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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Rekonstruktion des humanen Retinoblastoms in vitro

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/62629
Automatic Translation
1, 1
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von humanem Retinoblastom (RB) durch Einführung biallelischer RB1-Mutationen in humane embryonale Stammzellen (hESC). RB-Zelllinien konnten auch erfolgreich mit dem isolierten RB in einer Schale kultiviert werden.

Abstract

Humane RB ist pädiatrischer Krebs, der tödlich ist, wenn keine Behandlung verabreicht wird. Da RB aus Zapfenvorläufern stammt, was in Nagetiermodellen relativ selten ist, ist ein vom Menschen und Nagetieren abgeleitetes Krankheitsmodell vorteilhafter, um die Mechanismen der menschlichen RB aufzudecken und die Ziele der Therapie zu suchen. Hierin beschreibt das Protokoll die Erzeugung von zwei geneditierten hESC-Linien mit einer biallelischen RB1-Punktmutation (RB1 Mut/Mut) bzw. einer RB1-Knockout-Mutation (RB1-/-). Während des Prozesses der Netzhautentwicklung wird die Bildung von RB beobachtet. Die RB-Zelllinien werden auch durch Trennung von den RB-Organoiden etabliert. Insgesamt haben wir durch die Differenzierung der geneditierten hESC-Linien in die retinalen Organoide unter Verwendung eines kombinierten 2D- und 3D-Differenzierungsprotokolls die menschliche RB in einer Schale erfolgreich rekonstruiert und ihren Ursprung als Zapfenvorläufer identifiziert. Es würde ein hilfreiches Krankheitsmodell für die Beobachtung der Genese, Proliferation und des Wachstums des Retinoblastoms sowie für die Weiterentwicklung neuartiger therapeutischer Wirkstoffe liefern.

Introduction

Das humane Retinoblastom (RB) ist ein seltener, tödlicher Tumor, der von den Netzhautzapfenvorläufern 1,2,3 abgeleitet ist und die häufigste Form der intraokularen Malignität im Kindesalterist 4. Die homozygote Inaktivierung des RB1-Gens ist die auslösende genetische Läsion in RB5. Mäuse mit RB1-Mutationen bilden jedoch nicht den Netzhauttumor2. Obwohl die Maustumoren durch die Kombination von Rb1-Mutationen und anderen genetischen Veränderungen erzeugt werden könnten, fehlen ihnen noch die Merkmale des menschlichen RB6. Dank der Entwicklung der retinalen Organoiddifferenzierung konnte das hESC-abgeleitete RB erhalten werden, das die Charaktere des menschlichen RB1 zeigt.

In den letzten zehn Jahren wurden zahlreiche Protokolle für die retinale Organoiddifferenzierung etabliert, darunter 2D7, 3D8 und eine Kombination aus 2D und 3D9. Die Methode, die hier verwendet wird, um die menschliche RB zu erzeugen, ist die Konsolidierung der adhärenten Kultur und der schwimmenden Kultur9. Durch die Differenzierung des RB1-mutierten hESC in retinale Organoide wird die Bildung von RB um den Tag 45 nachgewiesen, und dann vermehrt es sich schnell um Tag 60. Am Tag 90 ist die Isolierung von RBs und die Erzeugung der RB-Zelllinie möglich; Darüber hinaus umgibt RB fast alle retinalen Organoide am Tag 120.

Das von hESC abgeleitete RB ist ein innovatives Modell zur Erforschung des Ursprungs, der Tumorgenese und der Behandlung von RB. In diesem Protokoll werden die Erzeugung von Gen-Editing-hESC, die Differenzierung von RB und die Charakterisierung für RB detailliert beschrieben.

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Protocol

Diese Studie wurde von der institutionellen Ethikkommission des Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, genehmigt. H9 hESCs werden vom WiCell Research Institute bezogen.

1. Erzeugung von RB1 mutiertem hESC

  1. CRISPR/Cas9-Zielvektor für den Knockout (KO) von RB1.
    1. Entwerfen Sie ein Paar sgRNA. Für die Ablation von RB1 zielen Sie auf das erste Exon dieses Gens ab. Die Vorwärtsprimersequenz ist CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGGGG und die umgekehrte Primersequenz ist AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
      HINWEIS: Für die spezifische RB1-Mutation ist auch eine reparierte Vorlage erforderlich. In diesem Protokoll wird die RB1-KO-Zelllinie als Beispiel verwendet.
    2. 1 μg pX330-U6-Chimäre BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro mit BbsI-Restriktionsenzymen (siehe Materialtabelle) 30 min bei 37 °C unter Beachtung der Anweisungen des Herstellers aufschließen.
    3. Reinigen Sie die aufgeschlossenen Plasmide mit einem Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Enzymatische Reaktionen können ohne Agarosegel mit dem Reinigungskit direkt gereinigt werden (siehe Materialtabelle).
    4. Phosphorylieren und glühen jedes Oligopaar unter Verwendung der T4-Polynukleotidkinase (PNK) (Table of Materials) mit der Reaktion bestehend aus 1 μL Oligo1 (100 μM), 1 μL Oligo2 (100 μM), 1 μL 10x T4-Ligationspuffer, 6,5 μL ddH2O und 0,5 μL T4 PNK.
      HINWEIS: Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer in Schritt 1.1.1 sind ein Oligopaar. Phosphorylieren und glühen Sie die Oligos in einem Thermocycler mit folgenden Parametern: 37 °C für 30 min; 95 °C für 5 min; auf 25 °C bei 5 °C pro Minute herunterfahren.
    5. Die phosphorylierten und geglühten Oligos werden 200-mal verdünnt, indem Sie 1 μL Oligoreagenz zu 199 μL nukleasefreiem Wasser bei Raumtemperatur (RT) geben.
    6. Die Ligationsreaktion aufstellen und bei RT für 10 min inkubieren, indem Sie Folgendes mischen: 50 ng Bbs1-verdautes Plasmid aus Schritt 1.1.3, 1 μL Oligoduplex aus Schritt 1.1.5, 5 μL 2x Ligationspuffer, 1 μL Ligase und bis zu 10 μL mit nukleasefreiem Wasser auffüllen.
    7. Transformieren Sie die Ligationsmischung und sequenzieren Sie die positiven Kolonien für den nächsten Schritt.
      HINWEIS: Verwenden Sie U6 Vorwärts- oder Rückwärtsprimer für die Sequenzierung.
      1. Die zuständigen Zellen auf Eis auftauen.
      2. Nehmen Sie 50 μL der kompetenten Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
      3. 1 μL der Ligationsmischung aus Schritt 1.1.6 in die zuständigen Zellen geben.
      4. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen dreimal auf und ab pipettieren.
        HINWEIS: Nicht wirbeln.
      5. Die Mischung für 30 min auf Eis legen.
      6. Das Gemisch 90 s lang bei 42 °C hitzeschocken.
      7. 950 μL Luria-Bertani (LB) Brühe bei Raumtemperatur ohne Antibiotikum in die Tube geben.
      8. Legen Sie das Röhrchen 60 min lang bei 300 U/min bei 37 °C in einen Shaker.
      9. Erwärmen Sie die LB-Platten (Pepton, Pepton aus Kasein, Natriumchlorid, Agar-Agar und Ampicillin) vorab auf 37 °C.
      10. 50-100 μL der Zellen und der Ligationsmischung auf die Platten bei RT verteilen.
      11. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      12. Nehmen Sie 12 Kolonien von der Platte auf und übertragen Sie sie mit Ampicillin auf das LB-Medium. Legen Sie das Medium 60 min lang bei 300 U/min auf einen Shaker.
      13. Verwenden Sie 1 μL der Bakterienlösung (aus Schritt 1.1.7.12) als Vorlage für die PCR und wählen Sie die positiven Kolonien aus.
      14. Sequenzieren Sie die positiven Kolonien mit den U6-Primern, verwenden Sie die Kolonie mit den entworfenen sgRNA-Sequenzen im nächsten Schritt.
    8. Extrahieren Sie das Plasmid mit einem Midi-Kit (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Die Qualität und die Quantität des Plasmids mit einem Mini-Kit reichen für das folgende Nukleofektionsexperiment nicht aus. Midi- oder Maxi-Kit ist besser geeignet als das Mini-Kit.
  2. HESC-Kultur und Nukleofektion.
    HINWEIS: Erwärmen Sie alle Reagenzien auf RT.
    1. 1 x 10 6 H9-Zellen in eine vorbeschichtete 6-Well-Platte mit 10 μM Y-27632 (ROCK-Inhibitor) und 2 mL frischem ncEpic-hiPSC/hESC-Kulturmedium auftauen.
      HINWEIS: Beschichten Sie die 6-Well-Platte vor Gebrauch mindestens 30 Minuten lang mit einer um 1% Wachstumsfaktor reduzierten Basalmembranmatrix bei 37 °C.
    2. Am nächsten Tag entfernen Sie den Überstand, spülen Sie die Zellen mit 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) und fügen Sie dann 2 ml frisches ncEpic-hiPSC / hESC-Kulturmedium hinzu.
    3. Wechseln Sie das Medium täglich mit 2 ml frischem ncEpic-hiPSC/hESC-Kulturmedium in den folgenden 3-5 Tagen, bis die Zellen auf etwa 80% Konfluenz anwachsen.
    4. Durchgang ein- oder zweimal, um den Zustand des hESC anzupassen.
      HINWEIS: Der einfachste Weg, den Zustand des hESC zu identifizieren, ist die Morphologie.
    5. Kulturieren Sie die undifferenzierten H9-Zellen in einer 6-Well-Platte, bis sie 80% Konfluenz erreichen.
    6. Wechseln Sie das Medium 2 h vor der Nukleofektion mit 2 ml frischem ncEpic-hiPSC/hESC-Kulturmedium, gemischt mit 10 μM Y-27632, und beschichten Sie eine Vertiefung einer 12-Well-Platte unter Verwendung einer 1% Wachstumsfaktor-reduzierten Basalmembranmatrix.
    7. Das Medium absaugen und mit 1 ml vorgewärmtem DPBS abspülen.
    8. Entfernen Sie das DPBS und inkubieren Sie mit 1 ml Zelldissoziationsenzym (siehe Materialtabelle) für 3,5 min bei 37 °C.
    9. Geben Sie 1 ml frisches ncEpic-hiPSC/hESC-Kulturmedium zu den Zellen und pipetten Sie zweimal, um die H9-Zellen zu einer Einzelzellsuspension zu machen.
    10. Nehmen Sie 100 μL der Mischung zur Zellzählung heraus und geben Sie den Rest in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das weitere 2 ml ncEpic-hiPSC/hESC-Kulturmedium enthält.
    11. Zentrifugieren bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie etwa 2 x 106 Zellen in ein Reaktionsvolumen von 100 μL. Optimieren Sie gemäß dem Protokoll des Herstellers das Volumen für die Zellen, Plasmide, Nukleofector und Reaktionsbedingungen. Siehe Tabelle der Materialien für das in diesem Protokoll verwendete Nukleofektionssystem.
      HINWEIS: Im Allgemeinen sind Blasen während der Nukleofektion nicht erlaubt.
    12. Nach der Transfektion werden die Zellen in die vorbeschichtete 12-Well-Platte überführt, mit 1,5 ml ncEpic-hiPSC/hESC-Kulturmedium und 10 μM Y-27632 ergänzt und dann die Zellen in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator kultiviert.
    13. Wechseln Sie das Medium täglich. Nach 48 h fügen Sie 2 μg / ml Puromycin zur Zellselektion etwa eine Woche hinzu.
      HINWEIS: Zahlreiche Zellen sterben während der ersten 3 Tage. Die verbleibenden Zellen können sich in der folgenden Woche nach der Puromykselection vermehren und zu Kolonien bilden. Achten Sie in der Selektionswoche darauf, dass das Medium immer 2 μg/ml Puromycin enthält.
    14. Wählen Sie die Kolonien manuell unter einem Mikroskop aus.
      HINWEIS: Die Morphologie der Kolonie ist die gleiche wie bei der hES-Kolonie. Schneiden Sie die Kolonien mit einer 10 μL weißen/normalen Pipettenspitze im Medium in Stücke (2-6 Stück pro Kolonie) und übertragen Sie eine Kolonie in eine vorbeschichtete Vertiefung einer 12-Well-Platte.
    15. Identifizieren Sie zuerst die RB1-Mutationen und die Off-Target-Situationen (Tabelle 1) und dann die Pluripotenz, um die RB1-Knockout-H9-Zelllinie zu charakterisieren.
      HINWEIS: Erkennen Sie die RB1-Mutationen und die Off-Target-Situationen mithilfe von PCR und Sanger-Sequenzierung. Identifizieren Sie die Pluripotenzmarker durch RT-PCR und Immunfluoreszenz.

2. Entstehung eines humanen Retinoblastoms

  1. Wartung von RB1-KO hESC.
    1. Kultur der geneditierten H9-Zellen in einer mit Wachstumsfaktor reduzierten Basalmembranmatrix, die mit 2 mL ncEpic-hiPSC/hESC-Kulturmedium beschichtet ist, und wechseln Sie das Medium täglich.
    2. Durchgang mit EDTA-Puffer für 3,5 min bei 37 °C oder 5 min bei RT.
      HINWEIS: EDTA-Puffer ist die Mischung aus 1x DPBS, 5 mM EDTA und 0,9 mg / ml NaCl.
  2. Differenzierung retinaler Zellen.
    HINWEIS: Bereiten Sie Medium I vor der Unterscheidung vor. Zur Herstellung von Medium I mischen Sie 24,5 ml Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM)/Nährstoffgemisch F-12(F12)-Glutamin (1x), 24,5 ml neuronales Basalmedium, 250 μL 100x Ergänzung A, 500 μL 50x Ergänzung B, 0,1 mM ß-Mercaptoethanol und 250 μL 100x L-Glutamin. Alle Mischungen vor Gebrauch auf RT vorwärmen.
    1. Vergrößern Sie den RB1-KO hESC auf 80% Konfluenz in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte.
    2. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit 1 ml 1x DPBS ab.
    3. Heben Sie die Zellkolonien mit 1 ml Dispase-Puffer (siehe Materialtabelle) für 5 min bei 37 °C an.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Zellkolonien unter einem Mikroskop. Normalerweise dauert es 5 Minuten, bis der Rand der Kolonien ausgerollt ist.
    4. Saugen Sie den Dispase-Puffer ab und spülen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit 1 ml 1x DPBS ab.
    5. Geben Sie 1 ml Medium I in den Brunnen.
    6. Schneiden Sie die Kolonien in Stücke (6-9 Stück pro Kolonie) mit einer 10 μL weißen/normalen Pipettenspitze im Medium.
      HINWEIS: Im Allgemeinen lösen sich etwa 60% -70% der Zellen vom Brunnen. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die verbleibenden Zellen im Medium abzukratzen.
    7. Ernten Sie alle Zellen durch Zentrifugieren in einem 15-ml-Röhrchen bei 200 x g für 5 min.
    8. Lassen Sie etwa 50 μL des Überstandes, um die Zellen im Medium zu dispergieren, und mischen Sie dann die Zellen mit 250 μL Wachstumsfaktor-reduzierter Basalmembranmatrix durch sanftes Rühren.
      HINWEIS: Halten Sie die mit dem Wachstumsfaktor reduzierte Basalmembranmatrix vor Gebrauch entweder bei 4 °C oder auf dem Eis. Wenn es aliquotiert und bei -20 °C gelagert wird, stellen Sie es über Nacht oder mindestens 1 Stunde vor Gebrauch bei 4 °C ein.
    9. Bewahren Sie das 15-ml-Röhrchen mit den suspendierten Zellen 20 min in einem 37 °C-Inkubator auf.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen und die mit dem Wachstumsfaktor reduzierte Basalmembranmatrix ein verfestigtes Gel bilden.
    10. Fügen Sie 1 ml Medium I in das 15-ml-Röhrchen hinzu und pipepisten Sie dann das verfestigte Gel zwei- bis dreimal leicht, um den Klumpen mit einer 1-ml-Pipette zu dispergieren.
    11. Fügen Sie 9 ml Medium I hinzu und geben Sie die Zellsuspension in eine 10 cm große Zellkulturschale.
    12. Die Schale in einen 37 °C Inkubator mit 5%CO2 stellen und den Tag als Tag 0 einstellen.
    13. Untersuchen Sie die Zellen am 1. Tag mit einem Mikroskop.
      HINWEIS: Tausende von Hohlzysten konnten in der Schale beobachtet werden. Im Durchschnitt werden 3 bis 4 Zysten in einem Stück Gel beobachtet.
    14. Ändern Sie das Medium an Tag 5. Sammeln Sie den Überstand in einem 15-ml-Röhrchen, warten Sie, bis sich die Zysten auf dem Boden abgesetzt haben, und entfernen Sie dann das Medium und ersetzen Sie es durch frisches Medium I.
      HINWEIS: Wenn das Medium an Tag 4 gelb wird, wechseln Sie das Medium an Tag 4, andernfalls an Tag 5. 10 ml frisches Medium I in die Originalschale geben. Hunderte von Zysten haben sich bereits an der Kulturoberfläche befestigt; Behalten Sie sie dort.
    15. Dispergieren Sie die Zysten in der Röhre in zwei 10 cm Schalen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich mindestens 300 Zysten in einer Schale befinden. Wenn die Zysten nicht konfluent sind, trennen Sie die Zysten nicht in andere Gerichte; Bringen Sie sie in die ursprüngliche 10-cm-Schale zurück.
    16. Am Tag 7 heften sich die meisten Zysten (über 95%) an die Schale, breiten sich aus und bilden adhärente Kolonien.
      HINWEIS: Bereits am Tag 3 können die anhaftenden Kolonien beobachtet werden.
    17. Wechseln Sie am Tag 10 das Medium durch frisches Medium I. Stellen Sie sicher, dass alle Zysten an der Schale befestigt sind.
    18. Bereiten Sie Medium II vor dem nächsten Schritt vor, indem Sie Folgendes mischen: 36 ml DMEM, 12 ml F12, 2% Ergänzung B (v / v), 0,1 mM MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA).
    19. Stellen Sie sicher, dass die Zellen am Tag 13-17 verteilt sind. Führen Sie den nächsten Schritt am Tag 15 durch, wenn die Zellen ausgebreitet sind, aber nicht mit den benachbarten Kolonien interagieren.
    20. Spülen Sie die Zellen einmal mit 1 ml DPBS und fügen Sie 1 ml Dispaselösung für 5 min bei 37 °C hinzu.
      HINWEIS: Innerhalb von 5 Minuten hebt sich der Rand der Zellen an.
    21. Entfernen Sie den Dispase-Puffer und spülen Sie die Kulturen vorsichtig mit 1 ml 1x DPBS ab.
    22. 10 ml Medium II in jede 10 cm lange Schale und Kultur in einem 37 °C heißen 5%CO2-Inkubator geben.
    23. Die adhärenten Kulturen lösen sich nach 24 h spontan ab und lagern sich zu retinalen Organoiden zusammen.
      HINWEIS: Zahlreiche Zellen, die die Organoide nicht bilden, würden in den folgenden 2 Tagen sterben.
    24. Sammeln Sie drei Tage nach der Ablösung die Zellen aus der Zellkulturschale und lassen Sie die Organoide in einem 15-ml-Röhrchen absetzen.
    25. Entfernen Sie den Überstand aus dem Röhrchen und geben Sie die Organoide für die folgenden vier Tage in eine neue nicht haftende Schale (Petrischale) mit 10 ml Medium II.
    26. Medium III durch Mischen von DMEM: F12 im Verhältnis 3:1 (v/v), 2% Ergänzung B (v/v), 0,1 mM MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA), 8% Fetal Bovine Serum (FBS) (v/v), 100 μM Taurin und 2 mM Glutamin.
    27. Ändern Sie eine Woche nach der Ablösung das Medium auf Medium III.
    28. Von diesem Tag an kultivieren Sie die Organoide in Medium III und frischen Sie das Medium zweimal wöchentlich auf.
  3. Etablierung der RB-Zelllinie.
    HINWEIS: Alle Reagenzien werden bei RT vorgewärmt.
    1. Am Tag 90 umfassen die RBs (80%-90%) die retinalen Organoide. Wählen Sie daher die 90-Tage-RB-Organoide für die Erzeugung der RB-Zelllinie.
    2. Bereiten Sie das 1640-Medium vor, indem Sie das Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640-Medium mit 10% FBS mischen.
    3. Schneiden Sie die RB in Stücke (20-25 Stück pro RB) mit einem mikrochirurgischen Messer unter einem Mikroskop in RPMI-1640-Medium.
    4. Entfernen Sie das RPMI-1640-Medium und behandeln Sie die Stücke mit 0,25% Trypsin/EDTA für 10 min bei 37 °C.
    5. Fügen Sie das RPMI-1640-Medium hinzu, um die Reaktion zu beenden, und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min.
    6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1640 Medium in einer nicht haftenden Schale.
    7. Die RB-Zelllinie ist eine schwimmende Kultur. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche und passieren Sie die RB-Zellen innerhalb von 2 Wochen.
      HINWEIS: Die Proliferationsrate von primären RB-Zellen ist ziemlich langsam.

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Representative Results

Der Ablauf der RB-Generierung wird in Abbildung 1 erläutert, die die adhärente und die schwimmende Kultur kombiniert. Es war möglich, das menschliche RB aus RB1-KO hESC zu gewinnen und die RB-Zelllinie durch Isolierung der RB-Organoide zu erhalten.

Hier liefert das Protokoll die Details der Differenzierung in verschiedenen Stufen (Abbildung 2). In den ersten 3 Tagen bilden sich Hohlkugeln, die sich an der Kulturoberfläche festsetzen und sich dann ausdehnen (Abbildung 2A-E). Ab Tag 15 sind die Zellen erhöht und die Kultur in Suspension (Abbildung 2F). Am Tag nach der Ablösung bilden sich retinale Organoide und die hellen Ränder sind sichtbar (Abbildung 2G, schwarze Pfeile). Darüber hinaus werden diese Zellen außerhalb der Organoide wahrscheinlich in der folgenden Woche absterben (Abbildung 2G, orangefarbene Pfeile). An Tag 27 ist die Architektur der optischen Vesikel offensichtlich und etwa 90% der Organoide zeigen diese Struktur (Abbildung 2H); Die Organoide ohne diese Struktur könnten verworfen werden. Der erste Nachweis des RB erfolgt am Tag 45 und wird dann am Tag 50 tastbar (Abbildung 2I). Wenn es bis zum 90. Tag wächst, werden die optischen Vesikelstrukturen hauptsächlich vom RB umhüllt (Abbildung 2J). In der Zwischenzeit konnte das RB als RB-Zelllinie für die weitere Kultur isoliert werden (Abbildung 2K). Über 80% retinale Organoide wären am Tag 105 vollständig von der RB umhüllt (Abbildung 2L). Sie zeigen eine hohe Expression von Ki67 (Proliferationsmarker) und SYK (Onkogenmarker) im Vergleich zu den H9-abgeleiteten retinalen Organoiden, was auf die Tumorgenese in den RB-Organoiden hinweist (Abbildung 2M, N). Darüber hinaus zeigt die hohe Expression von ARR3 (Cone Precursor Maker) und CRX (Photoreceptor Precursor Marker) in den RB-Organoiden, dass sie von Zapfenvorläuferzellen stammen (Abbildung 2O,P).

Das Verfahren der RB-Erzeugung durchläuft hauptsächlich drei Stufen mit morphologischen Veränderungen vor der RB-Bildung; Hier liefert die Studie die schlechteren und überlegenen Ergebnisse in diesen Stadien (Abbildung 3). Differenziertes und undifferenziertes hESC (Abbildung 3A,B) ist leicht von der Morphologie zu unterscheiden, und das undifferenzierte hESC wird für die RB-Bildung gewählt. An Tag 5 sollte eine hohle Kugel erzeugt werden (Abbildung 3D) und nicht die feste (Abbildung 3C). Die RB wird von den retinalen Organoiden abgeleitet, die eine optische Vesikelarchitektur aufweisen (Abbildung 3F). Es gibt kein RB, das in den unteren Organoiden entstehen würde (Abbildung 3E).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der RB-Organoiddifferenzierung. Tag 0-Tag 15, die Zellen sind 2D-Kultur in Medium I, und nach Tag 15 sind die Zellen Suspensionskultur. RB wird um den 45. Tag gebildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: RB-Generierung und -Charakterisierung. (A-C) Das Verfahren des frühen Stadiums, hESC ist erhöht, um die Zysten zu bilden. Die schwarzen Pfeile in (B) zeigen die gewalzten Kanten von hESC nach der Dispase-Behandlung. (D,E) Die Zysten heften sich an die Platten (D) und dehnen sich dann aus (E). (F) Adhärente Zellen werden erhöht, um die retinalen Organoide zu bilden. Schwarze Pfeile zeigen die gewalzten Kanten nach der Dispase-Behandlung an. (G,H) Frühe retinale Organoide ohne RB. (I, J) Die retinalen Organoide mit RB an Tag 50 (I) und Tag 90 (J), die grünen Kreise zeigen die RB-Teile. (K) Die isolierte RB-Zelllinie aus 90-Tage-retinalen Organoiden. (L) Die RB-Organoide an Tag 105. (M-P) Die Immunfluoreszenzbilder für die Onkogenmarker (M,N) und Photorezeptormarker (O,P). In A-L Maßstabsbalken = 200 μm; in M-P, Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Vergleich der negativen und positiven Ergebnisse. Die minderwertigen und überlegenen Bilder zur Differenzierung an Tag 0 (A,B), Tag 5 (C,D) und Tag 30 (E,F). Maßstäbe = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Das humane Retinoblastom (RB) wird durch die Inaktivierung von RB1 und die Dysfunktion des Rb-Proteins verursacht. In diesem Protokoll ist der RB1-KO hESC der entscheidende Schritt für die Erzeugung von RB in einer Schale. Während es auch bei RB1-/- hESC möglich ist, dass es aufgrund der Methoden der retinalen Organoiddifferenzierung10 zu keiner RB-Bildung kommt. In diesem Protokoll ist der Übergang von der adhärenten Kultur zur schwimmenden Kultur im Prozess der Differenzierung wesentlich. Die Dichte der Zysten, die Arten von pluripotenten Stammzellen und die Proliferationsrate sind alle Variablen, die den Zeitpunkt der Ablösung beeinflussen würden. Es ist wünschenswert, die Zellen zu lösen, wenn sie expandiert, aber nicht von benachbarten Kolonien interagiertwerden 9. Wenn die Kolonien angrenzen, würde dies zu den angrenzenden retinalen Organoiden führen und dann die Differenzierungseffizienz verringern.

Wenn Sie die Schritte kritisch befolgen, wäre es unbeschwert, die RB zu ernten. Diese Methode konnte RB jedoch nur mit der biallelischen Inaktivierung von RB1 modellieren. Bei den vererbten RB-Patienten, die eine heterozygote RB1-Mutation aufwiesen, ist es nicht möglich, den Prozess der Tumorgenese mit der heterozygoten RB1-Mutation 11 nachzuahmen. Dennoch ist es immer noch ein optimales RB-Modell, da es derzeit der tatsächlichen RB-Tumorgenese bei Patienten1 am nächsten kommt. Es teilt den gleichen Ursprung mit primären RB 3,12 und überwindet den Artenunterschied von Mäusemodellen oder vereinfachter zweidimensionaler Umgebung von immortalisierten Krebszelllinien 3,12,13.

Die menschliche RB wird in einer Schale hergestellt, die unter Verwendung der beschriebenen Methode aus humaner ESC gewonnen wird, und sie weist große Ähnlichkeit mit der menschlichen primären RB auf. Daher würde es eine ideale Plattform für die Aufklärung der molekularen Pathologie der menschlichen RB und das Screening pharmakologischer Wirkstoffe bieten.

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Disclosures

Den Autoren sind keine Zugehörigkeiten, Mitgliedschaften, Finanzierungen oder finanziellen Beteiligungen bekannt, die die Objektivität dieser Studie beeinträchtigen könnten.

Acknowledgments

Wir danken dem 502-Team für die Hilfe. Diese Arbeit wird teilweise von der Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) und dem National Key R&D Program of China (2017YFA0105300) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Anti-ARR3 Sigma HPA063129 Antibody
Anti-CRX (M02) Abnove ABN-H00001406-M02 Antibody
Anti-Ki67 Abcam  ab15580 Antibody
Anti-Syk (D3Z1E) Cell Signaling Technology 13198 Antibody
BbsI NEB R3539S Restriction enzymes
Dispase (1U/mL) Stemcell Technologies 7923
DMEM basic Gibco 10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX Gibco 10565-042
DMSO Sigma D2650
DPBS Gibco C141905005BT
EDTA Thermo 15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells Biological Industry 04-002-1A
Glutamine Gibco 35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) Gibco 11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) Sigma M7145
Neurobasal Medium Gibco 21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S Lonza V4XP-3032 Nucleofection kit
Pen Strep Gibco 15140-122
Puromycin Gene Operation ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium Nuwacell RP01001 ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix BD 356231 Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme Gibco 12563-011 TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit QIAGEN 75144
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74104
Supplement A Life Technologies 17502-048 N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B Life Technologies 17105-041 B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase Life Technologies EK0032
Taurine Sigma T-8691-25G
Y-27632 2HCl Selleck S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro Addgene 42230
Nucleofector 4D Lonza
RPMI Sigma R0883-500ML

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References

  1. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  2. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
  3. Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
  4. Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. The biology of retinoblastoma. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).
  5. Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
  6. Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
  7. Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
  8. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  9. Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
  10. Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
  11. Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
  12. Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
  13. Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).

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Krebsforschung Ausgabe 188
Rekonstruktion des humanen Retinoblastoms in vitro
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Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct… More

Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct Human Retinoblastoma In Vitro. J. Vis. Exp. (188), e62629, doi:10.3791/62629 (2022).

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