Summary
We beschrijven een methode voor het genereren van humaan retinoblastoom (RB) door biallelische RB1-mutaties in menselijke embryonale stamcellen (hESC) te introduceren. RB-cellijnen kunnen ook met succes worden gekweekt met behulp van de geïsoleerde RB in een schaal.
Abstract
Menselijke RB is kinderkanker, die dodelijk is als er geen behandeling wordt toegediend. Aangezien RB afkomstig is van kegelvoorlopers, wat relatief zeldzaam is in knaagdiermodellen, is een ziektemodel dat is afgeleid van mensen en knaagdieren, wat betreft de interspecies-verschillen tussen mensen, gunstiger voor het blootleggen van de mechanismen van menselijke RB en het zoeken naar de doelen van therapie. Hierin beschrijft het protocol de generatie van twee gen-bewerkte hESC-lijnen met respectievelijk een biallelische RB1-puntmutatie (RB1Mut/Mut) en een RB1 knock-outmutatie (RB1-/-). Tijdens het proces van retinale ontwikkeling wordt de vorming van RB waargenomen. De RB-cellijnen worden ook vastgesteld door te scheiden van de RB-organoïden. Al met al, door de gen-bewerkte hESC-lijnen te differentiëren in de retinale organoïden met behulp van een 2D- en 3D-gecombineerd differentiatieprotocol, hebben we met succes de menselijke RB in een schotel gereconstrueerd en de oorsprong van de kegelvoorloper geïdentificeerd. Het zou een nuttig ziektemodel bieden voor het observeren van de genese, proliferatie en groei van retinoblastoom, evenals het verder ontwikkelen van nieuwe therapeutische middelen.
Introduction
Humaan retinoblastoom (RB) is een zeldzame, fatale tumor afgeleid van de retinale kegel-precursoren 1,2,3, is het meest voorkomende type intraoculaire maligniteit in de kindertijd4. Homozygote inactivatie van het RB1-gen is de initiërende genetische laesie in RB5. Muizen met RB1-mutaties slagen er echter niet in om de retinale tumor te vormen2. Hoewel de muistumoren kunnen worden gegenereerd met de combinatie van Rb1-mutaties en andere genetische modificaties, missen ze nog steeds de kenmerken van menselijke RB6. Dankzij de ontwikkeling van retinale organoïde differentiatie kon de hESC-afgeleide RB worden verkregen, met de karakters van menselijke RB1.
Talrijke protocollen voor retinale organoïde differentiatie zijn in het afgelopen decennium vastgesteld, waaronder 2D7, 3D8 en een combinatie van 2D en 3D9. De methode die hier wordt gebruikt om de menselijke RB te genereren, is de consolidatie van de aanhankelijke cultuur en de zwevende cultuur9. Door de RB1 gemuteerde hESC te differentiëren in retinale organoïden, wordt de vorming van RB gedetecteerd rond dag 45 en vervolgens prolifereert het snel rond dag 60. Op dag 90 is isolatie van KB's en generatie van de RB-cellijn mogelijk; bovendien omringt RB bijna alle retinale organoïden op dag 120.
hESC-afgeleide RB is een innovatief model voor het onderzoeken van de oorsprong, tumorigenese en behandelingen voor RB. In dit protocol worden de generatie van genbewerking hESC, de differentiatie van RB en karakterisering voor RB in detail beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie is goedgekeurd door de institutionele ethische commissie van het Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESCs worden verkregen van het WiCell Research Institute.
1. Generatie van RB1 gemuteerde hESC
- CRISPR/Cas9 richt vector voor de knock-out (KO) van RB1.
- Ontwerp een paar sgRNA. Richt u voor de ablatie van RB1 op het eerste exon van dit gen. De voorwaartse primersequentie is CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG en de omgekeerde primersequentie is AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
OPMERKING: Voor de specifieke RB1-mutatie is ook een gerepareerde sjabloon vereist. In dit protocol wordt RB1-KO cellijn als voorbeeld gebruikt. - Vergist 1 μg pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro met BbsI-restrictie-enzymen (zie Materiaaltabel) gedurende 30 minuten bij 37 °C volgens de instructies van de fabrikant.
- Zuiver de verteerde plasmiden met behulp van een zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Enzymatische reacties kunnen direct worden opgeruimd zonder agarose-gel met behulp van de zuiveringskit (zie Materiaaltabel). - Fosforylaat en gloeien elk paar oligo's met behulp van het T4 polynucleotidekinase (PNK) (Materiaaltabel) met als reactie 1 μL oligo1 (100 μM), 1 μL oligo2 (100 μM), 1 μL 10x T4 Ligatiebuffer, 6,5 μL ddH2O en 0,5 μL T4 PNK.
OPMERKING: De voor- en achterwaartse primers in stap 1.1.1 zijn een paar oligo's. Fosforylaat en gloei de oligo's in een thermocycler met behulp van de volgende parameters: 37 °C gedurende 30 minuten; 95 °C gedurende 5 min; helling naar beneden bij 25 °C bij 5 °C per minuut. - Verdun de gefosforyleerde en gegloeide oligo's 200 keer door 1 μL oligoreagens toe te voegen aan 199 μL nucleasevrij water bij kamertemperatuur (RT).
- Stel de ligatiereactie in en incubeer op RT gedurende 10 minuten door het volgende te mengen: 50 ng Bbs1 vergist plasmide uit stap 1.1.3, 1 μL oligo duplex uit stap 1.1.5, 5 μL 2x ligatiebuffer, 1 μL ligase en vul aan tot 10 μL met nucleasevrij water.
- Transformeer het ligatiemengsel en rangschik de positieve kolonies voor de volgende stap.
OPMERKING: Gebruik U6 vooruit of achteruit primer voor sequencing.- Ontdooi de competente cellen op ijs.
- Neem 50 μL van de competente cellen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 1 μL van het ligatiemengsel uit stap 1.1.6 toe aan de bevoegde cellen.
- Meng voorzichtig door drie keer op en neer te pipetteren in de buis.
OPMERKING: Draai niet vortex. - Leg het mengsel gedurende 30 minuten op ijs.
- Hitteschok het mengsel bij 42 °C gedurende 90 s.
- Voeg 950 μL Luria-Bertani (LB) bouillon op kamertemperatuur zonder antibioticum toe aan de buis.
- Plaats de buis in een shaker bij 300 rpm bij 37 °C gedurende 60 min.
- Verwarm de LB-platen (pepton, pepton uit caseïne, natriumchloride, agar-agar en ampicilline) van tevoren tot 37 °C.
- Verdeel 50-100 μL van de cellen en het ligatiemengsel op de platen bij RT.
- Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
- Pak 12 kolonies van de plaat en breng ze over naar het LB-medium met ampicilline. Plaats het medium op een shaker bij 300 rpm gedurende 60 min.
- Gebruik 1 μL van de bacterieoplossing (uit stap 1.1.7.12) als sjabloon voor PCR en selecteer de positieve kolonies.
- Sequentieer de positieve kolonies door de U6-primers, gebruik de kolonie met de ontworpen sgRNA-sequenties in de volgende stap.
- Extraheer het plasmide met behulp van een midikit (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De kwaliteit en de kwantiteit van het plasmide met behulp van een minikit zijn niet voldoende voor het volgende nucleofection-experiment. Midi of maxi kit is meer geschikt dan de mini kit.
- Ontwerp een paar sgRNA. Richt u voor de ablatie van RB1 op het eerste exon van dit gen. De voorwaartse primersequentie is CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG en de omgekeerde primersequentie is AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
- HESC cultuur en nucleofection.
OPMERKING: Prewarm alle reagentia voor op RT.- Ontdooi 1 x 106 H9 cellen in een voorgecoate 6-well plaat met 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitor) en 2 ml vers ncEpic-hiPSC/hESC kweekmedium.
OPMERKING: Bekleed de 6-well plaat met 1% groeifactor gereduceerde keldermembraanmatrix gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C voor gebruik. - Verwijder de volgende dag het supernatant, spoel de cellen af met 1x Dulbecco's Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (DPBS) en voeg vervolgens 2 ml vers ncEpic-hiPSC / hESC-kweekmedium toe.
- Verander het medium elke dag met 2 ml vers ncEpic-hiPSC / hESC-kweekmedium in de volgende 3-5 dagen totdat de cellen groeien tot ongeveer 80% samenvloeiing.
- Passage een of twee keer om de toestand van de hESC aan te passen.
OPMERKING: De eenvoudigste manier om de toestand van de hESC te identificeren, is de morfologie. - Kweek de ongedifferentieerde H9-cellen in een 6-well plaat totdat ze 80% samenvloeiing bereiken.
- Verander het medium 2 uur voor de nucleofection met 2 ml vers ncEpic-hiPSC / hESC-kweekmedium gemengd met 10 μM Y-27632 en precoat een put van een 12-well plaat met behulp van 1% groeifactor verminderde keldermembraanmatrix.
- Aspirateer het medium en spoel af met 1 ml voorgewarmde DPBS.
- Verwijder de DPBS en incubeer met 1 ml celdissociatie-enzym (zie materiaaltabel) gedurende 3,5 min bij 37 °C.
- Voeg 1 ml vers ncEpic-hiPSC/hESC-kweekmedium toe aan de cellen en pipetteer tweemaal om van de H9-cellen een eencellige suspensie te maken.
- Haal 100 μL van het mengsel eruit voor het tellen van cellen en breng de resterende over naar een centrifugebuis van 15 ml met daarin nog eens 2 ml ncEpic-hiPSC/hESC-kweekmedium.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspenseer ongeveer 2 x 106 cellen in een reactievolume van 100 μL. Optimaliseer volgens het protocol van de fabrikant het volume voor de cellen, plasmiden, nucleofector en reactieomstandigheden. Zie Materiaaltabel voor het nucleofectionsysteem dat in dit protocol wordt gebruikt.
OPMERKING: Over het algemeen zijn bubbels niet toegestaan tijdens de nucleofection. - Breng na transfectie de cellen over naar de voorgecoate 12-wellsplaat, vul aan met 1,5 ml ncEpic-hiPSC / hESC-kweekmedium en 10 μM Y-27632 en kweek de cellen vervolgens in een 37 ° C, 5% CO2-incubator .
- Verander het medium dagelijks. Voeg na 48 uur ongeveer een week 2 μg/ml puromycine toe voor celselectie.
OPMERKING: Talrijke cellen sterven tijdens de eerste 3 dagen. De resterende cellen kunnen zich vermenigvuldigen en genereren in kolonies in de volgende week na de puromycineselectie. Zorg er in de selectieweek voor dat het medium altijd 2 μg/ml puromycine bevat. - Kies de kolonies handmatig onder een microscoop.
OPMERKING: De koloniemorfologie is hetzelfde als de hES-kolonie. Snijd de kolonies in stukjes (2-6 stuks per kolonie) met een 10 μL witte/normale pipetpunt in het medium en breng één kolonie over in één voorgecoate put van een 12-well plaat. - Identificeer eerst de RB1-mutaties en de off-target situaties (tabel 1) en vervolgens pluripotentie om de RB1 knock-out H9-cellijn te karakteriseren.
OPMERKING: Detecteer de RB1-mutaties en de off-target situaties met behulp van PCR- en sanger-sequencing. Identificeer de pluripotentiemarkers door RT-PCR en Immunofluorescentie.
- Ontdooi 1 x 106 H9 cellen in een voorgecoate 6-well plaat met 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitor) en 2 ml vers ncEpic-hiPSC/hESC kweekmedium.
2. Generatie van humaan retinoblastoom
- Onderhoud van RB1-KO hESC.
- Kweek de gen-bewerkte H9-cellen in een groeifactor gereduceerde keldermembraanmatrix gecoate 6-well plaat met 2 ml ncEpic-hiPSC / hESC-cultuurmedium en verander het medium elke dag.
- Passage met behulp van EDTA-buffer gedurende 3,5 min bij 37 °C of 5 min bij RT.
OPMERKING: EDTA-buffer is het mengsel van 1x DPBS, 5 mM EDTA en 0,9 mg / ml NaCl.
- Retinale celdifferentiatie.
OPMERKING: Bereid Medium I voor op de differentiatie. Meng voor medium I 24,5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/voedingsmengsel F-12(F12)-glutamine (1x), 24,5 ml neuronaal basaal medium, 250 μl 100x supplement A, 500 μl 50x supplement B, 0,1 mM ß-mercaptoethanol en 250 μL 100x L-glutamine. Verwarm alle mengsels voor gebruik op RT.- Laat de RB1-KO hESC groeien tot 80% samenvloeiing in één put van een 6-well plaat.
- Verwijder het medium en spoel de cellen af met 1 ml 1x DPBS.
- Verhoog de celkolonies met behulp van 1 ml dispasebuffer (zie Materiaaltabel) gedurende 5 minuten bij 37 °C.
OPMERKING: Controleer de celkolonies onder een microscoop. Meestal duurt het 5 minuten voordat de rand van de kolonies is uitgerold. - Zuig de dispase buffer aan en spoel de cellen eenmaal voorzichtig af met 1 ml 1x DPBS.
- Voeg 1 ml Medium I toe aan de put.
- Snijd de kolonies in stukjes (6-9 stuks per kolonie) met een 10 μL witte/normale pipetpunt in het medium.
OPMERKING: Over het algemeen maakt ongeveer 60% -70% van de cellen los van de put. Gebruik een celschraper om de resterende cellen in het medium te schrapen. - Oogst alle cellen door centrifugeren in een buis van 15 ml bij 200 x g gedurende 5 minuten.
- Laat ongeveer 50 μL van het supernatant achter om de cellen in het medium te verspreiden en meng vervolgens de cellen met 250 μL groeifactor gereduceerde keldermembraanmatrix door voorzichtige agitatie.
OPMERKING: Houd de groeifactor gereduceerde keldermembraanmatrix bij 4 °C of op het ijs voor gebruik. Als het wordt gealiquoteerd en bewaard bij -20 °C, breng het dan 's nachts bij 4 °C of ten minste 1 uur voor gebruik. - Houd de buis van 15 ml met de gesuspendeerde cellen gedurende 20 minuten in een incubator van 37 °C.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen en groeifactor gereduceerde keldermembraanmatrix een gestolde gel vormen. - Voeg 1 ml Medium I toe aan de buis van 15 ml en pipetteer vervolgens de gestolde gel twee tot drie keer lichtjes om de klomp met een pipet van 1 ml te verspreiden.
- Voeg 9 ml Medium I toe en breng de celsuspensie over in een celkweekschaal van 10 cm.
- Verplaats het gerecht naar een incubator van 37 °C met 5% CO2 en stel de dag in als dag 0.
- Onderzoek de cellen met behulp van een microscoop op dag 1.
OPMERKING: Duizenden holle cysten konden in het gerecht worden waargenomen. Gemiddeld worden 3 tot 4 cysten waargenomen in één stuk gel. - Verander het medium op dag 5. Verzamel het supernatant in een buis van 15 ml, wacht tot de cysten naar de bodem zijn bezinkt en verwijder vervolgens het medium en vervang het door vers Medium I.
OPMERKING: Als het medium geel wordt op dag 4, verander dan het medium op dag 4, anders op dag 5. Voeg 10 ml verse Medium I toe aan het originele gerecht. Honderden cysten hebben zich al aan het kweekoppervlak gehecht; houd ze daar. - Verspreid de cysten in de buis in twee schotels van 10 cm.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er minstens 300 cysten in een schaal zitten. Als de cysten niet confluent zijn, scheid de cysten dan niet in andere gerechten; breng ze terug naar de originele schaal van 10 cm. - Op dag 7 hechten de meeste cysten (boven de 95%) zich aan het gerecht, verspreiden zich en vormen aanhangende kolonies.
OPMERKING: Al op dag 3 kunnen de aanhangende kolonies worden waargenomen. - Vervang op dag 10 het medium met verse Medium I. Zorg ervoor dat alle cysten aan het gerecht zijn bevestigd.
- Bereid Medium II voor de volgende stap door het volgende te mengen: 36 ml DMEM, 12 ml F12, 2% supplement B (v / v), 0,1 mM MEM niet-essentiële aminozurenoplossing (NEAA).
- Zorg ervoor dat de cellen op dag 13-17 zijn uitgespreid. Voer de volgende stap uit op dag 15 wanneer de cellen zijn verspreid maar geen interactie hebben met de naburige kolonies.
- Spoel de cellen eenmaal af met 1 ml DPBS en voeg gedurende 5 minuten bij 37 °C 1 ml dispase-oplossing toe.
OPMERKING: Binnen 5 minuten wordt de rand van de cellen omhoog. - Verwijder de dispase buffer en spoel de culturen voorzichtig af met 1 ml 1x DPBS.
- Voeg 10 ml Medium II toe aan elke schaal en kweek van 10 cm in een 37 °C, 5% CO2 incubator.
- De aanhangende culturen maken zich na 24 uur spontaan los en verzamelen zich tot retinale organoïden.
OPMERKING: Talrijke cellen die de organoïden niet vormen, zouden in de volgende 2 dagen sterven. - Verzamel drie dagen na het losmaken de cellen uit de celkweekschaal en laat de organoïden zich in een buis van 15 ml nestelen.
- Verwijder het supernatant uit de buis en breng de organoïden over naar een nieuwe niet-hechtende schaal (petrischaal) met 10 ml Medium II gedurende de volgende vier dagen.
- Bereid Medium III door DMEM: F12 te mengen in een verhouding van 3:1 (v/v), 2% supplement B (v/v), 0,1 mM MEM Niet-essentiële aminozuren oplossing (NEAA), 8% foetaal runderserum (FBS) (v/v), 100 μM taurine en 2 mM glutamine.
- Een week na de onthechting, verander het medium naar Medium III.
- Kweek vanaf deze dag de organoïden in Medium III en ververs het medium twee keer per week.
- Oprichting van RB-cellijn.
OPMERKING: Alle reagentia worden voorbewarmd op RT.- Op dag 90 omvatten de KB's (80%-90%) de retinale organoïden. Kies daarom de 90-daagse RB-organoïden voor de generatie van de RB-cellijn.
- Bereid het 1640-medium voor door het Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640-medium te mengen met 10% FBS.
- Snijd de RB in stukjes (20-25 stuks per RB) met een microchirurgisch mes onder een microscoop in RPMI-1640 medium.
- Verwijder het RPMI-1640 medium en behandel de stukken met 0,25% Trypsin/EDTA gedurende 10 min bij 37 °C.
- Voeg het RPMI-1640 medium toe om de reactie te beëindigen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g .
- Verwijder het supernatant en resuspenseer de cellen in 1640 medium in een niet-hechtende schaal.
- De RB-cellijn is een zwevende cultuur. Verander het medium twee keer per week en passeer de RB-cellen binnen 2 weken.
OPMERKING: De proliferatiesnelheid van primaire RB-cellen is vrij traag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De procedure van RB-generatie wordt toegelicht in figuur 1, die de aanhankelijke en zwevende cultuur combineert. Het was mogelijk om de menselijke RB uit RB1-KO hESC te oogsten en de RB-cellijn te verkrijgen door de RB-organoïden te isoleren.
Hier geeft het protocol de details van de differentiatie in verschillende fasen (figuur 2). Holle bollen worden gevormd in de eerste 3 dagen die zich hechten aan het kweekoppervlak en vervolgens uitzetten (figuur 2A-E). Vanaf dag 15 zijn cellen verhoogd en kweken ze in suspensie (figuur 2F). De dag na de loslating worden retinale organoïden gevormd en zijn de heldere randen zichtbaar (figuur 2G, zwarte pijlen). Bovendien zullen die cellen buiten de organoïden waarschijnlijk in de volgende week sterven (figuur 2G, oranje pijlen). Op dag 27 is de optische blaasjesarchitectuur duidelijk en ongeveer 90% van de organoïden vertoont deze structuur (figuur 2H); de organoïden zonder deze structuur konden worden weggegooid. De eerste detectie van de RB vindt plaats op dag 45 en vervolgens wordt deze voelbaar op dag 50 (figuur 2I). Wanneer het groeit tot dag 90, worden de optische blaasjesstructuren voornamelijk omhuld door de RB (figuur 2J). Ondertussen kan de RB worden geïsoleerd als een RB-cellijn voor verdere kweek (figuur 2K). Meer dan 80% retinale organoïden zouden op dag 105 volledig worden omhuld door de RB (figuur 2L). Ze vertonen in hoge mate expressie van Ki67 (proliferatiemarker) en SYK (oncogenmarker) in vergelijking met de van H9 afgeleide retinale organoïden, wat de tumorigenese in de RB-organoïden aangeeft (figuur 2M, N). Bovendien toont de hoge expressie van ARR3 (cone precursor maker) en CRX (photoreceptor precursor marker) in de RB organoïden aan dat ze afkomstig zijn van kegelvoorlopercellen (figuur 2O,P).
De procedure van RB-generatie ondergaat voornamelijk drie stadia met morfologische veranderingen vóór de RB-vorming; hier geeft de studie de inferieure en superieure resultaten in die stadia (figuur 3). Gedifferentieerde en ongedifferentieerde hESC (figuur 3A,B) is gemakkelijk te onderscheiden van de morfologie en de ongedifferentieerde hESC wordt gekozen voor RB-vorming. Op dag 5 moet een holle bol ontstaan (figuur 3D) in plaats van de vaste bol (figuur 3C). De RB is afgeleid van de retinale organoïden, die optische blaasjesarchitectuur vertonen (figuur 3F). Er is geen RB die zou genereren in de inferieure organoïden (figuur 3E).
Figuur 1: Schematische weergave van de differentiatie van de RB-organoïden. Dag 0-dag 15, de cellen zijn 2D-cultuur in medium I en na dag 15 zijn de cellen suspensiecultuur. RB wordt gevormd rond dag 45. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: RB-generatie en karakterisering. (A-C) De procedure van het vroege stadium, hESC, is verhoogd om de cysten te vormen. De zwarte pijlen in (B) tonen de gerolde randen van hESC na dispase behandeling. (D,E) De cysten hechten zich aan de platen (D) en zetten dan uit (E). (F) Adherente cellen zijn verhoogd om de retinale organoïden te vormen. Zwarte pijlen geven de gerolde randen aan na een behandeling. (G,H) Vroege dagen retinale organoïden zonder RB. (I, J) De retinale organoïden met RB op dag 50 (I) en dag 90 (J), de groene cirkels wijzen op de RB-delen. (K) De geïsoleerde RB-cellijn van 90-daagse retinale organoïden. (L) De RB-organoïden op dag 105. (M-P) De immunofluorescentiebeelden voor de oncogenmarkers (M,N) en fotoreceptormarkers (O,P). In A-L, schaalstaven = 200 μm; in M-P, schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van de negatieve en positieve resultaten. De inferieure en superieure beelden voor differentiatie op dag 0 (A,B), dag 5 (C,D) en dag 30 (E,F). Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Humaan retinoblastoom (RB) wordt veroorzaakt door de inactivatie van RB1 en de disfunctie van Rb-eiwit. In dit protocol is de RB1-KO hESC de cruciale stap voor het genereren van RB in een gerecht. Terwijl het zelfs met RB1-/- hESC mogelijk is dat er geen RB-vorming is als gevolg van de methoden van retinale organoïde differentiatie10. In dit protocol is de overgang van hechte cultuur naar zwevende cultuur essentieel in het proces van differentiatie. De dichtheid van de cysten, soorten pluripotente stamcellen en de proliferatiesnelheid zijn alle variabelen die de timing voor onthechting zouden beïnvloeden. Het is wenselijk om de cellen los te maken wanneer ze worden uitgebreid, maar niet worden beïnvloed door naburige kolonies9. Als de kolonies aangrenzend zijn, zou dit leiden tot de aaneengesloten retinale organoïden en vervolgens de differentiatie-efficiëntie verminderen.
Door de stappen kritisch te volgen, zou het onbekommerd zijn om de RB te oogsten. Deze methode kon echter alleen RB modelleren met de biallelische inactivatie van RB1. Voor de erfelijke RB-patiënten, die heterozygote RB1-mutatie hadden, is het niet in staat om het proces van tumorigenese na te bootsen met de heterozygote RB1-mutatie 11. Toch is het nog steeds een optimaal RB-model omdat het momenteel het dichtst bij de werkelijke RB-tumorigenese bij patiënten1 ligt. Het deelt dezelfde oorsprong met primaire RB 3,12 en overwint het soortverschil van muizenmodellen of vereenvoudigde tweedimensionale omgeving van vereeuwigde kankercellijnen 3,12,13.
De menselijke RB wordt vastgesteld in een schaal die is afgeleid van menselijke ESC met behulp van de beschreven methode en vertoont grote gelijkenis met menselijke primaire RB. Daarom zou het een ideaal platform bieden voor het ophelderen van de moleculaire pathologie van menselijke RB en screening van farmacologische middelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs zijn niet op de hoogte van affiliaties, lidmaatschappen, financiering of financiële holdings die de objectiviteit van deze studie kunnen beïnvloeden.
Acknowledgments
We bedanken het 502-team voor alle hulp. Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) en het National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
- Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
- Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E.
- Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
- Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
- Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
- Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
- Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
- Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).
