Summary
אנו מתארים שיטה ליצירת רטינובלסטומה אנושית (RB) על ידי החדרת מוטציות RB1 ביאליליות בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC). קווי תאי RB יכולים גם להיות בתרבית בהצלחה באמצעות RB מבודד בצלחת.
Abstract
RB אנושי הוא סרטן ילדים, שהוא קטלני אם לא ניתן טיפול. מכיוון שמקורו של RB במבשרי חרוטים, דבר נדיר יחסית במודלים של מכרסמים, בינתיים לגבי ההבדלים הבין-מיניים בין בני אדם למכרסמים, מודל מחלה שמקורו בבני אדם מועיל יותר לחשיפת המנגנונים של RB אנושי ולחיפוש אחר מטרות הטיפול. כאן, הפרוטוקול מתאר יצירת שני קווי hESC שעברו עריכה גנטית עם מוטציה דו-אלילית של נקודת RB1 (RB1 Mut/Mut) ומוטציית נוקאאוט RB1 (RB1-/-), בהתאמה. במהלך תהליך התפתחות הרשתית, היווצרות של RB הוא ציין. קווי תאי RB נקבעים גם על ידי הפרדה מהאורגנואידים של RB. בסך הכל, על ידי הבחנה בין קווי hESC שעברו עריכה גנטית לאורגנואידים ברשתית באמצעות פרוטוקול התמיינות משולב דו-ממדי ותלת-ממדי, הצלחנו לשחזר את ה-RB האנושי בצלחת ולזהות את מקורו החרוט המבשר. הוא יספק מודל מחלה מועיל להתבוננות בראשית הרטינובלסטומה, התפשטותה וצמיחתה, כמו גם פיתוח נוסף של חומרים טיפוליים חדשניים.
Introduction
רטינובלסטומה אנושית (RB) היא גידול נדיר וקטלני שמקורו במבשרי חרוט הרשתית 1,2,3, הוא הסוג הנפוץ ביותר של ממאירות תוך עינית בילדות 4. השתקה הומוזיגוטית של הגן RB1 היא הנגע הגנטי היוזם ב- RB5. עם זאת, עכברים עם מוטציות RB1 לא מצליחים ליצור את הגידול ברשתית2. למרות שגידולי העכברים יכולים להיווצר עם שילוב של מוטציות Rb1 ושינויים גנטיים אחרים, הם עדיין חסרים את התכונות של RB6 אנושי. הודות לפיתוח של התמיינות אורגנואידית ברשתית, ניתן היה להשיג את ה- RB שמקורו ב- hESC, המציג את הדמויות של RB1 אנושי.
פרוטוקולים רבים להבחנה אורגנואידית ברשתית נקבעו בעשור האחרון, כולל 2D7, 3D8, ושילוב של 2D ו- 3D9. השיטה המשמשת כאן ליצירת RB האנושי היא איחוד של תרבות דבק ותרבות צפה9. על ידי הבחנה בין ה-hESC שעבר מוטציה ב-RB1 לאורגנואידים ברשתית, היווצרות ה-RB מתגלה בסביבות היום ה-45, ואז היא מתפשטת במהירות בסביבות היום ה-60. ביום 90, בידוד של RBs, ויצירת קו התאים RB אפשרי; יתר על כן, RB מקיף כמעט את כל האורגנואידים ברשתית ביום 120.
RB שמקורו ב-hESC הוא מודל חדשני לחקר המקור, הגידול והטיפולים ב-RB. בפרוטוקול זה, הדור של עריכת גנים hESC, ההבחנה של RB, ואפיון עבור RB מתוארים בפירוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים בייג'ינג טונגרן, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. H9 hESCs מתקבלים ממכון המחקר WiCell.
1. דור של RB1 מוטציה hESC
- וקטור מיקוד CRISPR/Cas9 עבור הנוקאאוט (KO) של RB1.
- תכננו זוג sgRNA. עבור אבלציה של RB1, לכוון את האקסון הראשון של הגן הזה. רצף הפריימר הקדמי הוא CACCGCGGTGGGGCGGGTTTTTCGG, ורצף הפריימר ההפוך הוא AAACCCGAAAAACGGCGCCGC.
הערה: עבור מוטציית RB1 הספציפית, נדרשת גם תבנית מתוקנת. בפרוטוקול זה, קו התא RB1-KO משמש כדוגמה. - יש לעכל 1 מיקרוגרם של pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro עם אנזימי הגבלת BbsI (ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C על ידי ביצוע הוראות היצרן.
- לטהר את הפלסמידים המעוכלים באמצעות ערכת טיהור על פי הוראות היצרן.
הערה: ניתן לנקות תגובות אנזימטיות ישירות ללא ג'ל אגרוז באמצעות ערכת הטיהור (ראו טבלת חומרים). - זרחן ואנליל כל זוג אוליגוס משתמש בפולינוקלאוטיד קינאז T4 (PNK) (טבלת חומרים) עם התגובה הכוללת 1 μL של אוליגו1 (100 μM), 1 μL של אוליגו2 (100 μM), 1 μL של 10x T4 Ligation Buffer, 6.5 μL של ddH2O, ו 0.5 μL של T4 PNK.
הערה: הפריימרים קדימה ואחורה בשלב 1.1.1 הם זוג אוליגוס. זרחן ו anneal אוליגוס ב thermocycler באמצעות הפרמטרים הבאים: 37 °C במשך 30 דקות; 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; עלו ל-25 מעלות צלזיוס ב-5 מעלות צלזיוס לדקה. - דלל את האוליגוס הזרחני והחישול 200 פעמים על ידי הוספת 1 μL של ריאגנט אוליגו ל-199 μL של מים נטולי נוקלאז בטמפרטורת החדר (RT).
- הגדר את תגובת הקשירה ודגרה ב- RT למשך 10 דקות על ידי ערבוב הדברים הבאים: 50 ננוגרם של פלסמיד מעוכל Bbs1 משלב 1.1.3, 1 μL של דופלקס אוליגו משלב 1.1.5, 5 μL של 2x חיץ ליגציה, 1 μL של ליגאז, ולמעלה עד 10 μL באמצעות מים ללא נוקלאז.
- הפכו את תערובת הקשירה וריצפו את המושבות החיוביות לשלב הבא.
הערה: השתמש בפריימר U6 קדימה או אחורה לריצוף.- להפשיר את התאים המוכשרים על קרח.
- קח 50 μL של התאים המוסמכים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
- הוסף 1 μL של תערובת קשירת משלב 1.1.6 לתוך התאים המתאימים.
- מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה של הצינור שלוש פעמים.
הערה: אין לערבל. - מניחים את התערובת על קרח למשך 30 דקות.
- הלם חום התערובת ב 42 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות.
- יש להוסיף לצינור 950 מיקרוגרם של מרק לוריא-ברטני (LB) בטמפרטורת החדר ללא אנטיביוטיקה.
- מניחים את הצינור בשייקר ב-300 סל"ד ב-37°C למשך 60 דקות.
- חממו את צלחות ה-LB (פפטון, פפטון מקזאין, נתרן כלורי, אגר-אגר ואמפיצילין) ל-37 מעלות צלזיוס מראש.
- מורחים 50-100 μL של התאים ותערובת קשירה על הצלחות ב- RT.
- דגירה של הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
- לאסוף 12 מושבות מהצלחת ולהעביר אותם למדיום LB עם אמפיצילין. הניחו את המדיום על שייקר ב-300 סל"ד למשך 60 דקות.
- השתמש ב- 1 μL מתמיסת החיידקים (משלב 1.1.7.12) כתבנית עבור PCR ובחר את המושבות החיוביות.
- רצף את המושבות החיוביות על ידי פריימרים U6, להשתמש במושבה עם רצפי sgRNA מתוכנן בשלב הבא.
- חלצו את הפלסמיד באמצעות ערכת מידי (ראו טבלת חומרים).
הערה: האיכות והכמות של הפלסמיד באמצעות ערכת מיני אינן מספיקות לניסוי הנוקלאופקציה הבא. ערכת מידי או מקסי מתאימה יותר מהמיני קיט.
- תכננו זוג sgRNA. עבור אבלציה של RB1, לכוון את האקסון הראשון של הגן הזה. רצף הפריימר הקדמי הוא CACCGCGGTGGGGCGGGTTTTTCGG, ורצף הפריימר ההפוך הוא AAACCCGAAAAACGGCGCCGC.
- תרבית HESC ונוקלאופקציה.
הערה: חממו את כל הריאגנטים ל-RT.- להפשיר 1 x 10 6תאי H9 לתוך צלחת מצופה מראש 6 בארות עם 10 μM Y-27632 (מעכב ROCK) ו 2 מ"ל של מדיום תרבית ncEpic-hiPSC / hESC טרי.
הערה: מצפים את צלחת 6 הבארות במטריצת קרום מרתף מופחתת במקדם גדילה של 1% למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. - למחרת, הסר את הסופרנטנט, שטף את התאים עם 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Salline (DPBS), ולאחר מכן הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית ncEpic-hiPSC/hESC טרי.
- החלף את המדיום מדי יום עם 2 מ"ל של תרבית ncEpic-hiPSC/hESC טרי ב-3-5 הימים הבאים עד שהתאים יגדלו למפגש של כ-80%.
- מעבר פעם או פעמיים כדי להתאים את מצב hESC.
הערה: הדרך הקלה ביותר לזהות את מצב ה-hESC היא המורפולוגיה. - תרבית את תאי H9 הלא מובחנים בצלחת של 6 בארות עד שהם מגיעים למפגש של 80%.
- החלף את המדיום שעתיים לפני הגרעין עם 2 מ"ל של מדיום תרבית ncEpic-hiPSC/hESC טרי מעורבב עם 10 מיקרומטר של Y-27632 וצפה מראש באר אחת של צלחת 12 באר באמצעות מטריצת קרום מרתף מופחתת 1% גורם גדילה.
- שאפו את המדיום ושטפו עם 1 מ"ל של DPBS שחומם מראש.
- הסר את ה-DPBS ודגירה עם 1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה של תאים (ראו טבלת חומרים) למשך 3.5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
- הוסיפו 1 מ"ל של תרבית ncEpic-hiPSC/hESC טרייה לתאים ופיפטה פעמיים כדי להפוך את תאי H9 לתרחיף של תא יחיד.
- הוציאו 100 מיקרוליטר מהתערובת לספירת תאים והעבירו את הנותרים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל עוד 2 מ"ל של מדיום תרבית ncEpic-hiPSC/hESC בפנים.
- צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט ושלח כ-2 x 106 תאים לנפח תגובה של 100 μL. על פי פרוטוקול היצרן, לייעל את נפח עבור תאים, פלסמידים, nucleofector, ותנאי תגובה. ראה טבלת חומרים עבור מערכת הגרעין המשמשת בפרוטוקול זה.
הערה: בדרך כלל, בועות אינן מותרות במהלך הנוקלאופקציה. - לאחר הטרנספקציה, להעביר את התאים לצלחת 12-well מצופה מראש, להשלים עם 1.5 מ"ל של ncEpic-hiPSC / hESC תרבית בינוני ו 10 μM של Y-27632, ולאחר מכן תרבית את התאים באינקובטור 37 °C, 5% CO2 .
- שנה את המדיום מדי יום. לאחר 48 שעות, יש להוסיף 2 מיקרוגרם/מ"ל של פורומיצין לבחירת תאים כשבוע.
הערה: תאים רבים מתים במהלך 3 הימים הראשונים. התאים הנותרים עשויים להתרבות וליצור מושבות בשבוע שלאחר מכן לאחר בחירת הפורומיצין. בשבוע הבחירה, ודא כי המדיום תמיד מכיל 2 מיקרוגרם / מ"ל של puromycin. - בחר את המושבות באופן ידני תחת מיקרוסקופ.
הערה: המורפולוגיה של המושבה זהה למושבת hES. חותכים את המושבות לחתיכות (2-6 חתיכות למושבה) עם קצה פיפטה לבן/רגיל של 10 μL במדיום ומעבירים מושבה אחת לבאר אחת מצופה מראש של צלחת בת 12 בארות. - ראשית, זהה את המוטציות של RB1 ואת המצבים מחוץ למטרה (טבלה 1), ולאחר מכן פלוריפוטנטיות כדי לאפיין את קו התאים H9 של הנוקאאוט RB1 .
הערה: זהה את המוטציות של RB1 ואת המצבים מחוץ למטרה באמצעות ריצוף PCR וסנגר. זהה את סמני הפלוריפוטנטיות על ידי RT-PCR ואימונופלואורסצנציה.
- להפשיר 1 x 10 6תאי H9 לתוך צלחת מצופה מראש 6 בארות עם 10 μM Y-27632 (מעכב ROCK) ו 2 מ"ל של מדיום תרבית ncEpic-hiPSC / hESC טרי.
2. דור של רטינובלסטומה אנושית
- תחזוקה של RB1-KO hESC.
- תרבית את תאי H9 שעברו עריכה גנטית בגורם גדילה מופחתת מטריצת קרום המרתף המצופה בצלחת 6 בארות עם 2 מ"ל של מדיום תרבית ncEpic-hiPSC/hESC ושינוי המדיום מדי יום.
- מעבר באמצעות מאגר EDTA למשך 3.5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס או 5 דקות ב-RT.
הערה: חיץ EDTA הוא תערובת של 1x DPBS, 5 mM EDTA ו-0.9 מ"ג/מ"ל של NaCl.
- התמיינות תאי הרשתית.
הערה: הכן את מדיום I לפני ההבחנה. כדי להכין את מדיום I, יש לערבב 24.5 מ"ל של תערובת הנשר המהונדס (DMEM)/תערובת החומרים המזינים F-12(F12)-גלוטמין (1x), 24.5 מ"ל של המדיום הבסיסי העצבי, 250 μL של תוסף A פי 100, 500 μL של תוסף B פי 50, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, ו-250 μL של 100x L-גלוטמין. יש לחמם את כל התערובות ל-RT לפני השימוש.- הגדל את RB1-KO hESC למפגש של 80% בבאר אחת של צלחת 6 בארות.
- הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 1 מ"ל של 1x DPBS.
- הרם את מושבות התאים באמצעות 1 מ"ל של חיץ דיספאזי (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: בדוק את מושבות התאים תחת מיקרוסקופ. בדרך כלל, זה לוקח 5 דקות עבור קצה המושבות להתגלגל החוצה. - שאפו את חיץ הפסולת ושטפו בעדינות את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של DPBS אחד.
- הוסף 1 מ"ל של בינוני I לתוך הבאר.
- חותכים את המושבות לחתיכות (6-9 חתיכות למושבה) עם קצה פיפטה לבן / רגיל של 10 μL במדיום.
הערה: באופן כללי, כ-60%-70% מהתאים מתנתקים מהבאר. השתמש במגרד תאים כדי לגרד את התאים הנותרים במדיום. - קציר כל התאים על ידי צנטריפוגה בצינור 15 מ"ל ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
- השאירו כ-50 μL של הסופר-נאטנט כדי לפזר את התאים בתווך, ולאחר מכן ערבבו את התאים עם מטריצת קרום מרתף מופחתת של פקטור גדילה על ידי תסיסה עדינה.
הערה: יש לשמור את מטריצת קרום המרתף המופחתת של גורם הגדילה בטמפרטורה של 4°C או על הקרח לפני השימוש. אם הוא מצוטט ומאוחסן ב-20°C-, הנח אותו ב-4 °C למשך הלילה או לפחות שעה אחת לפני השימוש. - שמור את צינור 15 מ"ל עם התאים המרחפים לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
הערה: ודא שהתאים ומטריצת קרום המרתף המופחתת של גורם הגדילה יוצרים ג'ל מוצק. - הוסף 1 מ"ל של Medium I לתוך צינור 15 מ"ל, ולאחר מכן פיפט קלות את הג'ל מוצק פעמיים עד שלוש פעמים כדי לפזר את הגוש עם פיפטה 1 מ"ל.
- הוסיפו 9 מ"ל של Medium I והעבירו את מתלה התאים לצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ.
- מעבירים את המנה לחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ומגדירים את היום כיום 0.
- בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ ביום הראשון.
הערה: ניתן היה לראות אלפי ציסטות חלולות בצלחת. בממוצע, 3 עד 4 ציסטות הם נצפו חתיכה אחת של ג'ל. - שנה את המדיום ביום 5. לאסוף את supernatant לתוך צינור 15 מ"ל, לחכות ציסטות לשקוע לתחתית, ולאחר מכן להסיר את המדיום ולהחליף אותו עם Medium I טרי.
הערה: אם המדיום הופך לצהוב ביום 4, שנה את המדיום ביום 4, אחרת ביום 5. הוסיפו 10 מ"ל של מדיום I טרי למנה המקורית. מאות ציסטות כבר נקשרו למשטח התרבית; לשמור אותם שם. - מפזרים את הציסטות בצינור לשני כלים של 10 ס"מ.
הערה: ודא שלפחות 300 ציסטות נמצאות בצלחת. אם הציסטות אינן מפגשות, אין להפריד את הציסטות למנות אחרות; החזירו אותם למנה המקורית בקוטר 10 ס"מ. - ביום השביעי, רוב הציסטות (מעל 95%) נצמדות לצלחת, מתפזרות ויוצרות מושבות דבקות.
הערה: כבר ביום השלישי ניתן לצפות במושבות החסידות. - ביום 10, החליפו את המדיום במדיום טרי I. וודאו שכל הציסטות מחוברות למנה.
- יש להכין את Medium II לפני השלב הבא על-ידי ערבוב: 36 מ"ל של DMEM, 12 מ"ל של F12, 2% של תוסף B (v/v), 0.1 mM MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA).
- ודא שהתאים מפוזרים לפי יום 13-17. בצע את השלב הבא ביום 15 כאשר התאים מפוזרים אך לא מתקשרים עם המושבות השכנות.
- שטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של DPBS והוסיפו 1 מ"ל של תמיסה פנויה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: תוך 5 דקות, קצה התאים מתרומם. - הסר את מאגר dispase ולשטוף בעדינות את התרביות עם 1 מ"ל של 1x DPBS.
- הוסף 10 מ"ל של בינוני II לכל צלחת ותרבית של 10 ס"מ בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .
- התרביות הדבקות מתנתקות באופן ספונטני לאחר 24 שעות ומתכנסות לאורגנואידים ברשתית.
הערה: תאים רבים שאינם יוצרים את האורגנואידים ימותו ביומיים הבאים. - שלושה ימים לאחר הניתוק, אספו את התאים מצלחת תרבית התאים ואפשרו לאורגנואידים להתיישב בצינור של 15 מ"ל.
- מוציאים את הסופרנטנט מהצינור ומעבירים את האורגנואידים לצלחת חדשה שאינה דבקה (צלחת פטרי) עם 10 מ"ל של Medium II למשך ארבעת הימים הבאים.
- יש להכין את Medium III על-ידי ערבוב DMEM: F12 ביחס של 3:1 (v/v), תוסף B (v/v) של 2%, תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות של 0.1 mM MEM (NEAA), סרום בקר עוברי (FBS) (v/v), 100 מיקרומטר טאורין ו-2 mM גלוטמין.
- שבוע לאחר הניתוק, שנה את המדיום למדיום III.
- מיום זה ואילך, תרבו את האורגנואידים במדיום III ורעננו את המדיום פעמיים בשבוע.
- הקמת קו תא RB.
הערה: כל הריאגנטים מחוממים מראש ב-RT.- ביום ה-90, ה-RBs (80%-90%) מקיפים את האורגנואידים ברשתית. לכן, בחר את האורגנואידים RB 90 יום עבור הדור של קו התאים RB.
- הכן את המדיום 1640 על ידי ערבוב מכון הזיכרון של רוזוול פארק (RPMI)-1640 בינוני עם 10% FBS.
- חותכים את ה-RB לחתיכות (20-25 חתיכות ל-RB) בעזרת סכין מיקרו-כירורגית מתחת למיקרוסקופ במדיום RPMI-1640.
- הסר את המדיום RPMI-1640 וטפל בחלקים עם 0.25% טריפסין / EDTA במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף את מדיום RPMI-1640 כדי לסיים את התגובה והצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
- הסר את הסופרנטנט והושיע מחדש את התאים במדיום 1640 בצלחת שאינה דבקה.
- קו תאי RB הוא תרבית צפה. שנה את המדיום פעמיים בשבוע ועבר את תאי ה- RB תוך שבועיים.
הערה: קצב ההתרבות של תאי RB ראשוניים הוא איטי למדי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוצדורה של יצירת RB מובהרת באיור 1, המשלב את התרבות הדבק והתרבית הצפה. ניתן היה לקצור את ה-RB האנושי מ-RB1-KO hESC, ולקבל את קו תאי ה-RB על ידי בידוד האורגנואידים של RB.
כאן, הפרוטוקול מספק את פרטי ההבחנה בשלבים שונים (איור 2). כדורים חלולים נוצרים בשלושת הימים הראשונים שמתחברים לפני השטח של התרבית ואז מתרחבים (איור 2A-E). מהיום ה-15 ואילך, התאים מוגבהים ומתרבים בתרחיף (איור 2F). יום לאחר הניתוק נוצרים אורגנואידים ברשתית, והשוליים הבהירים נראים לעין (איור 2G, חיצים שחורים). יתר על כן, תאים אלה מחוץ לאורגנואידים צפויים למות בשבוע הבא (איור 2G, חיצים כתומים). ביום ה-27, ארכיטקטורת השלפוחית האופטית ניכרת, וכ-90% מהאורגנואידים מציגים מבנה זה (איור 2H); את האורגנואידים ללא מבנה זה ניתן להשליך. הגילוי הראשון של ה-RB מתרחש ביום 45, ואז הוא הופך מוחשי ביום 50 (איור 2I). כאשר הוא גדל עד היום ה-90, מבני השלפוחית האופטית מוקפים בעיקר על-ידי ה-RB (איור 2J). בינתיים, ניתן לבודד את ה-RB כקו תאי RB לתרבית נוספת (איור 2K). מעל 80% אורגנואידים ברשתית יהיו עטופים במלואם על ידי ה-RB ביום 105 (איור 2L). הם מראים מאוד ביטוי של Ki67 (סמן התפשטות) ו-SYK (סמן אונקוגן) בהשוואה לאורגנואידים ברשתית שמקורם ב-H9, מה שמצביע על הגידול באורגנואידים של RB (איור 2M,N). בנוסף, הביטוי הגבוה של ARR3 (יוצר מבשר חרוט) ו-CRX (סמן מבשר פוטורצפטור) באורגנואידים של RB מדגים שמקורם בתאים מקדמי חרוט (איור 2O,P).
ההליך של יצירת RB עובר בעיקר שלושה שלבים עם שינויים מורפולוגיים לפני היווצרות RB; כאן, המחקר מספק את התוצאות הנחותות והמעולות בשלבים אלה (איור 3). קל להבחין בין hESC מובחן ולא מובחן (איור 3A,B) לבין המורפולוגיה, וה-hESC הלא מובחן נבחר להיווצרות RB. ביום החמישי, כדור חלול אמור להיווצר (איור 3D) ולא כדור מוצק (איור 3C). ה-RB נגזר מהאורגנואידים ברשתית, המציגים ארכיטקטורת שלפוחית אופטית (איור 3F). אין RB שייווצר באורגנואידים נחותים (איור 3E).
איור 1: מבט סכמטי על התמיינות האורגנואידים של RB. יום 0-יום 15, התאים הם תרבית דו-ממדית במדיום I, ואחרי יום 15, התאים הם תרבית תרחיף. RB נוצר בסביבות יום 45. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: יצירת RB ואפיון. (A-C) ההליך של השלב המוקדם, hESC מורם כדי ליצור את הציסטות. החיצים השחורים ב-(B) מראים את הקצוות המגולגלים של hESC לאחר טיפול שונה. (ד,ה) הציסטות נצמדות ללוחות (D) ואז מתרחבות (E). (F) תאים דבקים מוגבהים כדי ליצור את האורגנואידים ברשתית. חצים שחורים מציינים את הקצוות המגולגלים לאחר הטיפול. (ז,ח) בימים הראשונים אורגנואידים ברשתית ללא RB. (I, J) האורגנואידים ברשתית עם RB ביום 50 (I) וביום 90 (J), העיגולים הירוקים מעידים על חלקי ה-RB. (K) קו תאי ה-RB המבודד מאורגנואידים ברשתית למשך 90 יום. (L) האורגנואידים של RB ביום 105. (מ-פ) תמונות האימונופלואורסצנציה עבור סמני אונקוגן (M,N) וסמני פוטורצפטור (O,P). ב- A-L, פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר; ב- M-P, סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרשים 3: השוואה בין התוצאות השליליות והחיוביות. התמונות הנחותות והמעולות להבחנה ביום 0 (A,B), ביום 5 (C,D) וביום 30 (E,F). סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רטינובלסטומה אנושית (RB) נגרמת על ידי השבתה של RB1 ותפקוד לקוי של חלבון Rb. בפרוטוקול זה, RB1-KO hESC הוא השלב המרכזי ליצירת RB בצלחת. בעוד שאפילו עם RB1-/- hESC, ייתכן שאין היווצרות RB עקב השיטות של הבחנה אורגנואידית ברשתית10. בפרוטוקול זה, המעבר מתרבות דבק לתרבות צפה הוא חיוני בתהליך ההבחנה. צפיפות הציסטות, סוגי תאי הגזע הפלוריפוטנטיים וקצב ההתרבות הם כל המשתנים שישפיעו על תזמון הניתוק. רצוי לנתק את התאים כאשר הם מורחבים אך לא מתקשרים על ידי מושבות שכנות9. אם המושבות סמוכות, זה יוביל לאורגנואידים רציפים ברשתית ואז יפחית את יעילות ההבחנה.
על ידי ביצוע השלבים באופן ביקורתי, זה יהיה לא מוטרד לקצור את RB. עם זאת, שיטה זו יכולה רק מודל RB עם השבתה biallelic של RB1. עבור חולי RB שעברו בירושה, אשר נשאו מוטציה הטרוזיגוטית RB1, הוא אינו מסוגל לחקות את תהליך הגידול עם מוטציית RB1 ההטרוזיגוטית 11. עם זאת, זהו עדיין מודל RB אופטימלי מכיוון שהוא כיום הקרוב ביותר לגידול RB בפועל בחולים1. הוא חולק את אותו מקור עם RB 3,12 ראשוני ומתגבר על ההבדל בין המינים של מודלים של עכברים או סביבה דו-ממדית פשוטה של קווי תאים סרטניים אימורטליים 3,12,13.
ה-RB האנושי מבוסס על צלחת שמקורה ב-ESC אנושי בשיטה המתוארת, והוא מפגין דמיון רב ל-RB הראשוני האנושי. לכן, זה יספק פלטפורמה אידיאלית להבהרת הפתולוגיה המולקולרית של RB אנושי וסינון של סוכנים פרמקולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים לא ידוע על זיקות, חברות, מימון או אחזקות כספיות שעשויים להשפיע על האובייקטיביות של מחקר זה.
Acknowledgments
אנו מודים לצוות 502 על כל העזרה. עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג'ינג (Z200014) ותוכנית המו"פ הלאומית של סין (2017YFA0105300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
- Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
- Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E.
- Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
- Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
- Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
- Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
- Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
- Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).
