Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Rekonstruere humant retinoblastom in vitro

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/62629
Automatic Translation
1, 1
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

Summary

Vi beskriver en metode til generering af humant retinoblastom (RB) ved at introducere bialleliske RB1-mutationer i humane embryonale stamceller (hESC). RB-cellelinjer kunne også med succes dyrkes ved hjælp af den isolerede RB i en skål.

Abstract

Human RB er pædiatrisk kræft, som er dødelig, hvis der ikke administreres nogen behandling. Da RB stammer fra kegleforstadier, hvilket er relativt sjældent i gnavermodeller, i mellemtiden med hensyn til forskellene mellem arter mellem mennesker og gnavere, er en sygdomsmodel afledt af mennesker mere gavnlig for at afdække mekanismerne for human RB og søge målene for terapi. Heri beskriver protokollen dannelsen af to genredigerede hESC-linjer med henholdsvis en biallelisk RB1-punktmutation (RB1 Mut/Mut) og en RB1-knockoutmutation (RB1-/-). Under processen med retinal udvikling observeres dannelsen af RB. RB-cellelinjerne etableres også ved at adskille fra RB-organoiderne. Alt i alt har vi ved at differentiere de genredigerede hESC-linjer til retinale organoider ved hjælp af en 2D- og 3D-kombineret differentieringsprotokol med succes rekonstrueret den menneskelige RB i en skål og identificeret dens kegle-forløberoprindelse. Det ville give en nyttig sygdomsmodel til observation af retinoblastomets genese, spredning og vækst samt videreudvikling af nye terapeutiske midler.

Introduction

Human retinoblastom (RB) er en sjælden, dødelig tumor afledt af retinale kegleforstadier 1,2,3, er den mest almindelige type intraokulær malignitet i barndommen4. Homozygot inaktivering af RB1-genet er den initierende genetiske læsion i RB5. Mus med RB1-mutationer undlader imidlertid at danne nethindetumoren2. Selvom musetumorerne kunne genereres med kombinationen af Rb1-mutationer og andre genetiske modifikationer, mangler de stadig funktionerne i human RB6. Takket være udviklingen af retinal organoiddifferentiering kunne den hESC-afledte RB opnås og vise tegnene i human RB1.

Talrige protokoller til retinal organoid differentiering er blevet etableret i det sidste årti, herunder 2D7, 3D8 og en kombination af 2D og 3D9. Metoden, der bruges her til at generere den menneskelige RB, er konsolideringen af tilhængerkultur og flydende kultur9. Ved at differentiere RB1-muteret hESC til retinale organoider detekteres dannelsen af RB omkring dag 45, og derefter spredes den hurtigt omkring dag 60. På dag 90 er isolering af RB'er og generering af RB-cellelinjen mulig; desuden omgiver RB næsten alle retinale organoider på dag 120.

hESC-afledt RB er en innovativ model til at udforske oprindelse, tumorigenese og behandlinger for RB. I denne protokol beskrives genereringen af genredigering hESC, differentieringen af RB og karakterisering for RB detaljeret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse er godkendt af den institutionelle etiske komité på Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESC'er fås fra WiCell Research Institute.

1. Generering af RB1 muteret hESC

  1. CRISPR/Cas9 målretningsvektor for knockout (KO) af RB1.
    1. Design et par sgRNA. For ablation af RB1 skal du målrette den første exon af dette gen. Den fremadrettede primersekvens er CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, og den omvendte primersekvens er AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
      BEMÆRK: For den specifikke RB1-mutation kræves der også en repareret skabelon. I denne protokol bruges RB1-KO-cellelinje som et eksempel.
    2. 1 μg pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro fordøjes med BbsI-restriktionsenzymer (se Materialetabel) i 30 minutter ved 37 °C ved at følge producentens anvisninger.
    3. Rens de fordøjede plasmider ved hjælp af et rensningssæt i henhold til producentens anvisninger.
      BEMÆRK: Enzymatiske reaktioner kunne renses direkte uden agarosegel ved hjælp af rensningssættet (se Materialetabel).
    4. Fosforylat og glød hvert par oligoer ved anvendelse af T4-polynukleotidkinase (PNK) (materialetabel) med reaktionen bestående af 1 μL oligo1 (100 μM), 1 μL oligo2 (100 μM), 1 μL 10x T4-ligerationsbuffer, 6,5 μL ddH2O og 0,5 μL T4 PNK.
      BEMÆRK: De fremadgående og omvendte primere i trin 1.1.1 er et par oligoer. Fosforylat og glød oligoerne i en termocykler ved hjælp af følgende parametre: 37 °C i 30 min; 95 °C i 5 min. rampe ned til 25 °C ved 5 °C pr. minut.
    5. De phosphorylerede og udglødede oligoer fortyndes 200 gange ved tilsætning af 1 μL oligoreagens til 199 μL nukleasefrit vand ved stuetemperatur (RT).
    6. Ligeringsreaktionen indstilles og inkuberes ved RT i 10 minutter ved at blande følgende: 50 ng Bbs1 fordøjet plasmid fra trin 1.1.3, 1 μL oligo duplex fra trin 1.1.5, 5 μL 2x ligeringsbuffer, 1 μL ligase og fyld op til 10 μL ved hjælp af nukleasefrit vand.
    7. Transformér ligeringsblandingen og sekventér de positive kolonier til næste trin.
      BEMÆRK: Brug U6 fremadgående eller omvendt primer til sekventering.
      1. Tø de kompetente celler op på is.
      2. Tag 50 μL af de kompetente celler i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
      3. Der tilsættes 1 μL af ligeringsblandingen fra trin 1.1.6 til de kompetente celler.
      4. Bland forsigtigt ved at pipettere op og ned i røret tre gange.
        BEMÆRK: Må ikke hvirvles.
      5. Læg blandingen på is i 30 min.
      6. Varmechok blandingen ved 42 °C i 90 s.
      7. Tilsæt 950 μL stuetemperatur Luria-Bertani (LB) bouillon uden antibiotikum til røret.
      8. Røret anbringes i en ryster ved 300 o/min ved 37 °C i 60 min.
      9. Cylinderpladerne (pepton, pepton fra kasein, natriumchlorid, agar-agar og ampicillin) opvarmes til 37 °C på forhånd.
      10. Spred 50-100 μL af cellerne og ligeringsblandingen på pladerne ved RT.
      11. Inkuber pladerne natten over ved 37 °C.
      12. Hent 12 kolonier fra pladen og overfør dem til LB-mediet med ampicillin. Placer mediet på en shaker ved 300 o / min i 60 min.
      13. Brug 1 μL af bakterieopløsningen (fra trin 1.1.7.12) som skabelon for PCR og vælg de positive kolonier.
      14. Sekvenser de positive kolonier med U6-primerne, brug kolonien med de designede sgRNA-sekvenser i det næste trin.
    8. Plasmidet ekstraheres ved hjælp af et midi-sæt (se Materialetabel).
      BEMÆRK: Kvaliteten og mængden af plasmidet ved hjælp af et minisæt er ikke nok til følgende nukleofektionsforsøg. Midi eller maxi kit er mere egnet end mini kit.
  2. HESC kultur og nukleofektion.
    BEMÆRK: Forvarm alle reagenser til RT.
    1. Optø 1 x 10 6 H9-celler i en forbelagt6-brønds plade med 10 μM Y-27632 (ROCK-hæmmer) og 2 ml frisk ncEpic-hiPSC/hESC-kulturmedium.
      BEMÆRK: Belæg 6-brøndspladen med 1% vækstfaktor reduceret kældermembranmatrix i mindst 30 minutter ved 37 °C før brug.
    2. Den næste dag skal du fjerne supernatanten, skylle cellerne med 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) og derefter tilføje 2 ml frisk ncEpic-hiPSC / hESC kulturmedium.
    3. Skift mediet hver dag med 2 ml frisk ncEpic-hiPSC/hESC dyrkningsmedium i de følgende 3-5 dage, indtil cellerne vokser til omkring 80% sammenløb.
    4. Passage en eller to gange for at justere tilstanden af hESC.
      BEMÆRK: Den nemmeste måde at identificere tilstanden af hESC er morfologien.
    5. Kultur de udifferentierede H9-celler i en 6-brønds plade, indtil de når 80% sammenløb.
    6. Medium 2 timer før nukleofektionen ændres med 2 ml frisk ncEpic-hiPSC/hESC-kulturmedium blandet med 10 μM Y-27632 og forcoat en brønd af en 12-brønds plade ved hjælp af 1% vækstfaktorreduceret kældermembranmatrix.
    7. Aspirer mediet og skyl med 1 ml forvarmet DPBS.
    8. DPBS fjernes og inkuberes med 1 ml celledissociationsenzym (se materialetabel) i 3,5 minutter ved 37 °C.
    9. Tilsæt 1 ml frisk ncEpic-hiPSC/hESC-kulturmedium til cellerne og pipetter to gange for at gøre H9-cellerne til en enkeltcellesuspension.
    10. Tag 100 μL af blandingen ud til celletælling, og overfør de resterende til et 15 ml centrifugerør indeholdende yderligere 2 ml ncEpic-hiPSC/hESC-kulturmedium indeni.
    11. Centrifuge ved 200 x g i 5 min. Supernatanten fjernes, og ca. 2 x 106 celler resuspenderes til et reaktionsvolumen på 100 μL. I henhold til producentens protokol skal du optimere volumenet for cellerne, plasmiderne, nukleofenktoren og reaktionsbetingelserne. Se materialetabel for det nukleofektionssystem, der anvendes i denne protokol.
      BEMÆRK: Generelt er bobler ikke tilladt under nukleotektionen.
    12. Efter transfektion overføres cellerne til den præcoated 12-brøndsplade, suppleres med 1,5 ml ncEpic-hiPSC / hESC-kulturmedium og 10 μM Y-27632, og derefter dyrkes cellerne i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
    13. Skift mediet dagligt. Efter 48 timer tilsættes 2 μg/ml puromycin til cellevalg omkring en uge.
      BEMÆRK: Talrige celler dør i løbet af de første 3 dage. De resterende celler kan formere sig og generere til kolonier i den følgende uge efter puromycin-udvælgelsen. I udvælgelsesugen skal du sikre dig, at mediet altid indeholder 2 μg/ml puromycin.
    14. Vælg kolonierne manuelt under et mikroskop.
      BEMÆRK: Kolonimorfologien er den samme som hES-kolonien. Skær kolonierne i stykker (2-6 stykker pr. koloni) med en 10 μL hvid/normal pipettespids i mediet og overfør en koloni til en forbelagt brønd af en 12-brønds plade.
    15. Først skal du identificere RB1-mutationerne og off-target-situationerne (tabel 1) og derefter pluripotens for at karakterisere RB1 knockout H9-cellelinjen.
      BEMÆRK: Detekter RB1-mutationerne og off-target-situationerne ved hjælp af PCR og sanger-sekventering. Identificer pluripotensmarkørerne ved RT-PCR og immunfluorescens.

2. Generering af humant retinoblastom

  1. Vedligeholdelse af RB1-KO hESC.
    1. Kultur de genredigerede H9-celler i en vækstfaktor reduceret kældermembranmatrix belagt 6-brøndsplade med 2 ml ncEpic-hiPSC / hESC kulturmedium og skift medium hver dag.
    2. Passage ved hjælp af EDTA-buffer i 3,5 min ved 37 °C eller 5 min ved RT.
      BEMÆRK: EDTA-buffer er blandingen af 1x DPBS, 5 mM EDTA og 0,9 mg / ml NaCl.
  2. Retinal celle differentiering.
    BEMÆRK: Forbered Medium I før differentieringen. For at forberede medium I blandes 24,5 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) / næringsblanding F-12 (F12) -glutamin (1x), 24,5 ml neuronalt basalt medium, 250 μL 100x supplement A, 500 μL 50x supplement B, 0,1 mM ß-mercaptoethanol og 250 μL 100x L-glutamin. Forvarm alle blandinger til RT før brug.
    1. Dyrk RB1-KO hESC til 80% sammenløb i en brønd af en 6-brøndsplade.
    2. Fjern mediet og skyl cellerne med 1 ml 1x DPBS.
    3. Cellekolonierne hæves ved hjælp af 1 ml dispasebuffer (se materialetabel) i 5 minutter ved 37 °C.
      BEMÆRK: Kontroller cellekolonierne under et mikroskop. Normalt tager det 5 min for kanten af kolonierne at rulle ud.
    4. Aspirer dispasebufferen og skyl forsigtigt cellerne en gang med 1 ml 1x DPBS.
    5. Tilsæt 1 ml Medium I i brønden.
    6. Skær kolonierne i stykker (6-9 stykker pr. koloni) med en 10 μL hvid/normal pipettespids i mediet.
      BEMÆRK: Generelt løsner omkring 60% -70% af cellerne sig fra brønden. Brug en celleskraber til at skrabe de resterende celler i mediet.
    7. Høst alle cellerne ved centrifugering i et 15 ml rør ved 200 x g i 5 min.
    8. Lad ca. 50 μL af supernatanten være for at sprede cellerne i mediet, og bland derefter cellerne med 250 μL vækstfaktorreduceret kældermembranmatrix ved blid omrøring.
      BEMÆRK: Hold vækstfaktoren reduceret kældermembranmatrix enten ved 4 °C eller på isen før brug. Hvis det er aliquoted og opbevares ved -20 °C, anbringes det ved 4 °C natten over eller mindst 1 time før brug.
    9. Hold 15 ml røret med de suspenderede celler i en 37 ° C inkubator i 20 minutter.
      BEMÆRK: Sørg for, at cellerne og vækstfaktorreduceret kældermembranmatrix danner en størknet gel.
    10. Tilsæt 1 ml Medium I i 15 ml røret, og pipetter derefter let den størknede gel to til tre gange for at sprede klumpen med en 1 ml pipette.
    11. Tilsæt 9 ml Medium I og overfør cellesuspensionen til en 10 cm cellekulturskål.
    12. Skålen flyttes til en 37 °C inkubator med 5 % CO2 og indstilles dagen til dag 0.
    13. Undersøg cellerne ved hjælp af et mikroskop på dag 1.
      BEMÆRK: Tusindvis af hule cyster kunne observeres i skålen. I gennemsnit observeres 3 til 4 cyster i et stykke gel.
    14. Skift mediet på dag 5. Saml supernatanten i et 15 ml rør, vent på, at cysterne sætter sig til bunden, og fjern derefter mediet og udskift det med frisk medium I.
      BEMÆRK: Hvis mediet bliver gult på dag 4, skal du ændre mediet på dag 4, ellers på dag 5. Tilsæt 10 ml frisk Medium I i den originale skål. Hundredvis af cyster har allerede knyttet sig til dyrkningsoverfladen; hold dem der.
    15. Spred cysterne i røret i to 10 cm skåle.
      BEMÆRK: Sørg for, at mindst 300 cyster er i en skål. Hvis cysterne ikke er sammenflydende, må du ikke adskille cysterne i andre retter; returner dem til den originale 10 cm skål.
    16. På dag 7 fastgøres de fleste cyster (over 95%) til skålen, spredes ud og danner vedhængende kolonier.
      BEMÆRK: Allerede på dag 3 kan de vedhængende kolonier observeres.
    17. På dag 10 skal du skifte medium med frisk Medium I. Sørg for, at alle cyster er fastgjort til skålen.
    18. Forbered medium II før næste trin ved at blande følgende: 36 ml DMEM, 12 ml F12, 2% supplement B (v / v), 0,1 mM MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning (NEAA).
    19. Sørg for, at cellerne er spredt ud på dag 13-17. Udfør det næste trin på dag 15, når cellerne er spredt ud, men ikke interagerer med de nærliggende kolonier.
    20. Skyl cellerne én gang med 1 ml DPBS og tilsæt 1 ml dispaseopløsning i 5 minutter ved 37 °C.
      BEMÆRK: Inden for 5 minutter hæves kanten af cellerne.
    21. Fjern dispasebufferen og skyl forsigtigt kulturerne med 1 ml 1x DPBS.
    22. Der tilsættes 10 ml Medium II til hver 10 cm skål og dyrkning i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
    23. De vedhængende kulturer løsner spontant efter 24 timer og samles i retinale organoider.
      BEMÆRK: Talrige celler, der ikke danner organoiderne, vil dø i de følgende 2 dage.
    24. Tre dage efter løsrivelse skal du samle cellerne fra cellekulturskålen og lade organoiderne slå sig ned i et 15 ml rør.
    25. Fjern supernatanten fra røret, og overfør organoiderne til en ny ikke-klæbende skål (petriskål) med 10 ml medium II i de følgende fire dage.
    26. Forbered medium III ved at blande DMEM: F12 ved 3: 1-forhold (v / v), 2% supplement B (v / v), 0,1 mM MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning (NEAA), 8% føtalt kvægserum (FBS) (v / v), 100 μM taurin og 2 mM glutamin.
    27. En uge efter løsningen skal du ændre mediet til medium III.
    28. Fra denne dag og fremefter dyrkes organoiderne i Medium III og opfriskes mediet to gange om ugen.
  3. Etablering af RB-cellelinje.
    BEMÆRK: Alle reagenser er forvarmet ved RT.
    1. På dag 90 omfatter RB'erne (80%-90%) retinale organoider. Vælg derfor de 90-dages RB-organoider til generering af RB-cellelinjen.
    2. Forbered 1640-mediet ved at blande Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640-mediet med 10% FBS.
    3. Skær RB i stykker (20-25 stykker pr. RB) med en mikrokirurgisk kniv under et mikroskop i RPMI-1640 medium.
    4. Fjern RPMI-1640-mediet, og behandl stykkerne med 0,25% Trypsin/EDTA i 10 minutter ved 37 °C.
    5. Tilsæt RPMI-1640-mediet for at afslutte reaktionen og centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter.
    6. Fjern supernatanten og suspender cellerne i 1640 medium i en ikke-klæbende skål.
    7. RB-cellelinjen er en flydende kultur. Skift mediet to gange om ugen og passage RB-cellerne inden for 2 uger.
      BEMÆRK: Proliferationshastigheden for primære RB-celler er ret langsom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Proceduren for RB-generering er belyst i figur 1, som kombinerer den vedhæftede og flydende kultur. Det var muligt at høste den humane RB fra RB1-KO hESC og opnå RB-cellelinjen ved at isolere RB-organoiderne.

Her giver protokollen detaljer om differentieringen i forskellige faser (figur 2). Hule kugler dannes i de første 3 dage, som fastgøres til dyrkningsoverfladen og derefter udvides (figur 2A-E). Fra dag 15 og fremefter hæves cellerne og kulturen ophænges (figur 2F). Dagen efter løsrivelsen dannes retinale organoider, og de lyse fælge er synlige (figur 2G, sorte pile). Desuden vil disse celler uden for organoiderne sandsynligvis dø i den følgende uge (figur 2G, orange pile). På dag 27 er den optiske vesikelarkitektur tydelig, og omkring 90% af organoiderne viser denne struktur (figur 2H); organoiderne uden denne struktur kunne kasseres. Den første påvisning af RB sker på dag 45, og derefter bliver den håndgribelig på dag 50 (figur 2I). Når den vokser til dag 90, er de optiske vesikelstrukturer hovedsageligt omsluttet af RB (figur 2J). I mellemtiden kunne RB isoleres som en RB-cellelinje til yderligere kultur (figur 2K). Over 80% retinale organoider ville være fuldt omsluttet af RB på dag 105 (figur 2L). De viser stærkt ekspression af Ki67 (proliferationsmarkør) og SYK (onkogenmarkør) sammenlignet med de H9-afledte retinale organoider, hvilket indikerer tumorigenesen i RB-organoiderne (figur 2M, N). Derudover viser den høje ekspression af ARR3 (kegleforløberproducent) og CRX (fotoreceptorforløbermarkør) i RB-organoiderne, at de stammer fra kegleprecursorceller (figur 2O, P).

Proceduren for RB-generering gennemgår hovedsageligt tre faser med morfologiændringer før RB-dannelsen; her giver undersøgelsen de ringere og overlegne resultater på disse stadier (figur 3). Differentieret og udifferentieret hESC (figur 3A,B) er let at skelne fra morfologien, og den udifferentierede hESC er valgt til RB-dannelse. På dag 5 skal en hul kugle generere (figur 3D) i stedet for den faste (figur 3C). RB er afledt af retinale organoider, som viser optisk vesikelarkitektur (figur 3F). Der er ingen RB, der ville generere i de ringere organoider (figur 3E).

Figure 1
Figur 1: Skematisk visning af RB-organoidernes differentiering. Dag 0-dag 15 er cellerne 2D-kultur i medium I, og efter dag 15 er cellerne suspensionskultur. RB dannes omkring dag 45. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: RB-generering og karakterisering. (A-C) Proceduren i det tidlige stadium, hESC er forhøjet for at danne cysterne. De sorte pile i (B) viser de rullede kanter af hESC efter dispasebehandling. (D,E) Cysterne fastgøres til pladerne (D) og udvides derefter (E). (F) Vedhæftede celler er forhøjet til dannelse af retinale organoider. Sorte pile angiver de rullede kanter efter dispasebehandling. (G,H) Tidlige dage retinale organoider uden RB. (I, J) Nethindeorganoiderne med RB på dag 50 (I) og dag 90 (J), de grønne cirkler beviser RB-delene. (K) Den isolerede RB-cellelinje fra 90-dages retinale organoider. (L) RB-organoiderne på dag 105. (M-P) Immunfluorescensbillederne for onkogenmarkørerne (M,N) og fotoreceptormarkørerne (O,P). I A-L er skalabjælker = 200 μm; i M-P, skalabjælker = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning af de negative og positive resultater. De ringere og overlegne billeder til differentiering på dag 0 (A, B), dag 5 (C, D) og dag 30 (E, F). Skalabjælker = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Humant retinoblastom (RB) er forårsaget af inaktivering af RB1 og dysfunktion af Rb-protein. I denne protokol er RB1-KO hESC det afgørende trin for generering af RB i en skål. Selv med RB1-/- hESC er det muligt, at der ikke er nogen RB-dannelse på grund af metoderne til retinal organoiddifferentiering10. I denne protokol er overførslen fra tilhængerkultur til flydende kultur afgørende i differentieringsprocessen. Tætheden af cysterne, typer af pluripotente stamceller og spredningshastigheden er alle de variabler, der vil påvirke tidspunktet for løsrivelse. Det er ønskeligt at løsne cellerne, når de udvides, men ikke interageres af nabokolonier9. Hvis kolonierne støder op til, vil det føre til de sammenhængende retinale organoider og derefter reducere differentieringseffektiviteten.

Ved at følge trinene kritisk, ville det være uproblematisk at høste RB. Denne metode kunne imidlertid kun modellere RB med den bialleliske inaktivering af RB1. For de arvelige RB-patienter, der havde heterozygot RB1-mutation, er det ikke muligt at efterligne processen med tumorigenese med den heterozygote RB1-mutation 11. Ikke desto mindre er det stadig en optimal RB-model, fordi den i øjeblikket er tættest på den faktiske RB-tumorigenese hos patienter1. Det deler samme oprindelse med primær RB 3,12 og overvinder artsforskellen mellem musemodeller eller forenklet todimensionelt miljø af udødeliggjorte kræftcellelinjer 3,12,13.

Den menneskelige RB er etableret i en skål afledt af human ESC ved hjælp af den beskrevne metode, og den udviser stor lighed med menneskets primære RB. Derfor ville det give en ideel platform til belysning af den molekylære patologi af human RB og screening af farmakologiske midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne er ikke opmærksomme på nogen tilknytninger, medlemskaber, finansiering eller økonomiske beholdninger, der kan påvirke objektiviteten af denne undersøgelse.

Acknowledgments

Vi takker 502-teamet for al hjælpen. Dette arbejde er delvist støttet af Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) og National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Anti-ARR3 Sigma HPA063129 Antibody
Anti-CRX (M02) Abnove ABN-H00001406-M02 Antibody
Anti-Ki67 Abcam  ab15580 Antibody
Anti-Syk (D3Z1E) Cell Signaling Technology 13198 Antibody
BbsI NEB R3539S Restriction enzymes
Dispase (1U/mL) Stemcell Technologies 7923
DMEM basic Gibco 10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX Gibco 10565-042
DMSO Sigma D2650
DPBS Gibco C141905005BT
EDTA Thermo 15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells Biological Industry 04-002-1A
Glutamine Gibco 35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) Gibco 11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) Sigma M7145
Neurobasal Medium Gibco 21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S Lonza V4XP-3032 Nucleofection kit
Pen Strep Gibco 15140-122
Puromycin Gene Operation ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium Nuwacell RP01001 ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix BD 356231 Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme Gibco 12563-011 TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit QIAGEN 75144
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74104
Supplement A Life Technologies 17502-048 N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B Life Technologies 17105-041 B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase Life Technologies EK0032
Taurine Sigma T-8691-25G
Y-27632 2HCl Selleck S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro Addgene 42230
Nucleofector 4D Lonza
RPMI Sigma R0883-500ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  2. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
  3. Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
  4. Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. The biology of retinoblastoma. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).
  5. Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
  6. Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
  7. Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
  8. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  9. Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
  10. Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
  11. Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
  12. Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
  13. Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).

Tags

Kræftforskning udgave 188
Rekonstruere humant retinoblastom in vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct… More

Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct Human Retinoblastoma In Vitro. J. Vis. Exp. (188), e62629, doi:10.3791/62629 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter