Summary
미세 주입 기술은 모기의 게놈에 외인성 유전자를 소개하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 제임스 실험실에서 DNA 구조를 Anopheles 감비아아에 미세 주입하여 변형된 모기를 생성하는 방법을 설명합니다.
Abstract
배아 미세 주입 기술은 곤충 종의 많은 분자 및 유전 연구에 필수적입니다. 그(것)들은 안정적이고 헤아린 방식으로 곤충 생식선으로 유리한 특성뿐만 아니라 관심있는 유전자를 인코딩하는 외인성 DNA 단편을 소개하는 수단을 제공합니다. 결과 형질전환균은 기본적인 질문에 대답하거나 실제 응용분야에서 사용되는 통합 된 DNA의 발현으로 인한 표현성 변화를 연구 할 수 있습니다. 이 기술은 간단하지만 효율성을 극대화하는 수준의 기술을 달성하기 위해서는 조사자의 인내와 연습이 필요합니다. 여기에 표시 아프리카 말라리아 모기의 배아의 미세 주입을위한 방법이다, Anopheles 감비아. 목표는 개발 된 생식선 (극) 세포에서 채택 될 수 있도록 배아에 미세 주입 외인성 DNA에 의해 전달하는 것입니다. 트랜스포지아제, 정수, 재조합, 또는 기타 뉴클레아제(예: CRISPR 관련 단백질, Cas)의 주입된 DNA로부터 발현은 염색체로의 공유 삽입으로 이어지는 이벤트를 유발할 수 있다. 이러한 기술에서 생성된 트랜스제닉 An. 감비아는 면역 계통 구성 요소, 혈액 공급에 관여하는 유전자 및 후각 시스템의 요소에 대한 기본 연구에 사용되었습니다. 또한, 이러한 기술은 말라리아 기생충의 전송을 통제하는 것을 도울 수 있는 특성을 가진 An. 감비아인 긴장을 생성하는 데 이용되었습니다.
Introduction
미세 주입 기술은 1900년대 초부터 유기체를 실험적으로조작하는 데 사용되어 왔다. 미세 주입은 기본적인 생물학적 기능을 연구하고 원하는 유기체의 생물학에 중요한 변화를 도입하는 데 사용되었습니다. 미세 주입 기술은 벡터 생물학자에게 특히 관심이 있었으며 벡터 게놈2-11을조작하는 데 널리 사용되어 왔다. 절지동물 벡터의 트랜스게네스 실험은 종종 벡터의 체력을 감소시키거나 전달되는 병원체에 대한 내화성을 증가시키는 변화를 제정함으로써 병원균을 전송하는 데 벡터를 덜 효율적으로 만드는 것을 목표로 합니다. 모기는 다양한 인간 병원체를 전송하고 전 세계적으로 이환율과 사망률에 중요한 영향을 미칩니다. 모기의 아노페스 속은 인간 말라리아 기생 병원균, 플라스모듐 spp를 전송합니다. Anopheles를 가진 유전 공학 실험은 생물학을 더 잘 이해하고 새로운 말라리아 제거 전략을 개발하기 위한 노력에 있는 이 모기의 벡터 용량을 감소시키는 것을 목표로 했습니다.
전 세계적으로 가장 말라리아 감염을 기여하는 모기 벡터는 Anopheles 감비아 종 복합체에 있습니다. 그러나, 성공적인 유전자 실험의 대다수는 인도 아대륙의 말라리아 벡터에, Anopheles stephensi에수행되었습니다. 실험실 적응 Anopheles 감비아균의 많음이 존재하는 동안, 형질전환 Anopheles 감비아의 수는. 이 다름에 대한 이유는 알려지지 않았지만, Anopheles 감비아배아는 Anopheles stephensi보다성공적인 전염을 주입하고 달성하기가 더 어렵다고 생각됩니다. 이 프로토콜은 미세 주입을 통해 Anopheles 감비아아아의 전염을 달성하는 데 지속적으로 성공한 것으로 입증된 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 이전에 Hervé Bossin과 마크 베네딕트(12)에 의해 개발 된 방법을 기반으로하고 몇 가지 추가 세부 사항 및 변경은 과기 생성의 효율성을 높이기 위해 발견 된 추가.
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Protocol
1. 미세 주입을 위한 모기 준비
- 케이지13 (~5000cm3)을~100명의 수컷과 200-300명의 암컷 1-2일 성인 1-2일 성인 1-2일 동안 종자하고 2일 동안 짝짓기를 허용합니다.
- 짝짓기 기간 이후에는 인공 수식 장치로 2mL의 혈액을 사용하여 모기에게 혈액 식사를 제공하거나 곤충 관행에 따라 마취 된 동물을 살 수있습니다(14) 다음 날 모기에게 두 번째 혈액 식사를 제공하여 모든 짝짓기 암컷이 먹이를 줄 기회가 있고 부분적으로 먹이는 모기가 완전히 강화되도록합니다.
- 두 번째 혈액 식사 후 2-4 일 배아 수집을 위해 모기를 활용하십시오.
참고: 라발 영양은 성인의 견고성과 생식 적합성에 중요합니다. 건강한 곤충을 후면하는 방법에 대한 자세한 내용은 베네딕트 외 (2020)를 참조하십시오14. 모기가 인공 피더에 공급되거나 마취 된 동물을 살 때 계란 누워에 중요한 차이가 관찰되지 않았습니다. 곤충에서 Anopheles 감비아에 일상적으로 사용되는 방법을 사용하십시오.
2. 배아 준비
- 양단에서 열리도록 절단된 투명 50mL 원뿔튜브에 20~30명의 암컷을 배치하고 한쪽 끝에 라텍스 치과필름으로 덮여 있고 다른 한쪽 끝에는 나일론 메쉬및 필터 종이를 배치한다(그림1).
참고: 모기는 필터 용지에 알을 입금하고 나일론 메쉬는 필터 용지를 제자리에 단단히 고정시합니다. 모기 계란은 형상의 원통형, ~500 μm 길이, ~200 μm의 직경은 가장 넓은 지점에서, 전방 및 후방 끝에서 가늘어지게한다(도 2). - 모기가 가득한 튜브를 작은 (60mm x 15mm) 페트리 접시에 이중 증류수(ddH2O)로 채우십시오. 튜브와 접시를 인큐베이터에 28°C에서 45분 동안 놓습니다(그림3).
- 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 튜브를 빈 케이지에 삽입합니다. 튜브를 살짝 눌러 모기가 날아와 모든 모기가 날아오면 케이지에서 튜브를 제거합니다.
- 튜브가 모기가 없는 경우, 바닥 고리를 풀고 나일론을 제거하고 집게를 사용하여 튜브에서 계란이 있는 필터 용지를 조심스럽게 제거합니다. 필터 용지를 ddH2O로 적신 필터 용지 층이 들어 있는 플라스틱 페트리 접시(100mm x 15mm)에 놓습니다.
- 계란을 관찰하십시오. 밝은 회색색(그림4)이정렬할 수 있는 지점까지 숙성된 계란.
- 계란이 여전히 흰색인 경우 인큐베이터로 돌려보내 5분마다 색상을 확인하십시오. 흰 알은 깨지기 쉽고 쉽게 파열되며 주입 과정 이후에 잘 생존하지 못하여 부화가 낮습니다.
- 짙은 회색이나 검은 색의 달걀은 너무 많이 노화되었습니다. 사용하지 마십시오.
3. 배아 정렬
- 나일론 블로팅 멤브레인(2cm x 1cm)을 면도날로 자르고 가장자리가 깔끔하게 다듬어졌는지 확인합니다.
참고: 가장자리가 직선이 아닌 경우 주사 과정에서 계란이 멤브레인에 제대로 부착되지 않습니다. - 유리 슬라이드에 멤브레인을 넣고 필터 용지 (2cm x 2cm)로 멤브레인을 덮어 멤브레인 필터의 ~ 1mm를 발견(그림 5).
참고: 현미경 슬라이드를 사용하기 전에 깨끗하게 하고 깨끗한 집게를 사용하여 멤브레인 필터를 조작합니다. - 계란으로 deionized H2O와 필터 종이를 적시면 장기간 건조하면 죽습니다.
참고: 배아가 주입 과정에서 움직이기 때문에 종이에 너무 많은 물을 넣지 말고 배아가 건조되는 것을 방지하기에 충분한지 확인하십시오(그림6A,B). 과도한 물은 필터 용지로 흡수하여 제거할 수있습니다. - 30-50개의 배아를 페인트 브러시(크기 #0)로 멤브레인 가장자리로 부드럽게 옮기습니다. 브러시를 사용하여 복부 측(볼록)이 위쪽으로 향하도록 슬라이드에서 부드럽게 굴려 멤브레인을 따라 계란을 수직으로 정렬합니다.
- 모든 계란을 미세 주입 현미경으로 관찰할 때, 후방 끝(더 뾰족한, 도 6A,B)이다운 위치에 있고 바늘로 ~15°의 각도를 형성할 수 있도록 모든 계란을 동일한 방향으로 지향한다(도6C). 멤브레인의 전체 가장자리를 계란(30-50)으로 정렬하고 슬라이드를 현미경 아래에 배치하여 주입합니다.
참고: 계란을 신중하게 선택하십시오. 흰색(너무 젊거나 개발되지 않은) 또는 어두운 회색(너무 오래되어 바늘을 부러뜨리고) 비정상적인회색(그림 7)을버리십시오. 필터 용지가 항상 촉촉하게 유지되는지확인합니다.
4. DNA 준비
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 내독신없는 DNA 플라스미드 맥시 프레프 키트와 함께 최소한 주입을위한 플라스미드 DNA를 정화합니다.
- 4°C에서 30분 동안 냉장 원심분리기에서 PCR 급 물과 원심분리기의 DNA를 17,100 x g로 재차식합니다. 그런 다음, 상체를 새롭고 깨끗한 1.5 mL 원문 튜브로 옮김합니다. 조심스럽게 마이크로 파이펫은 열에서 원치 않는 미립자 물질을 전송하지 않도록합니다.
- 3M 나트륨 아세테이트의 1/10 부피와 100% 에탄올의 2배 부피를 사용하여 DNA의 두 번째 강수량을 수행합니다.
- 1000 ng/μL의 최종 플라스미드 농도를 위해 PCR 급 수의 300-500 μL에서 DNA를 재연하여 300-400 ng/μL의 최종 플라스미드 농도를 위해 플라스미드 칵테일을 주입 버퍼에 혼합하고 10-20 μL 알리쿼트를 만듭니다.
참고: DNA는 -20°C에서 저장될 수 있다. DNA 미세주입 알리따트는 -20°C, 또는 RNA 성분을 사용하는 경우 -80°C에서 저장될 수 있다. 점도가 바늘이 막히게 하기 때문에 주사 믹스에서 DNA의 800 ng/μL을 초과하지 마십시오.
5. 바늘 준비
- 프로그래밍 가능한 마이크로 파이펫 풀러를 사용하여 10cm 석영 모세 혈관을 당겨 바늘을 만듭니다.
- 끝이 잘 형성되었는지 확인하기 위해 현미경의 밑에 바늘을 검사합니다. 프로그래밍 가능한 풀러의 바늘 설정이 터미널 끝에서 ~0.5mm를 테이퍼하기 시작하고 미세 한 점으로 끝나는 팁을 생성하는지 확인하십시오 (그림 6참조). 쉽게 깨는 바늘은 일반적으로 테이퍼의 너무 오래있다.
참고: 조건은 바늘 풀러에 따라 다를 수 있습니다(저자는 요청 시 사용하는 프로그래밍 가능한 풀러에 대한 설정을 사용할 수 있습니다. 저널 제한은 특정 브랜드를 인용에서 우리를 방지). 바늘은 손으로 당길 수 있지만 대부분의 실험실에서 사용할 수없는 기술 세트가 필요합니다.
6. 배아 미세 주입
- 마이크로 로더 팁을 사용하여 바늘을 DNA 혼합물 2 μL로 채웁니다. 바늘 홀더에 바늘을 삽입하고 자동 압력 펌프 튜브(도 8)를연결합니다.
- 중요: 바늘을 정렬하여 슬라이드의 평면과 15° 각도를 만들 수 있도록합니다(그림 8).
- 바늘 끝을 조심스럽게 만져서 바늘 끝을 열고 바늘 의 끝을 삽입하여 10 μm≤ 후면 극에 삽입하십시오. 성공적인 주사는 계란 내의 세포질의 작은 운동으로 이끌어 낼 것입니다.
- 현미경 동축 단계 컨트롤을 사용하여 다음 계란으로 이동하여 주사를 계속하십시오.
- 바늘 끝이 열려 있고 막히지 않았는지 확인하려면 다른 배아에 들어가기 전에 주입 버튼을 누르고 바늘의 개구부에서 작은 물방울을 시각화하십시오.
- 바늘이 막히면 클리어 버튼을 눌러 바늘을 지우고 물방울 시각화 테스트를 반복합니다. 바늘 팁 개구부가 약간 커지면 필요에 따라 압력을 조정하여 액적의 크기가 작게 유지되도록 합니다.
- 바늘 1개에 ~40-50알을 주입합니다.
참고: 필터 용지가 항상 촉촉하게 유지되는지 확인합니다. 바늘에 충분한 역압을 유지하여 지워지도록 하십시오. 막힐 수 없는 바늘은 새 바늘로 교체해야 합니다. 배아 배치, 바늘 삽입 및 주사단계의 수평 이동을 위한 동축 조절이 있는 현미경으로 쉽게만들어집니다(그림 9).
- 주사가 완료된 후, 필터 종이가 늘어선 유리 용기에 계란을 헹구고 50mL의 50mL의 탈온화 H2O(그림10)로채워지게 한다.
참고: 배아는 주입 후 2일 동안 부화하기 시작하고 3-5일 정도 걸릴 수 있습니다. 부화 된 첫 번째 인스타 애벌레는 즉시 (매일 2 번 확인) 물과 음식이있는 깨끗한 용기로 옮겨야합니다.
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Representative Results
설명된 미세 주입 프로토콜의 적용의 대표적인 예는 카르발라-Lejarazú 외5에서발견될 수 있다. 여기서 의도는 An. gambiae의실험실 균주 G3의 세균에 자율 적인 유전자 구동 시스템을 삽입하는 것이었습니다. 이 시스템은 이 종의 제3 염색체에 대한 추기경 정형골 궤적 궤적(Agcd)을 대상으로 설계되었으며, 이는 3-하이드록시키누레닌의 환전을 xanthommatin으로 촉매하는 헴 과록시다아제, 옴모크롬 생합성의 마지막 단계(도11)를대상으로 설계되었다. 동질 유전자 드라이브 함유 모기는 유충, 푸파 및 새로 나타난 성인이 적목 현상형을 가진 기능 상실 추기경 돌연변이체입니다. 드라이브 시스템을 포함하는 플라스미드, pCO37은 An의 규제 요소를 제어하에 연쇄상 구균 pyogenes Cas9 (SpCas9) 엔도누셀리스를 표현한다. 감비아나노유전자 정형졸로그, 23-뉴클레오티드 가이드 RNA(gRNA)는 An. 감비아에 U6 유전자 프로모터 및 3XP3-CFP 지배적인 마커 카세트로 형질형 자진을 식별하기 위한 시안 형광 단백질을 발현한다. 아그cd GRNA 표적 절단 부위를 측면으로 하는 게놈 부위에 상동성 DNA 단편이 가능하도록 혼성 수리-(HDR) 중재 통합.
700개의 야생형 A. 감비아아아배아는 SpCas9 단백질과 함께 pCO37 플라스미드를 주입했다. 백사마6 주입 배아 (18.7%; G0)은성인 의 무대에 살아남았고, 이후 이성의 야생 형 구성원에게 교차했다. 차세대(G1)의형광 현미경 검진은 CFP 마커 유전자에 대해 양성인 3,428명(0.09%)중 3개, 남성과 여성이 살아남았습니다. 분자 접근법(유전자 증폭, DNA 염기서열)은 -10 kb의 정확한 삽입을 DNA의 DNA와 그로 인한 균주가 AgNosCd-1로 지정하였다. 광범위한 후속 분석은 AgNosCd-1이 드라이브에서 매우 효율적이었으며, 몇 가지 내성 알레를 만들었으며 유전자 구동 시스템5의통합 및 발현의 결과로 주요 유전 적부하 (피트니스 비용)가 없는 것으로 나타났습니다. pCO37 플라스미드는 말라리아 기생충 전염을 방지하기 위해 An. 감비아의 인구 수정 균주를 개발하기위한 중추 역할을합니다.
그림 1: 계란 수집 장치. 계란 수집 장치는 필터 용지, 나일론 메쉬, 치과 필름 및 개조 된 50 mL 원추형 튜브로 구성됩니다. 이 장치는 모기가 치과 필름의 슬릿을 통해 용기에 안전하게 모기를 증착할 수 있게 합니다. 필터 용지와 나일론 메쉬는 물을 흡수할 수 있게 해주며, 이는 습기가 많지만 침수된 표면을 오비포지션으로 제공하지 는 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 아노펠스 감비아아. A)성숙의 다양한 단계에서 배아의 배치. B)화살은 변혁을 위한 의도된 표적인 생식선 세포를 포함하는 배아 내의 후방 극, 위치를 나타낸다. 배율 막대는 ~1mm를 나타냅니다.
그림 3: 계란 컬렉션. 모기가 달걀 수집 장치 내부에 놓이면, ddH2O로 적신 필터 종이 층을 포함하는 페트리 접시로 이동하여 수위가 뚜껑의 높이를 ~1/4로 상승하도록 물 양을 조정합니다. 계란 수집 장치와 페트리 접시는 어두운 인큐베이터에 배치하고 모기는 총 45 분 동안 oviposit 할 수 있습니다.
그림 4: 배아 발달. 배아는 짧은 시간 동안 주입에만 적합합니다. 발달에 조기에 주입되는 계란은 너무 섬세하고 손상을 입히고 해치지 않을 것입니다. 그들의 발달에서 나중에 주입되는 계란은 경화되고 계란에 주입되는 너무 많은 유전 물질을 일으키는 원인이 되는 바늘을 깰 수 있습니다. 또한, 나중에 개발된 주사는 극 세포가 급속하게 추가 복제 및 분화를 겪기 때문에 생식선에 영구적인 변화를 일으킬 가능성이 적습니다. 사진은 45분 의 배기 시간 후 10 분마다 촬영되었습니다. 별표 (*)는 주사에 적합한 계란을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 멤브레인 슬라이드 조립. 계란은 나일론 멤브레인을 따라 정렬되어 주사 과정에서 계란이 움직이지 않도록 지지 구조를 제공합니다. 필터 용지는 계란이 주입 내내 촉촉하게 유지되도록 물을 위한 저수지 역할을 합니다. 필터 용지와 나일론 멤브레인을 유리 슬라이드 의 가장자리에 가깝게 두어 계란과 물에 잠긴 물을 모두 수용 할 수 있습니다. 멤브레인과 필터 용지가 슬라이드 가장자리에서 너무 멀리 떨어져 있으면 배아와 바늘 사이의 올바른 각도를 달성하는 것이 어려울 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 미세 주입을 위한 배아 배향. A)배아는 전방보다 낮은 후방 극과 정렬되어 멤브레인을 실행합니다. B)배아는 물에 침지된다; 달걀 위의 수선의 폭을 평균 배아의 폭의 약 8분의 1에서 1/4로 조정한다. C)배아와 바늘 각도의 클로즈업 이미지. 배율 막대는 ~1mm를 나타냅니다.
그림 7: 비정상적인 배아. 착색또는 질감에 비정상적으로 나타나는 배아는 부화하지 않습니다; 그들을 주입하지 마십시오. 색깔에 있는 노란 태아는 제대로 우울하지 않을 것입니다. 감소 부화는 또한 정상적인 나타나는 계란 껍질 (큐치클)가없는 부드러운 배아에서 관찰되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 미세 주입 중 바늘 위치. A)사출 단계의 광각 보기. B,C)정렬된 배아가 주사 바늘로 15°의 각도를 형성할 수 있도록 바늘을 배치합니다. 바늘과 배아를 포함하는 슬라이드 사이의 적절한 앵글링을 보장하기 위해 현미경 단계보다 바늘을 상당히 높게 잡는 미세 주입 기기의 팔을 상승시키지 마십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 공동 축 조절 및 바늘 홀더. A)공동 축 제어(arrow)는 각 주입에 대한 바늘의 정확한 배치를 보장하기 위해 바늘의 3차원 움직임을 허용합니다. 슬라이드를 전환할 때 바늘을 수직으로 올리는 공동 축 컨트롤을 사용하여 바늘이 스테이지에 배치할 때 새 슬라이드와 충돌하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 측면 공동 축 제어를 통해 바늘을 후방 극으로 정확하게 침투할 수 있습니다. B)주사각도를 보여주는 바늘 홀더의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 계란 부화용 챔버. A, B)주입된 배아를 이중 증류수와 필터 용지로 일렬로 세워분기 깊이로 채워진 원통형 용기에 조심스럽게 세척합니다. C,D)용기의 움직임은 계란이 자연스럽게 필터 용지에 부착됩니다. 부화용기를 떠나기 전에 필터 용지를 더 높게 부착한 알이 수위로 부드럽게 세척되도록 하십시오. 파란색 타원형은 상대크기를 나타내기 위해 여러 개의 증착된 달걀을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11. 아노펠스 감비아(Agcd) 유전자 직교, pCO37 유전자 드라이브 구조 및 결과 표현형. 상단) Agcd 유전자 : 적갈색 블록, 엑슨 (E1-4); 빈 블록, 3'- 및 5 번역되지 않은 영역 (UTR); 두꺼운 검은 색 선, 인트론 및 간 DNA. 중간) pCO37 플라스미드: Agcd 유전자에서 상동성 팔: 적갈색 블록, 블루 블록, 지배적 인 마커 유전자 구성 요소 (3XP3 및 CFP); 황갈색 블록, 드라이브 성분(나노 프로모터 및 SpCas9 단백질 인코딩 서열); 녹색 블록, 가이드 RNA 성분 (U6 프로모터 및 gRNA 서열). pCO37의 유전자와 특징은 확장되지 않습니다. SpCaS9/gRNA 매개 컷 사이트(녹색 화살표헤드)에서 시작된 상동성 지향 수리(HDR)로 인한 재조합(적갈색 화살표)은 유전자 드라이브 구조의 통합을 초래한다. 아래) 유전자 드라이브 통합의 결과 표시 표현형: (왼쪽) CFP+ (흰색 / 파란색 화살표) 및 호머지구스 Agcd-돌연변이 (빨간 화살표) phenotype 유충 및 Agcd-돌연변이 (빨간 화살표) phenotype phenoe에. (오른쪽) 호모자구우스 Agcd 돌연변이 표현형 "붉은 눈" 성인. 카르발라 르자라수 외에서 적응. (2020) 및 사용 권한5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
CRISPR/Cas9와 같은 정밀하고 유연한 유전 공학 기술의 가용성이 증가함에 따라 형질 전환 생물은 이전보다 보다 간단하고 안정적인 방식으로 개발될 수 있습니다. 이 공구는 연구원이 병원체 (인구 수정) 또는 헤아릴 수 있는 불임 (인구 억제)에 내화성의 원하는 속성을 달성에 아주 가까운 모기 벡터의 형질전환균을 만들 수 있었습니다. 그러나 가장 안전하고 안정적인 유전자 변형 모기를 개발하기 위해서는 추가 형질 전환선을 생성하고 평가하여 현장 연구를 위해 최적의 라인을 선택해야합니다. 설명된 프로토콜은 인구 수정 및 억제 전략을 위해 추가 후보자를 개발할 수 있도록 Anopheles gambiae 형질형 형질전환생성의 효율성을 높일 수 있습니다.
설명된 미세 주입 절차는 모기 또는 그밖 절지동물 벡터의 micro주입을 일상적으로 수행하는 실험실에서 유효할 가능성이 있는 장비 및 재질을 이용합니다. 프로토콜 전체의 세부 사항에 주의를 유지하는 것이 중요합니다. 품질에 의해 계란을 선택하거나 두 번째 DNA 강수량과 같은 단계를 건너 뛰는 등의 단계를 통해 돌진하면 결과가 손상되고 부화 및 감소된 변환 효율을 유발합니다. 또한, 모기 축산에서 주의를 취하지 않으면 시술에 많은 어려움이 발생할 수 있습니다. 혼잡한 조건에서 사육되거나 영양소가 부족한 모기는 미세 주입 워크플로우에서 병목 현상을 일으키고 원하는 수의 주입된 배아에 도달하는 데 필요한 시간을 증가시키는 가난한 품질의14개의알을 낳을 것입니다.
Anopheles stephensi12의미세 주입을 위해 기술된 방법과 달리, 이 방법은 배아의 오일 침수를 필요로 하지 않으며 더 많은 배아는 오일 기반 방법에 필요한 추가 단계 없이 짧은 시간에 주입될 수 있다. 석유 기반 방법에 비해 이 방법에 대한 제한은 미세 주입 공정 전반에 걸쳐 더 가난한 시각화이다. 주사 물질 이나 배아 세포질이 다시 바늘로 흐르지 않도록하기 위해, 주의는 주입 과정을 통해 항상 바늘의 배압에 유지되어야한다.
아프리카 말라리아 벡터는 다른 Anopheles spp에 비해 유전적으로 조작하기 위하여 역사적으로 어려웠습니다., 그러나 그것은 전 세계적으로 말라리아 케이스에 가장 큰 기여자입니다. 말라리아 제거 노력을 보좌하기 위해 새로운 도구가 필요하며 모기 집단을 수정하거나 억제하도록 설계된 형질 전환 모기는 제거를 달성하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다. 현장 기반 말라리아 제거 연구를 위한 최고의 형질전환 후보를 선택하려면 최적의 효능과안전성을위해 비교하고 선택할 수 있도록 다수의 라인을 평가해야 한다. 향상된 내화 또는 억제를 가진 형질 전환선을 만드는 데 필요한 유전 및 분자 빌딩 블록은 특징과 사용 가능한. 이 프로토콜은 이러한 내화 또는 억제 라인을 만들 수있는 속도를 높이는 데 보조를 두어 검증 노력이 가까운 장래에 현장 시험 후보를 선택하기 시작할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
드루실라 스틸링거, 키오나 파커, 패리시 파월, 매들린 노톨리에게 모기 축산에 감사드립니다. 기금은 캘리포니아 대학, 어바인 말라리아 이니셔티브에 의해 제공되었다. AAJ는 캘리포니아 대학교 어바인의 도널드 브렌 교수입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
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