Summary
Hier beschreiben wir einen korrelativen Workflow für die Exzision, Druckbeaufschlagung, Fixierung und Bildgebung der murinen Pulmonalklappe, um die grobe Konformation und lokale extrazelluläre Matrixstrukturen zu bestimmen.
Abstract
Die zugrunde liegenden Ursachen der Herzklappenerkrankung (HVD) sind schwer fassbar. Murine Tiermodelle bieten ein hervorragendes Werkzeug für die Untersuchung von HVD, aber das chirurgische und instrumentelle Fachwissen, das erforderlich ist, um die Struktur und Organisation über mehrere Längenskalen hinweg genau zu quantifizieren, hat seinen Fortschritt behindert. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der murinen Dissektion, der En-bloc-Färbung, der Probenverarbeitung und der korrelativen Bildgebungsverfahren zur Darstellung der Herzklappe auf verschiedenen Längenskalen. Hydrostatischer Transvalvulardruck wurde verwendet, um die zeitliche Heterogenität durch chemische Fixierung der Herzklappenkonformation zu kontrollieren. Die Mikro-Computertomographie (μCT) wurde verwendet, um die Geometrie der Herzklappe zu bestätigen und eine Referenz für die nachgelagerte Probenverarbeitung zu liefern, die für die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) erforderlich ist. Hochauflösende serielle REM-Bilder der extrazellulären Matrix (ECM) wurden aufgenommen und rekonstruiert, um eine lokale 3D-Darstellung ihrer Organisation zu erhalten. μCT- und SBF-SEM-Bildgebungsverfahren wurden dann korreliert, um die räumliche Variation über die Pulmonalklappe zu überwinden. Obwohl sich die vorgestellte Arbeit ausschließlich auf die Pulmonalklappe betrifft, könnte diese Methodik zur Beschreibung der hierarchischen Organisation in biologischen Systemen übernommen werden und ist entscheidend für die strukturelle Charakterisierung über mehrere Längenskalen hinweg.
Introduction
Die Pulmonalklappe (PV) dient dazu, eine unidirektionale Durchblutung zwischen dem rechten Ventrikel und der Lungenarterie sicherzustellen. Lungenklappenfehlbildungen sind mit verschiedenen Formen angeborener Herzerkrankungen verbunden. Die aktuelle Behandlung für angeborene Herzklappenerkrankungen (HVD) ist die Klappenreparatur oder der Klappenersatz, was mehrere invasive Operationen während des gesamten Lebens eines Patienten erfordern kann1. Es ist allgemein anerkannt, dass die Funktion der Herzklappe von ihrer Struktur abgeleitet wird, die oft als Struktur-Funktions-Korrelat bezeichnet wird. Genauer gesagt bestimmen die geometrischen und biomechanischen Eigenschaften des Herzens seine Funktion. Die mechanischen Eigenschaften wiederum werden durch die Zusammensetzung und Organisation des ECM bestimmt. Durch die Entwicklung einer Methode zur Bestimmung der biomechanischen Eigenschaften von murinen Herzklappen können transgene Tiermodelle verwendet werden, um die Rolle des ECM auf die Herzklappenfunktion und Dysfunktionabzufragen 2,3,4,5.
Das mausige Tiermodell gilt seit langem als Standard für molekulare Studien, da transgene Modelle bei Mäusen im Vergleich zu anderen Arten leichter verfügbar sind. Murine transgene Modelle bieten eine vielseitige Plattform für die Erforschung herzklappenbedingter Erkrankungen6. Das chirurgische Know-how und die Instrumentierungsanforderungen, um sowohl die Geometrie als auch die ECM-Organisation zu charakterisieren, waren jedoch eine große Hürde für den Fortschritt der HVD-Forschung. Hstologische Daten in der Literatur liefern ein Bild in den gehalt an extrazellulären Matrixen der mausinen Herzklappe, jedoch nur in Form von 2D-Bildern, und können ihre 3D-Architektur nicht beschreiben7,8. Darüber hinaus ist die Herzklappe sowohl räumlich als auch zeitlich heterogen, was es schwierig macht, über Experimente hinweg Rückschlüsse auf die ECM-Organisation zu ziehen, wenn die Probenahme und Konformation nicht festgelegt sind. Herkömmliche 3D-Charakterisierungsmethoden wie MRT oder 3D-Echokardiographie bieten nicht die Auflösung, die erforderlich ist, um ECM-Komponenten9,10aufzulösen.
Diese Arbeit beschreibt einen vollständig korrelativen Arbeitsablauf, bei dem die zeitliche Heterogenität aufgrund des Herzzyklus durch Fixierung der Konformation der murinen PV mit hydrostatischem Transvalvulardruck angesprochen wurde. Die räumliche Heterogenität wurde präzise kontrolliert, indem Bereiche von Interesse abgesonden und Datensätze aus verschiedenen Bildgebungsmodalitäten, insbesondere μCT und serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie, über verschiedene Längenskalen registriert wurden. Diese Methode des Scoutings mit μCT zur Führung der nachgelagerten Probenahme wurde bereits vorgeschlagen, aber da die Pulmonalklappe zeitliche Variationen aufweist, war eine zusätzliche Kontrollebene auf der chirurgischen Ebene11erforderlich.
In-vivo-Studien, die die Biomechanik der murinen Herzklappe beschreiben, sind spärlich und stützen sich stattdessen bei der Beschreibung des Deformationsverhaltens auf Computermodelle. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass lokale extrazelluläre Daten auf der Nanometerlängenskala mit der Geometrie und Lage der Herzklappe in Verbindung stehen. Dies wiederum liefert quantifizierbare, räumlich abgebildete Verteilungen von mechanisch beitragenden ECM-Proteinen, mit denen bestehende biomechanische Herzklappenmodelle verstärkt werden können12,13,14.
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Protocol
Die Verwendung von Tieren in dieser Studie erfolgte in Übereinstimmung mit dem institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Nationwide Children's Hospital unter dem Protokoll AR13-00030.
1. Lungenklappenexzision
- Autoklavieren Sie die notwendigen Werkzeuge, die für die Mausdissektion benötigt werden. Dazu gehören feine Scheren, Mikrozangen, Mikrogefäßklemmen, Klemmzangen, Mikronieren, Mikronährenhalter, Federscheren und Retraktoren.
- Akklimatisieren Sie alle Mäuse für mindestens 2 Wochen vor der Operation. Entfernen Sie C57BL / 6-Mäuse, etwa 1 Jahr alt, aus ihren Käfigen und wiegen Sie, dann euthanasieren Sie mit einem Ketamin / Xylazin-Cocktail (3: 1 Ketamin: Xylazin, 0,01 ml pro g) Überdosierung.
- Legen Sie die Maus in eine dorsale Liegeposition auf ein Tablett und sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Klebeband. Nach der Sicherung führen Sie die Thorakotomie durch.
- Setzen Sie das Herz frei, indem Sie überschüssiges Fettgewebe und Faszien entfernen.
- Entfernen Sie den rechten Vorhof und perfundieren Sie durch den linken Ventrikel mit Kochsalzlösung bei Raumtemperatur (0,9% NaCl). Die Perfusion sollte etwa 20 ml über 30 s dauern. Dies führt zur Exsanguination der Maus.
- Entfernen Sie das gesamte Herz, indem Sie die obere Hohlvene, die untere Hohlvene, die Lungenarterie und die Aorta durchtrennen. Besondere Vorsicht ist bei der Lungenarterie geboten. Schneiden Sie etwa 2 mm über der ventrikulo-arteriellen Verbindung, da diese als Leitung für die Druckbeaufschlagung dient.
- Entfernen Sie die linken und rechten Ventrikel, um die Kammern dem atmosphärischen Druck auszusetzen. Stellen Sie sicher, dass die Struktur des Lungenstamms durch die Entfernung der Ventrikel nicht beeinträchtigt wird.
2. Druckfixierung der Pulmonalklappe
- Anastomose-Druckbeaufschlagungsschlauch mit Lungenarterie, der etwa 1 mm Abstand zwischen der sino-tubulären Verbindung und dem Ende des Schlauches lässt, um große Bewegungen der Blättchen und des Lungenstamms aufzunehmen.
- Heben Sie das Reservoir auf einen analogen physiologischen Druck und füllen Sie es mit der Kochsalzlösung. Testen Sie das Durchflusssystem, um sicherzustellen, dass keine Verstopfungen oder Luftblasen vorhanden sind.
- Befestigen Sie einen Absperrhahn an der anastomosierten Pulmonalklappe und sorgen Sie durch Umschalten des Ausströmtraktes für einen ausreichenden Durchfluss durch den Schlauch (d. h. keine Luftblasen). Sobald der Fluss ausreichend ist, schalten Sie den Abfluss auf die anastomosierte Pulmonalklappe um und stellen Sie die Druckbeaufschlagung des Lungenstamms sicher. Dies wird durch pulmonale Rumpfdehnung identifiziert.
- Sobald die Druckbeauffüllung des Lungenstamms bestätigt ist, werden schrittweise primäre Fixierlösung (1,25% Glutaraldehyd, 1,0% Paraformaldehyd in 0,15 M Cacodylat) eingebaut, bis die Kochsalzlösung gereinigt ist. Dies geschieht, indem ein Teil, etwa 25% der Reservoirkapazität, der Kochsalzlösung entfernt und durch das primäre Fixiermittel ersetzt wird.
ACHTUNG: Die verwendeten Fixiermittel (Paraformaldehyd und Glutaraldehyd) sind hochgiftig und es sollten geeignete persönliche Schutzausrüstungen (PSA) getragen werden, um die Sicherheit zu gewährleisten. - Legen Sie eine fixiermittelgetränkte Gaze über die Gewebeprobe, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Halten Sie das Fixiermittel für 3 h durch und füllen Sie das Reservoir nach Bedarf auf, um einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten. Während der Fixierung ist es nicht ungewöhnlich, dass die Pulmonalklappe aufgrund der chemischen Fixierung schrumpft. Wenn dies der Fall ist, füllen Sie das Reservoir ständig mit primären Fixiermitteln auf, um den physiologischen Druck aufrechtzuerhalten.
- Lagern Sie die Herzklappe bis zum Gebrauch bei 4 °C in der Fixierlösung. Die Proben wurden bis zu 1 Woche ohne erkennbaren Unterschied gelagert.
3. En-bloc Probenfärbung und Einbettung15,16
ACHTUNG: Die in diesem Abschnitt verwendeten Färbereagenzien (Kaliumferrocyanid, Osmiumtetroxid, Thiocarbohydrazid, Bleiaspartat und Uranylacetat) sind hochgiftig und sollten mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Die Verwendung eines Abzugs und einer geeigneten PSA wird empfohlen.
- Färbung
- Waschen Sie die feste Herzklappenprobe für 5 min mit kaltem 0,15 M Cacodylatpuffer. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male.
- Die Herzklappe vollständig in eine Lösung aus 1,5% Kaliumferrocyanid, 0,15 M Cacodylat, 2 mM Calciumchlorid und 2% Osmiumtetroxid auf Eis für 1 h tauchen.
- Während der Inkubation der Probe Thiocarbohydrazid (TCH) -Lösung vorbereiten, indem Sie 0,1 g TCH in 10 ml ddH2O auflösen. Regelmäßig vorsichtig rühren, um sicherzustellen, dass TCH vollständig aufgelöst ist. Filtern Sie die Lösung unmittelbar vor Gebrauch durch einen 0,22 μm Spritzenfilter.
- Waschen Sie die Proben mit Raumtemperatur ddH2O, indem Sie sie für 5 min in ein Röhrchen ddH2O geben und durch Schütteln des Behälters leicht rühren. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
- Legen Sie es für 20 Minuten bei Raumtemperatur in gefilterte TCH-Lösung. Führen Sie den Waschschritt dreimal (je 5 min) bei Raumtemperatur ddH2O durch, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben.
- Sobald Sie fertig sind, legen Sie die Probe in 2% Osmiumtetroxid für 30 min bei Raumtemperatur. Anschließend insgesamt dreimal für je 5 min mit Raumtemperatur ddH2O erneut waschen.
- Inkubieren Sie die Probe in 1% Uranylacetat über Nacht bei 4 °C.
- Während dieser Zeit wird eine Lösung von 0,066 g Bleinitrat in 10 ml Asparaginsäure-Stammlösung hergestellt. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,5 mit 1 N KOH ein. Die Lösung in einen 60 °C-Ofen geben, um Bleinitrat aufzulösen.
- Führen Sie nach der Inkubation über Nacht den Waschschritt wie in Schritt 3.1.4 beschrieben durch. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal. Anschließend wird das Herzklappengewebe in Bleiaspartatlösung ab Schritt 3.1.8 in einem 60 °C-Ofen für 30 min inkubiert.
- Austrocknung
- Waschen Sie die Taschentücher 5 min bei Raumtemperatur mit ddH2O. Dreimal wiederholen.
- Machen Sie frische Lösungen von 20%, 50%, 70%, 90% und 100% Ethanol in ddH2O. Bis zum Gebrauch auf Eis aufbewahren.
- Um das Herzklappengewebe zu dehydrieren. Führen Sie nachfolgende Behandlungen von 20%, 50%, 70% und 90% Ethanol auf Eis für jeweils 5 Minuten durch. Führen Sie dann zwei nachfolgende Behandlungen von 100% Ethanol auf Eis für 5 Minuten durch.
- Bewegen Sie das Gewebe für 10 Minuten zu eiskaltem Aceton. Dann für 10 min in frisches Aceton bei Raumtemperatur geben.
- Einbettung
- Stellen Sie die Harzmischung (siehe Materialtabelle)gemäß den Herstellerangaben fest: 11,4 g Komponente A, 10 g Komponente B, 0,3 g Komponente C und 0,05-0,1 g Komponente D. Mischen Sie zunächst die Komponenten A und B, indem Sie jede der Komponenten auf 60 °C erhitzen, bevor Sie die Komponenten C und D hinzufügen. Die Mischung wird durch Zugabe der Komponenten C und D in eine bernsteinfarbene Farbe umgewandelt. Es wird einheitlich sein, wenn es richtig gemischt wird.
- Stellen Sie Mischungen mit Volumenverhältnissen von 25:75, 50:50 und 75:25 Harz:Aceton hergestellt. Gründlich mischen.
- Legen Sie Gewebe in nachfolgende Behandlungen der 25:75-, 50:50- und 75:25-Harz-Aceton-Mischung für jeweils 2 h bei Raumtemperatur.
- Legen Sie das Gewebe über Nacht bei Raumtemperatur in 100% Harz.
- Am nächsten Tag legen Sie das Gewebe für 2 h bei Raumtemperatur in frisches 100% Harz.
- Das Herzklappengewebe in eine Einbettkapsel geben, mit frischem 100% Harz ersetzen und für 48 h in einen 60 °C-Ofen geben, um auszuhärten.
- Führen Sie eine korrelative Bildgebung wie unten gezeigt durch.
4. Mikro-Computertomographie Bildgebung
- Montieren Sie den Harzprobenblock mit einem Klebstoff auf einem μCT-Probenhalter (Klebstoff oder doppelseitiges Klebeband funktioniert gut).
- Setzen Sie den Halter in die μCT-Kammer und befestigen Sie ihn auf der Bühne, indem Sie die Spannzange so verschrauben, dass sich der Halter nicht bewegt. Die Probenbewegung während des Scans verringert die Bildqualität.
- Öffnen Sie die μCT-Benutzeroberfläche, indem Sie auf das Symbol doppelklicken. Fügen Sie ein Projekt hinzu, indem Sie das +-Zeichen neben Projekte auswählen und die erforderlichen Felder ausfüllen.
- Sobald dies erstellt wurde, suchen Sie das erstellte Projekt und wählen Sie es aus, indem Sie darauf klicken. Dadurch öffnet sich eine zweite Spalte Akquisitionen. Wählen Sie das + neben Akquisitionen und füllen Sie die erforderlichen Felder aus.
- Schließen Sie die Kammertüren und bewaffnen Sie das System, indem Sie die Scharfschalttaste auf der Vorderseite oder den μCT drücken.
HINWEIS: Das System schaltet die Röntgenbilder nach einem erfolgreichen Aufwärmvorgang automatisch aus. Aktivieren Sie Röntgenbilder, indem Sie die Taste auswählen. - Stellen Sie die Bühnendrehung so ein, dass der Mittelpunkt der Drehung der Probe nicht von der Mitte des Monitors abweicht (d. h. die Probe befindet sich innerhalb des Sichtfelds für den gesamten Scan). Für das system, das für dieses Experiment verwendet wird, müssen Sie die ROI-Phase (Region of Interest) unter der Dropdown-Registerkarte wie unten beschrieben anpassen.
- Stellen Sie die ROI-Stufeneinstellung ein, indem Sie den Drehwinkel auf 0° einstellen und den Rand der Probe markieren. Anschließend wird die Probe auf 180° gedreht und der Rand der Probe erneut markiert.
- Passen Sie die x-Achsenposition der ROI-Stufe so an, dass sich die Kante der Probe zwischen diesen beiden Extremen befindet. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Drehwinkel von 90° und 270° für die Y-Position.
- Für den Fall, dass die Rotation der Probe dazu führt, dass sich die Kanten aus dem Sichtfeld bewegen, verringern Sie die Vergrößerung des μCT-Bedarfs, bis die Kanten der Probe in den oben eingestellten Winkeln sichtbar sind und eine grobe ROI-Stufenanpassung vorgenommen werden kann.
- Einmal bei der unteren Vergrößerung eingestellt, bewegen Sie die Probe oder den Detektor, um die Vergrößerung zu erhöhen, und die ROI-Positionen können fein eingestellt werden.
HINWEIS: Dieser Vorgang muss möglicherweise wiederholt werden, um die Ausrichtung sicherzustellen. Die richtige Ausrichtung führt zu einer Probe, die wenig bis keine horizontale Bewegung durch alle Rotationswinkel der Probe zeigt.
- Passen Sie die μCT mit der Software des Herstellers an die gewünschten Scanparameter an. Zu diesen Parametern gehören Röhrenpotential, Röhrenstrom, Detektorabstand, Probenabstand, Belichtungszeit, Flugbahn und die Anzahl der Projektionen (siehe Tabelle S1 für die in dieser Studie verwendeten μCT-Erfassungsparameter).
HINWEIS: Kalibrierparameter, wie Klarfeld- und Dunkelfeldscans, sollten gemäß den Herstellerspezifikationen eingehalten werden, sofern nicht anders angegeben. Wenn beispielsweise eine Probe zu groß ist und das System die Probe nicht aus der Feldansicht verschieben kann, muss die Probe entfernt werden, um Klare-Feld-Kalibrierungsscans durchzuführen. - Sobald die Parameter eingestellt sind, kann eine Annäherung an die Dauer des Scans angezeigt werden, indem Sie auf die Schaltfläche Zeitschätzung klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um den Scan zu starten.
- Stellen Sie nach Abschluss des Scans sicher, dass die Röntgenstrahlen ausgeschaltet sind, schrauben Sie die Spannzange ab und entfernen Sie die Probe vorsichtig aus der μCT-Kammer.
5. Probenverarbeitung und Bildkorrelation
- Rekonstruieren Sie μCT-Projektionen mit einem gefilterten Rückprojektionsalgorithmus mit der vom Hersteller bereitgestellten Software (siehe Materialtabelle).
- Wählen Sie oben auf dem Bildschirm die Registerkarte Recon aus. Wählen Sie die Registerkarte Projekt und Akquisition aus.
- Wählen Sie die Recon-Vorlage aus, die der gefilterten Rückprojektion zugeordnet ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start Recon.
- Identifizieren und segmentieren Sie die Pulmonalklappe mithilfe von Bildverarbeitungssoftware. Dies erfordert Vorkenntnisse der Anatomie der Pulmonalklappe17. Bei erhöhten arteriellen Drücken verfärben sich die Blättchen und blockieren das Lumen der Pulmonalklappe.
- Identifizieren Sie die Slicing-Ausrichtung in Bezug auf die Scanrichtung und das Muster. Orientieren Sie die Probe so um, dass die Schneidrichtung auf die gewünschte Achse ausgerichtet ist.
- Identifizieren Sie Regionen, die für hochauflösende Bildgebung von Interesse sind. In diesem Experiment wurde der Bauch (Mitte) des Blättchens und die Arterio-Valvular-Verbindung gewählt.
- Entfernen Sie das überschüssige Harz und probieren Sie entweder mit der Rasierklinge oder dem Schleifen für große Materialstücke oder mit dem Mikrotom für feinere Stücke.
- Sobald Sie sich an einem interessanten Ort befinden, vergleichen Sie die physische Probe mit virtuellen μCT-Scheiben, um den Standort zu bestätigen. Dies geschah durch den Vergleich anatomischer Merkmale am Querschnitt.
6. Serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie18
- Reduzieren Sie den Querschnitt der Probe, um SBF-REM aufzunehmen, ca. 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.
- Montieren Sie die getrimmte Probe mit Epoxidharz auf dem SBF-SEM-Aluminiumstumpf.
- Beschichten Sie den Probenblock mit 35 nm Gold. Drehen Sie die Probe auf der Plattform, um eine gleichmäßige Beschichtungsschicht aufzutragen.
- Entlüften Sie die SBF-REM-Kammer und stellen Sie die Höhe der Messerklinge auf die euzentrische Höhe des Mikroskops ein.
- Fügen Sie das Beispiel ein, und nivellen Sie den Beispielstub.
- Bild unter Niedrigenvakuumbedingungen zur Verhinderung des Ladens und mit Rückstreudetektor (siehe Tabelle S2 für SBF-SEM-Erfassungsparameter).
- Bild und Stitch mehrere Bereiche von Interesse bei unterschiedlichen Vergrößerungen mit automatisierter Software (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
Anastomose der Lungenarterie zum Druckschlauch ist in Abbildung 1Adargestellt. Nach der Anwendung von hydrostatischem Druck dehnung sich der Lungenstamm radial (Abbildung 1B), was darauf hinweist, dass sich die Lungenklappenblättchen in einer geschlossenen Konfiguration befinden. Die Pulmonalklappenkonformation wurde durch μCT bestätigt. In diesem Fall waren die Blättchen koapt (geschlossen) und der Ring war kreisförmig (Abbildung 2A). Abbildung 2B,C zeigt unterschiedliche Grade einer unzureichenden Druckbeaufschlagung der Pulmonalklappe durch Fixierung (Abbildung 2B) oder arteriellen Kollaps (Abbildung 2C).
Das Trimmen von Probenblöcken wurde durch das μCT-Volume-Rendering gesteuert. In diesem Fall wurde die Ebene parallel zur sino-röhrenförmigen Verbindung als Schneidrichtung gewählt. Unter Verwendung anatomischer Landmarken wurde das μCT-Volumen, das virtuelle Querschnitte rendert, mit optischen Bildern korreliert (Abbildung 3), um die Schnittrichtung und -position zu bestätigen.
Sobald sich der Probenblock an der gewünschten Stelle und Ausrichtung befand, wurden hochauflösende SBF-SEM-Bilder in einer lokalen Region innerhalb eines Flugblatts aufgenommen. Es wurde eine Bildkorrelation zwischen dem μCT-Volume, das virtuelle Slice rendert (Abbildung 4A), SBF-SEM-Bildern mit niedriger Auflösung(Abbildung 4B)und hochauflösenden SBF-SEM-Bildern (Abbildung 4C) durchgeführt. Aufgrund der manuellen Probenmontage wurden die erforderlichen Scheiben des Probenblocks benötigt, um eine ebene Oberfläche zu erzeugen, bevor Bilder im SBF-SEM aufnahmen. Daher die unterschiedlichen Positionen zwischen Abbildung 3 und Abbildung 4.
Eine vollständige Bildkorrelation zwischen μCT- und SBF-SEM-Datensätzen ist in Video 1 zu sehen. Die Pulmonalklappenprobe im μCT-Volumenrendering ist aufgrund der Färbung von Schwermetallatomen leicht vom umgebenden Einbettharz zu unterscheiden. Längen und Winkel werden im Bild gemessen, um das Schneiden zu leiten. In diesem Beispiel wurde die Ebene parallel zum sino-röhrenförmigen Übergang verwendet. Ein virtueller Slice Through emuliert das Entfernen des Materials, bis die Interessierenstiefe erreicht ist. An diesem Querschnitt wurden hochauflösende Bilder von SBF-SEM aufgenommen und im μCT-Datensatz registriert.
Einmal aufgenommene hochauflösende Bilder, die von SBF-SEM aufgenommen wurden, können in einen Bildprozessor importiert und in eine 3D-Darstellung (Abbildung 5) kompiliert werden, in der extrazelluläre Komponenten identifiziert werden können.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder des anastomosierten Lungenstamms. Der herausgeschnittene Lungenstamm (A) vor und (B) nach hydrostatischer Druckbeaufladung. Die gepunktete Linie zeigt die ventrikulo-arterielle Verbindung an, an der sich der Annulus des Lungenstamms befindet. Beachten Sie die pulmonale Rumpfdehnung bei Druckbeaufschlägeung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentatives μCT-Volumen, das die Pulmonalklappe bildet. (A) Die Pulmonalklappe befindet sich in einer geschlossenen Position, wobei die Blättchen ausreichend gestreckt und koapt (Kreis) sind. (B,C) Unzureichende Druckbeaufschlagung der Pulmonalklappe. Beachten Sie, dass die Blättchen nicht richtig koapiert sind (B) und dass der Ring nicht kreisförmig ist (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bildkorrelation des Probenblocks der Pulmonalklappe. (A) μCT Volumen-Rendering virtuelle Scheibe und (B) physische Probenblock nach Trimmung durch optische Mikroskopie entnommen. Abschnitte von Lungenklappenblättchen sind rot eingekreist und wurden als Orientierungspunkte verwendet, um die beiden verschiedenen bildgebenden Verfahren zu korrelieren. Der Maßstabsbalken entspricht 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bildkorrelation des abgebildeten Lungenklappenquerschnitts. (A) Virtueller Querschnitt, der durch μCT-Volumenrendering erzeugt wird. Rotes Feld zeigt den Bereich an, der mit SBF-SEM in (B) abgebildet wurde. (B) Übersichtsbilder mit niedriger Auflösung zur Korrelation mit dem μCT-Querschnitt. Das blaue Feld stellt den Ort der hochauflösenden SBF-SEM-Bildgebung(C)dar. Maßstabsbalken entsprechen (B) 100 μm und (C) 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Segmentierte Region der Pulmonalklappe, die von SBF-SEM aufgenommen wurde. Querschnittsbilder wurden gestapelt und zu einer 3D-Darstellung einer lokalen Pulmonalklappenregion zusammengestellt. Markierungen wurden Endothelzellen (grün), valvulären interstitiellen Zellen (blau) und extrazellulären Fasern (gelb) zugeordnet. Die ungefähren Abmessungen des abgebildeten Bereichs betragen 30 μm x 20 μm x 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Rohrpotential | 70 kV |
| Röhrenstrom | 75 μA |
| Fokusmodus | M |
| Flugbahn | Kreisförmig |
| Projektionen/Revolution | 2880 |
| Modus | 3040 x 3040 Pixel |
| Mittelwertbildung | 1 |
| Belichtungszeit | 1,0 s |
| Abstand von Der Probe zur Pistole | 15 mm |
| Abstand vom Detektor zur Waffe | 725 mm |
| Voxel Größe | 2,9 μm |
| Sichtfeld | 8,4 x 8,4 x 6,3 mm |
Tabelle S1: Abbildungsparameter für μCT.
| Landeenergie | 2 - 2,5 kV |
| Abstrahlstrom | 100 - 400 pA |
| Arbeitsabstand | 6,5 - 7 mm |
| Detektor | VS-DBS |
| Verweildauer | 1 - 2 μs |
Tabelle S2: Bildgebende Parameter für SBF-SEM.
Video 1: Bildkorrektur von μCT- und SBF-SEM-Datensätzen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Die Entfernung der Ventrikel dient zwei Zwecken. Erstens, die Ventrikelseite dem atmosphärischen Druck auszusetzen, wodurch nur ein transvalvulärer Druck von der arteriellen Seite der Pulmonalklappe ausgeübt werden muss, um sich zu schließen, und zweitens, eine stabile Basis bereitzustellen, um eine Verdrehung des Lungenstamms zu verhindern. Während der Druckbeaufschlägeung dehnung sich der Lungenstamm radial und minderwertig, wodurch er anfällig für Verdrehungen wird, was zum Zusammenbruch des Lungenstamms führt. Die Vorspannung der Pulmonalklappe mit einer Kochsalzlösung bietet eine zusätzliche Qualitätskontrolle, um sicherzustellen, dass die Druckbeaufschlagung ausreichend ist und wenn es Lecks im System gibt. Die Wirkung des primären Fixiermittels ist schnell, in der Größenordnung von wenigen Sekunden, und ohne hydrostatische Vorbelastung mit der Kochsalzlösung wird die Pulmonalklappe in einer zufälligen Konformation fixiert. Ohne Vorspannung lag die Erfolgsrate für eine geschlossene Pulmonalklappe bei etwa 10%-20%. Mit dem Vorladeschritt lag die Erfolgsquote bei über 90%.
Die μCT- und SBF-SEM-Bildgebungsbedingungen wurden für diese Anwendung abgestimmt. Die Pulmonalklappe kann, wenn sie vollständig gedehnt ist, weniger als 10 μm dick sein. Als Faustregel gilt, dass ein Schwellenwert von 3 Voxeln erforderlich ist, um ein Feature auflösen zu können. so wurden die μCT-Volumen-Renderings mit einer Voxelgröße von 2,9 μm mit einem Sichtfeld von 8,4 x 8,4 x 6,3 mm gescannt. Kleinere Voxelgrößen können in μCT erreicht werden, dies erfordert jedoch entweder Probentrimmungen und/oder längere Scanzeiten. Eine kleinere Probe würde eine höhere Auflösung ermöglichen, indem sie näher an der Röntgenquelle platziert wird. Kleinere Voxel können auch erreicht werden, indem der Röntgendetektor weiter hinten von der Probe platziert wird; Dies verringert jedoch den Gesamtfluss auf dem Detektor und beeinträchtigt das Signal-Rausch-Verhältnis. Als Referenz waren unsere μCT-Scans ungefähr 5-6 h lang. Spezifische Bildgebungsbedingungen, die in dieser Studie verwendet werden, sind in der Ergänzenden Tabelle S1 und der Ergänzenden Tabelle S2 ).
Es gibt Einschränkungen für diese Methode. Der chirurgische Teil dieses Verfahrens erfordert Fachwissen im Umgang mit Tieren, um die Lungenklappenstruktur während der Handhabung nicht zu beeinträchtigen. Darüber hinaus ist die Bildgebung zeitintensiv und erfordert mehrere bildgebungsähnliche Instrumente. Als Referenz war die hochauflösende SBF-REM-Bildgebung etwa 1 Woche kontinuierliche Bildgebung für eine Tiefe von etwa 100 μm. Dies ist eine anspruchsvolle Aufgabe für das Instrument, um für lange Bildgebungssitzungen stabil und konsistent zu bleiben. Ein praktischerer Ansatz wäre es, eine Probenahmestrategie zu entwickeln, um die Heterogenität der Pulmonalklappe ohne Zeitaufwand präzise darzustellen. Dies muss noch festgelegt werden. Bisher wurde der gesamte korrelative Workflow an einer Maus durchgeführt, hat aber die Machbarkeit und das Potenzial des korrelativen Workflows bei der Untersuchung der Pulmonalklappe über Längenskalen hinweg gezeigt.
Zukünftige Iterationen dieses korrelativen Ansatzes können In-situ-μCT-Experimente beinhalten, so dass dieselbe Probe einem unterschiedlichen transvalvulären Druck ausgesetzt werden kann, um die Variation von Probe zu Probe zu entfernen. Dies wird derzeit durch die Proben- und Instrumentenstabilität für längere Scanzeiten, eine in bildgebende Systeme integrierte Druckbeaufschränkungsvorrichtung und den Kontrast aufgrund ähnlicher Dämpfungskoeffizienten von Wasser und Gewebe begrenzt. Obwohl die transvalvulären Drücke physiologische Bedingungen widerspiegelten, ist sie nicht repräsentativ für den pulsatilen Fluss, der für die Herzkontraktion charakteristisch ist. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Dehnungsrate wenig Einfluss auf die Konformation der Packungsbeilage hat. In zukünftigen Iterationen könnte es sich als relevanter erweisen, ein Gerät zu entwickeln, das in der Lage ist, pulsatile Strömung9zu verabreichen. Darüber hinaus erfordert ein Großteil der Arbeit eine manuelle Abfrage der Probe, da es derzeit keinen automatisierten Workflow gibt. Die Lokalisierung der Pulmonalklappe, die Probenverarbeitung in Richtung des interessierenden Bereichs, die Bildkorrelation und die Registrierung wurden manuell durchgeführt, würden sich aber in Zukunft als nützlich erweisen, um die Verarbeitung zu rationalisieren und die Subjektivität zu verringern.
Die vorgestellte Arbeit ist ein korrelativer Workflow zur Fixierung der Konformation der Pulmonalklappe und zur Registrierung der Bildgebung in μCT und SBF-SEM. Die mit dieser Methode gewonnenen Informationen werden schließlich genutzt, um die zugrunde liegende Biomechanik der Pulmonalklappe in noch zu klärenden Maustiermodellen zu bestimmen. Die valvuläre Biomechanik kann vollständig durch ihre Geometrie und extrazelluläre Matrix beschrieben werden, aber diese sind auf zwei verschiedenen Längenskalen. Dazu ist eine präzise Kontrolle der Heterogenität der Klappe und eine genaue Abbildung hochauflösender Bilder der extrazellulären Matrix in Bezug auf ihre Lage innerhalb der Pulmonalklappe erforderlich. Dieser korrelative Workflow wird bereits in anderen Experimenten implementiert, um Vergleiche zwischen Wildtyp- und transgenen Osteogenesis imperfecta-Mäusen zu ziehen, um fibrilläre extrazelluläre Matrixunterschiede zu vergleichen, und kann leicht auf andere angeborene Defekte wie die Bikkuspidalklappenbildung extrapoliert werden19,20. Diese Informationen in Verbindung mit möglichen Proteomik werden ein vollständiges Bild davon liefern, wie sich die Biomechanik zwischen den beiden mausen Tiermodellen unterscheiden wird.
Obwohl diese Arbeit nur die Pulmonalklappe darstellt, ist dieser Workflow leicht an andere heterogene, hierarchische biologische Systeme zu ändern. Wir haben 3D-Bildgebungstechniken verwendet, um die architektonische Organisation des ECM zu erfassen, aber Techniken mit höherer Auflösung, wie Transmissionselektronenmikroskopie oder Rastertransmissionselektronenmikroskopie, können je nach gewünschter Information angehängt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird teilweise durch R01HL139796- und R01HL128847-Zuschüsse an CKB und RO1DE028297 und CBET1608058 für DWM unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
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