3ミリオン |
| 東経 (500 mM) | 60 μL | 1 ミリオン |
| トリション X-100 (10%) | 1.5キロリットル | 0.50% |
| スクロース (1 M) | 9キロリットル | 300ミリアンペア時 |
| バッファー B (細胞骨格ストリッピングバッファー) 30 mL | ||
| 試薬 | 容積 | 最終濃度 |
| H2O | 25.035 ミリリットル | |
| トリス pH 7.5 (1 M) | 300 μL | 10ミリオンメートル |
| ナクル (4 M) | 75 μL | 10ミリオンメートル |
| マグネシウムCl2 (1 M) | 90 μL | 3ミリオン |
| トゥイーン20 (10%) | 3 ミリリットル | 1% |
| 10%デオキシコール酸ナトリウム | 1.5キロリットル | 0.50% |
| 試薬 | 容積 |
| 16% PFA | 2.5キロリットル |
| PBS 1x | 7.5ミリリットル |
表 1.
補足図S1:セルプロファイラソフトウェアとスペックルカウンティングパイプラインパート1の視覚的表現。 (A)スクリーンショットは、分析する画像の異なるチャンネルファイルを識別するために使用されるウィンドウを示しています。これらのショットは、セル プロファイラー インターフェイスを示しています。(B) 核を識別するための [プライマリ オブジェクトの識別] メニューのスクリーンショット。強調表示された値は、原子核を最もよく識別するために一般的に変更される値です。略語: BrdU = 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:セルプロファイラソフトウェアおよびスペックルカウンティングパイプラインパート2の視覚的表現。 (A) 核内のBrdU病巣を識別するための「主オブジェクトの識別」メニューのスクリーンショット。(B) BrdUおよびPCNA核強度を測定するための[物体強度の測定]メニューのスクリーンショット。略語: BrdU = 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン;PCNA = 増殖する細胞核抗原。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:セルプロファイラソフトウェアおよびスペックルカウンティングパイプラインパート3の視覚的表現。 (a)最適化後の細胞プロファイラによる核同定の表現。(B)BrdU病巣の識別の表現。(C)スクリーンショットは、最初のウィンドウ内の1つのセルをズームインしたものです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S4:PCNA陽性およびPCNA陰性細胞の散布図。 (A)PCNA陽性細胞とPCNA陰性細胞を区別するために使用されるPCNA散布図の例。単一の条件からのPCNA強度をプロットし、2つの集団間の区別を特定した。緑色はPCNA陽性細胞を強調し、赤色はPCNA陰性細胞を示す。これは、個々の実験および条件ごとに行われる。(b)5μM BMN-673、siCTRL、およびsiPARP−1で処理したPCNA陰性未処理HeLa細胞におけるBrdU核強度の定量;データは、s.e±(マン・ホイット ニーU検定).m平均を示しています。略語: PARP-1 = ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ 1;BrdU = 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン;IR = 照射;PCNA = 増殖する細胞核抗原;A.U. = 任意の単位;siCTRL = siRNAコントロール;siPARP-1 = PARP−1をノックダウンするsiRNA;s.e.m. = 平均の標準誤差。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S5:照射なしのBrdUシグナル。 (a)BrdU病巣形成および無照射でのPCNA染色の代表的な画像。スケールバー = 5 μm。マークされたBrdU病巣を示すズームインされた正方形が、各BrdU画像の隅に存在する。(b)5μM BMN-673、siCTRL、およびsiPARP−1で処理したPCNA陽性未処理Hela細胞におけるBrdU核強度の定量;データは、s.e±(マン・ホイット ニーU検定).m平均を示しています。(c)5μM BMN-673、siCTRL、およびsiPARP−1で処理したPCNA陰性未処理HeLa細胞におけるBrdU核強度の定量;データは、s.e.±(マン・ホイット ニーU検定).m平均を示しています。略語: PARP-1 = ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ 1;BrdU = 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン;PCNA = 増殖する細胞核抗原;IR = 照射;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;A.U. = 任意の単位;siCTRL = siRNAコントロール;siPARP-1 = PARP−1をノックダウンするsiRNA;s.e.m. = 平均の標準誤差。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1:DNA切除の測定のためのBrdU染色を分析するための細胞プロファイラとスペックルカウンティングパイプラインの使用。 このビデオでは、セル プロファイラーとスペックル カウント パイプラインの使用方法を示します。このプロトコル専用のこのツールを使用して画像をインポートおよび分析する方法を示します。略語: BrdU = 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、IF染色を用いてセルロのDNA切除の変動を測定する方法について説明する。DNA切除への影響を観察するための現在の標準は、RPA染色によるものです。しかし、これはDNA複製の影響を受ける可能性のある間接的な方法です。以前に、BrdU陽性およびBrdU陰性細胞において生じる強度を分類するための別のBrdU組み込みベースのDNA切除IF技術が記載されていた。この方法により、HRを受けていない細胞は、バックグラウンドまたはミトコンドリア染色のために陽性としてカウントされ、高いBrdU強度をもたらす14、15、16が可能になりました。この論文に記載されている方法の主な新規性は、細胞周期のS期およびG2期に対する選択性を可能にし、結果として生じるBrdUシグナルが切除によるものであり、したがって相同性指向性修復によるものであることを保証するPCNA染色の添加である。
このプロトコルの重要なステップは、事前抽出です。これがなければ、BrdU病巣は見えなくなり、誤って行われると細胞は完全に剥離する。誤って調製された緩衝液は、部分的な細胞骨格除去またはバックグラウンドシグナルの増加など、不完全な事前抽出をもたらす。前抽出緩衝液とのインキュベーションの持続時間を尊重することは非常に重要であり、緩衝液中の持続時間の増大は、細胞がカバースリップから剥離し得る。重要なことに、このプロトコルが接着不良の細胞で実行される場合、カバースリップをポリリジンで前処理して、前抽出中の細胞剥離を減少させる。続いて、メタノール固定なしでは、PCNAシグナルは見えなくなる。
このプロトコルのもう1つの重要な変数はブロッキングバッファです:互換性のないブロッキングバッファはBrdU信号の損失につながります。例えば、1x PBSブロッキングバッファー中の10%ウシ胎児血清は、メタノール固定と組み合わせない場合に機能する。しかしながら、PCNA染色に必要なメタノール固定と組み合わせると、BrdUシグナルはかなり減少する。他のブロッキングエージェントやメソッドがこのプロトコルで動作する可能性があります。1x PBSの3%BSAが最良の結果をもたらしました。この技術に不可欠な最後の要素は、DNA損傷源の使用です。これがなければ、核BrdUシグナルはほとんどまたはまったく存在しない(補足図S5)。経験上、照射はこの方法の優れた損傷源であることを示している。しかし、照射器へのアクセスがない場合、ネオカルジノスタチンなどの放射性模倣薬を代わりに使用することができる。
セルプロファイラは、この技術で生成された画像の簡単で一貫した分析を可能にする便利で汎用性の高いツールです。この設定は、識別されるオブジェクトのサイズと、識別されるしきい値の両方に合わせてカスタマイズできます (補足ビデオ 1)。BrdU染色の核強度は所望の読み出しであるため、重要なカスタマイズはDAPIファイルからの核の同定にある。各条件からの画像の分析は、結果がセル番号と画像番号を含む単一のcsvファイルの形式で取得されるが、条件名は得られないため、別々に行う必要があります。解析条件が適切かどうかを判断するには、[ テスト モードの開始] 機能を使用し、目的の手順で目のアイコンが開いていることを確認します。実際の解析を実行するときにこのアイコンを閉じると、ポップアップウィンドウが表示され、プログラムが遅くなります。 テストの開始モードでは、ユーザーは必要に応じて設定を変更して、最初に核を識別し、次にBrdU病巣を適切に識別することができます。
結果の識別に満足したら、同じ実験内の各条件に同じ設定を使用します。これには、バッチ全体を分析する前に、各条件のテストイメージを取得して、設定が各条件に準拠していることを確認する必要があります。画像取得によっては、セルプロファイラの設定がユーザー間およびソフトウェアバージョン間で異なる場合があることに注意することが重要です。したがって、特定の実験に理想的なパラメータを決定するためにテスト段階を通過することが不可欠です。結果をグラフ化する準備をする際には、PCNA(S期)陽性細胞を同定しなければならない。これを行うには、BrdU強度と同じ方法でPCNA強度を測定し、その結果の値を散布図としてプロットして、PCNA陽性細胞のカットオフ強度値を最もよく視覚化します。PCNA陰性の結果は、BrdU強度グラフ化を可能にするためにデータセットから削除されます。提供されている補足図は、最も最適化された設定 (補足図 S1、補足図 S2、および補足図 S3) を強調したプログラムのスクリーンショットを示しています。
プロトコルの可能な改変は、使用されるPCNA抗体である。2つの異なるPCNA抗体が正常に試験され、ここにリストされているものと、もはや生産されていないラットモノクローナル抗体(Bulldog Bio PCA16D10)であるもの。最後に、抗体インキュベーション中にカバースリップをパラフィルムで覆う必要があります。これは厳密には必要ではありませんが、これなしでカバースリップを完全に覆うには、かなり大きな量の抗体溶液が必要になります。別の方法は、ガラス板を囲むパラフィルムのシートを配置し、パラフィルム上に抗体溶液の滴を置き、抗体溶液の滴の上にカバースリップ細胞側を慎重に下ろすことである。次いで、このガラス板を、一次インキュベーションのために一晩4°Cの湿気の多いチャンバーに入れ、二次インキュベーションのために室温で暗所に置くことができる。この方法は、カバースリップの取り扱い時間を大幅に増加させ、その結果、カバースリップを落下または破損させる確率を高めるが、完全に機能する。
切除を測定するための代替方法は、DNAコーミングSMART法を使用することである。この手法は非常に明確な結果をもたらしますが、はるかに複雑で、より多くの時間を必要とし、より高価です17。SMART法では、DNAを損傷することなく抽出し、このDNAをカバースリップに伸ばしてIFを採取する必要があります。対照的に、BrdU IF法は、単純で費用対効果が高く、抗体のコストよりも大きな投資を必要としません。この方法は、単にRPA病巣形成を測定するよりも正確な切除を測定するための最初の方法を提供し、これは多くの細胞機能に対するその影響に関連する可能性がある。しかし、RPAは、DNA損傷応答の一部として切除中に特定の残基にリン酸化される。
最近、1分子イメージングにより、リン酸化RPA(pRPA)が陰性切除調節因子であることが明らかになりました18。したがって、長期的には、PCNA/リン酸化RPA染色とBrdUイメージングを適切な抗体と最適化された染色条件を使用することで、この方法をさらに正確にすることができます。しかしながら、提示された方法は、切除プロセスに関与するタンパク質から独立して観察される切除の表現を提供し、したがって、治療に応答したそれらのシグナルの変化から生じ得るバイアスを否定する。この技術は、タンパク質が切除に関与しているかどうかを判断する方法を提供するだけでなく、薬物治療による細胞死が低/過解除に関連しているかどうかを判断する方法も提供する。この情報は、DNA修復の機構的側面だけでなく、薬物誘発性細胞死の根底にある生物学的メカニズムを理解する上でも有益であり得る。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
マリー=クリスティーヌ・キャロンの卓越した技術的アドバイスに感謝します。この研究は、カナダ衛生研究所J.Y..M(CIHR FDN-388879)からの資金提供によって支えられています。J.-Y..M.は、DNA修復およびがん治療のTier 1カナダ研究委員長を務めています。J.O'SはFRQS博士課程の学生フェローであり、S.Y.MはFRQSポスドクフェローです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
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