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Cancer Research

विट्रो में मानव रेटिनोब्लास्टोमा का पुनर्निर्माण

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/62629
Automatic Translation
1, 1
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

Summary

हम मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) में बाइएलील आरबी 1 उत्परिवर्तन पेश करके मानव रेटिनोब्लास्टोमा (आरबी) उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। आरबी सेल लाइनों को एक डिश में पृथक आरबी का उपयोग करके सफलतापूर्वक संवर्धित किया जा सकता है।

Abstract

मानव आरबी बाल चिकित्सा कैंसर है, जो घातक है यदि कोई उपचार नहीं दिया जाता है। चूंकि आरबी शंकु अग्रदूतों से उत्पन्न होता है, जो कृंतक मॉडल में अपेक्षाकृत दुर्लभ है, इस बीच मनुष्यों और कृन्तकों के बीच अंतर-प्रजाति अंतर के बारे में, मनुष्यों से प्राप्त एक रोग मॉडल मानव आरबी के तंत्र को उजागर करने और चिकित्सा के लक्ष्यों की तलाश के लिए अधिक फायदेमंद है। इसमें, प्रोटोकॉल क्रमशः एक द्विगुणित आरबी 1 बिंदु उत्परिवर्तन (आरबी 1 म्यूट / म्यूट) और आरबी 1 नॉकआउट म्यूटेशन (आरबी 1-/-) के साथ दो जीन-संपादित एचईएससी लाइनों की पीढ़ी का वर्णन करता है। रेटिना विकास की प्रक्रिया के दौरान, आरबी का गठन देखा जाता है। आरबी ऑर्गेनोइड्स से अलग करके आरबी सेल लाइनें भी स्थापित की जाती हैं। कुल मिलाकर, जीन-संपादित एचईएससी लाइनों को 2 डी और 3 डी संयुक्त भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके रेटिना ऑर्गेनोइड्स में अंतर करके, हमने सफलतापूर्वक एक डिश में मानव आरबी का पुनर्निर्माण किया है और इसके शंकु-अग्रदूत मूल की पहचान की है। यह रेटिनोब्लास्टोमा उत्पत्ति, प्रसार और विकास के साथ-साथ नए चिकित्सीय एजेंटों को विकसित करने के लिए एक सहायक रोग मॉडल प्रदान करेगा।

Introduction

मानव रेटिनोब्लास्टोमा (आरबी) रेटिना शंकु-अग्रदूतों से प्राप्त एक दुर्लभ, घातक ट्यूमर है 1,2,3, बचपन में इंट्राओकुलर दुर्भावना का सबसे आम प्रकार है। आरबी 1 जीन की होमोजीगस निष्क्रियता आरबी5 में आनुवंशिक घाव की शुरुआत है। हालांकि, आरबी 1 उत्परिवर्तन वाले चूहे रेटिना ट्यूमर2 बनाने में विफल रहते हैं। यद्यपि माउस ट्यूमर आरबी 1 उत्परिवर्तन और अन्य आनुवंशिक संशोधनों के संयोजन के साथ उत्पन्न हो सकते हैं, फिर भी उनमें मानव आरबी6 की विशेषताओं की कमी है। रेटिना ऑर्गेनॉइड भेदभाव के विकास के लिए धन्यवाद, एचईएससी-व्युत्पन्न आरबी प्राप्त किया जा सकता है, जो मानव आरबी1 के पात्रों को प्रदर्शित करता है।

पिछले दशक में रेटिना ऑर्गनॉइड भेदभाव के लिए कई प्रोटोकॉल स्थापित किए गए हैं, जिनमें 2 डी7, 3 डी8 और 2 डी और 3 डी 9 का संयोजन शामिलहै। मानव आरबी उत्पन्न करने के लिए यहां उपयोग की जाने वाली विधि अनुयायी संस्कृति और फ्लोटिंग संस्कृतिका समेकन है। आरबी 1 उत्परिवर्तित एचईएससी को रेटिना ऑर्गेनोइड्स में अलग करके, आरबी के गठन का पता लगभग 45 वें दिन लगाया जाता है, और फिर यह लगभग 60 वें दिन तेजी से बढ़ता है। 90 वें दिन, आरबी का अलगाव, और आरबी सेल लाइन का उत्पादन संभव है; इसके अलावा, आरबी 120 वें दिन लगभग सभी रेटिना ऑर्गेनोइड्स को घेरता है।

एचईएससी-व्युत्पन्न आरबी आरबी के लिए उत्पत्ति, ट्यूमरजेनिसिस और उपचार की खोज के लिए एक अभिनव मॉडल है। इस प्रोटोकॉल में, जीन-संपादन एचईएससी की पीढ़ी, आरबी के भेदभाव और आरबी के लिए लक्षण वर्णन विस्तार से वर्णित हैं।

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Protocol

यह अध्ययन बीजिंग टोंगरेन अस्पताल, कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी की संस्थागत आचार समिति द्वारा अनुमोदित है। एच 9 एचईएससी वाईसेल रिसर्च इंस्टीट्यूट से प्राप्त किए जाते हैं।

1. आरबी 1 उत्परिवर्तित एचईएससी का उत्पादन

  1. CRISPR/Cas9 RB1 के नॉकआउट (KO) के लिए लक्ष्यीकरण वेक्टर।
    1. एसजीआरएनए की एक जोड़ी डिजाइन करें। आरबी 1 के पृथक्करण के लिए, इस जीन के पहले एक्सॉन को लक्षित करें। फॉरवर्ड प्राइमर अनुक्रम सीएसीसीजीजीसीजीटीटीसीजीजी है, और रिवर्स प्राइमर अनुक्रम एएएसीसीसीजीजीसीजीसीसीजीसीसीजीसी है।
      नोट: विशिष्ट RB1 उत्परिवर्तन के लिए, एक मरम्मत टेम्पलेट भी आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में, RB1-KO सेल लाइन एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है।
    2. निर्माता के निर्देशों का पालन करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए बीबीएसी प्रतिबंध एंजाइमों ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पीएक्स 330-यू 6-चिमेरिक बीबी-सीबीएच-एचएसपीसीएएस 9-2 ए-पुरो के 1 μg को पचाएं।
    3. निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पचे हुए प्लास्मिड को शुद्ध करें।
      नोट: एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं को शुद्धिकरण किट का उपयोग करके एगारोस जेल के बिना सीधे साफ किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)।
    4. टी4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज (पीएनके) (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके ओलिगोस की प्रत्येक जोड़ी को फॉस्फोराइलेट और एनाल करें, जिसमें ओलिगो1 का 1 μL (100 μM), ऑलिगो2 का 1 μL (100 μM), 10x T4 लिगेशन बफर का 1 μL, ddH2O का 6.5 μL और T4 PNK का 0.5 μL शामिल है।
      नोट: चरण 1.1.1 में आगे और पीछे प्राइमर ऑलिगोस की एक जोड़ी हैं। निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके थर्मोसाइक्लर में ऑलिगोस को फॉस्फोराइलेट और नष्ट करें: 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस; 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 5 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट पर 25 डिग्री सेल्सियस तक रैंप करें।
    5. कमरे के तापमान (आरटी) पर न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 199 μL में ऑलिगो अभिकर्मक के 1 μL जोड़कर फॉस्फोराइलेटेड और नष्ट किए गए ऑलिगोस को 200 बार पतला करें।
    6. लिगेशन प्रतिक्रिया सेट करें और निम्नलिखित को मिलाकर 10 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें: चरण 1.1.3 से 50 एनजी बीबीएस 1 पचा हुआ प्लास्मिड, चरण 1.1.5 से ऑलिगो डुप्लेक्स का 1 μL, 2x लिगेशन बफर का 5 μL, लिगेज का 1 μL, और न्यूक्लियस-मुक्त पानी का उपयोग करके 10 μL तक ऊपर।
    7. लिगेशन मिश्रण को बदलें और अगले चरण के लिए सकारात्मक कॉलोनियों को अनुक्रमित करें।
      नोट: अनुक्रमण के लिए यू 6 फॉरवर्ड या रिवर्स प्राइमर का उपयोग करें।
      1. बर्फ पर सक्षम कोशिकाओं को पिघलाएं।
      2. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सक्षम कोशिकाओं के 50 μL लें।
      3. सक्षम कोशिकाओं में चरण 1.1.6 से बंधाव मिश्रण का 1 μL जोड़ें।
      4. ट्यूब को तीन बार ऊपर और नीचे करके धीरे-धीरे मिलाएं।
        नोट: भंवर मत करो।
      5. मिश्रण को 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
      6. 90 सेकंड के लिए मिश्रण को 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
      7. ट्यूब में एंटीबायोटिक के बिना कमरे के तापमान के 950 μL Luria-Bertani (LB) शोरबा जोड़ें।
      8. ट्यूब को 300 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए एक शेकर में रखें।
      9. एलबी प्लेटों (पेप्टोन, कैसिइन से पेपटोन, सोडियम क्लोराइड, एगर-एगर और एम्पीसिलीन) को 37 डिग्री सेल्सियस पहले गर्म करें।
      10. आरटी पर प्लेटों पर कोशिकाओं और बंधाव मिश्रण के 50-100 μL फैलाएं।
      11. प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      12. प्लेट से 12 कॉलोनियों को उठाएं और उन्हें एम्पीसिलीन के साथ एलबी माध्यम में स्थानांतरित करें। माध्यम को 60 मिनट के लिए 300 आरपीएम पर एक शेकर पर रखें।
      13. पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में बैक्टीरिया समाधान (चरण 1.1.7.12 से) के 1 μL का उपयोग करें और सकारात्मक कॉलोनियों का चयन करें।
      14. यू 6 प्राइमरों द्वारा सकारात्मक कॉलोनियों को अनुक्रमित करें, अगले चरण में डिज़ाइन किए गए एसजीआरएनए अनुक्रमों के साथ कॉलोनी का उपयोग करें।
    8. एक मिडी किट का उपयोग करके प्लास्मिड निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: मिनी किट का उपयोग करके प्लास्मिड की गुणवत्ता और मात्रा निम्नलिखित न्यूक्लियोफेक्शन प्रयोग के लिए पर्याप्त नहीं है। मिडी या मैक्सी किट मिनी किट की तुलना में अधिक उपयुक्त है।
  2. एचईएससी संस्कृति और न्यूक्लियोफेक्शन।
    नोट: आरटी के लिए सभी अभिकर्मकों को तैयार करें।
    1. 1 x 106 H9 कोशिकाओं को 10 μM Y-27632 (ROCK अवरोधक) और 2 mL ताजा ncEpic-HIPSC / hESC संस्कृति माध्यम के साथ पूर्व-लेपित 6-वेल प्लेट में पिघलाएं।
      नोट: 1% विकास कारक के साथ 6-वेल प्लेट को उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को कम करें।
    2. अगले दिन, सतह पर तैरने वाले को हटा दें, कोशिकाओं को 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (DPBS) के साथ कुल्ला करें, और फिर 2 mL ताजा ncEpic-hiPSC / hESC संस्कृति माध्यम जोड़ें।
    3. अगले 3-5 दिनों में 2 एमएल ताजा एनसीईपीआईसी-एचआईपीएससी / एचईएससी संस्कृति माध्यम के साथ हर दिन माध्यम को बदलें जब तक कि कोशिकाएं लगभग 80% कंफ्लुएंसी तक न बढ़ जाएं।
    4. एचईएससी की स्थिति को समायोजित करने के लिए एक या दो बार पारित करें।
      नोट: एचईएससी की स्थिति की पहचान करने का सबसे आसान तरीका आकृति विज्ञान है।
    5. 6-वेल प्लेट में अविभाजित एच 9 कोशिकाओं को तब तक कल्चर करें जब तक कि वे 80% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाएं।
    6. न्यूक्लियोफेक्शन से पहले के माध्यम को 2 एमएल ताजा एनसीईपीआईसी-हाईपीएससी/एचईएससी कल्चर माध्यम के साथ बदलें, जिसे वाई -27632 के 10 μM के साथ मिलाया जाता है और 1% ग्रोथ फैक्टर कम बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स का उपयोग करके 12-वेल प्लेट के एक कुएं को प्रीकोट करें।
    7. मध्यम को एस्पिरेट करें और 1 एमएल प्रीवार्ड डीपीबीएस के साथ कुल्ला करें।
    8. डीपीबीएस को हटा दें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3.5 मिनट के लिए 1 एमएल सेल पृथक्करण एंजाइम ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें।
    9. एचईएसपी कोशिकाओं को एकल सेल निलंबन में बनाने के लिए कोशिकाओं और पिपेट के 1 एमएल ताजा एनसीईपीआईसी-एचआईपीएससी / एचईएससी कल्चर माध्यम को दो बार जोड़ें।
    10. सेल गिनती के लिए मिश्रण के 100 μL निकालें और शेष को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें एक और 2 एमएल ncEpic-hiPSC / hESC संस्कृति माध्यम हो।
    11. 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और लगभग 2 x 106 कोशिकाओं को 100 μL प्रतिक्रिया मात्रा में पुन: निलंबित करें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, कोशिकाओं, प्लास्मिड, न्यूक्लियोफेक्टर और प्रतिक्रिया स्थितियों के लिए मात्रा का अनुकूलन करें। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले न्यूक्लियोफेक्शन सिस्टम के लिए सामग्री की तालिका देखें।
      नोट: आम तौर पर, न्यूक्लियोफेक्शन के दौरान बुलबुले की अनुमति नहीं होती है।
    12. अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं को प्रीकोडेड 12-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें, 1.5 एमएल एनसीईपीआईसी-एचआईपीएससी / एचईएससी कल्चर माध्यम और वाई -27632 के 10 μM के साथ पूरक करें, और फिर कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में कल्चर करें।
    13. माध्यम को प्रतिदिन बदलें। 48 घंटे के बाद, लगभग एक सप्ताह के आसपास सेल चयन के लिए प्यूरोमाइसिन के 2 μg / mL जोड़ें।
      नोट: पहले 3 दिनों के दौरान कई कोशिकाएं मर जाती हैं। शेष कोशिकाएं प्यूरोमाइसिन चयन के बाद अगले सप्ताह में कॉलोनियों में प्रसार और उत्पन्न हो सकती हैं। चयन सप्ताह में, सुनिश्चित करें कि माध्यम में हमेशा 2 μg / mL puromycin होता है।
    14. माइक्रोस्कोप के तहत कॉलोनियों को मैन्युअल रूप से चुनें।
      नोट: कॉलोनी आकृति विज्ञान एचईएस कॉलोनी के समान है। कॉलोनियों को टुकड़ों (प्रति कॉलोनी 2-6 टुकड़े) में काट लें, जिसमें माध्यम में 10 μL सफेद / सामान्य पिपेट टिप हो और एक कॉलोनी को 12-वेल प्लेट के एक प्रीकोटेड कुएं में स्थानांतरित करें।
    15. सबसे पहले, आरबी 1 उत्परिवर्तन और ऑफ-टारगेट स्थितियों की पहचान करें (तालिका 1), और फिर आरबी 1 नॉकआउट एच 9 सेल लाइन को चिह्नित करने के लिए प्लुरिपोटेंसी।
      नोट: पीसीआर और सेंगर अनुक्रमण का उपयोग करके आरबी 1 उत्परिवर्तन और ऑफ-टारगेट स्थितियों का पता लगाएं। आरटी-पीसीआर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा प्लूरिपोटेंसी मार्करों की पहचान करें।

2. मानव रेटिनोब्लास्टोमा की पीढ़ी

  1. आरबी 1-केओ एचईएससी का रखरखाव।
    1. विकास कारक में जीन-संपादित एच 9 कोशिकाओं ने बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को 2 एमएल एनसीईपीआईसी-एचआईपीएससी / एचईएससी संस्कृति माध्यम के साथ लेपित 6-वेल प्लेट को कम कर दिया और हर दिन माध्यम को बदल दिया।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3.5 मिनट या आरटी पर 5 मिनट के लिए ईडीटीए बफर का उपयोग करके मार्ग।
      नोट: ईडीटीए बफर 1x DPBS, 5 mM EDTA, और NaCl के 0.9 mg / mL का मिश्रण है।
  2. रेटिना सेल भेदभाव।
    नोट: भेदभाव से पहले माध्यम I तैयार करें। मीडियम I तैयार करने के लिए, 24.5 एमएल डल्बेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम)/पोषक तत्व मिश्रण एफ -12 (एफ 12)-ग्लूटामाइन (1एक्स), 24.5 एमएल न्यूरोनल बेसल माध्यम, 100 एक्स पूरक ए के 250 μL, 50x पूरक बी के 500 μL, 0.1 mM b-mercaptoethanol, और 100x L-glutamine के 250 μL मिलाएं। उपयोग से पहले सभी मिश्रणों को आरटी में प्रीवार्म करें।
    1. आरबी 1-केओ एचईएससी को 6-वेल प्लेट के एक कुएं में 80% संगम तक उगाएं।
    2. माध्यम को हटा दें और 1 x DPBS के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1 एमएल डिस्पेस बफर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके सेल कॉलोनियों को ऊंचा करें।
      नोट: माइक्रोस्कोप के तहत सेल कॉलोनियों की जांच करें। आमतौर पर, कॉलोनियों के किनारे को रोल आउट करने में 5 मिनट लगते हैं।
    4. डिस्पेस बफर को एस्पिरेट करें और धीरे से 1 एमएल 1 एक्स डीपीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    5. कुएं में 1 एमएल मीडियम I जोड़ें।
    6. कॉलोनियों को टुकड़ों (प्रति कॉलोनी 6-9 टुकड़े) में काट लें, जिसमें माध्यम में 10 μL सफेद / सामान्य पिपेट टिप हो।
      नोट: आम तौर पर, लगभग 60% -70% कोशिकाएं कुएं से अलग हो जाती हैं। माध्यम में शेष कोशिकाओं को स्क्रैप करने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
    7. 5 मिनट के लिए 200 x g पर 15 एमएल ट्यूब में सेंट्रीफ्यूजिंग करके सभी कोशिकाओं को काटें।
    8. माध्यम में कोशिकाओं को फैलाने के लिए सतह पर तैरने वाले के लगभग 50 μL छोड़ दें, और फिर कोशिकाओं को 250 μL विकास कारक के साथ मिलाएं, जो कोमल आंदोलन द्वारा तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को कम करता है।
      नोट: उपयोग से पहले विकास कारक को कम बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स या तो 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर रखें। यदि इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और संग्रहीत किया जाता है, तो इसे रात भर या उपयोग से कम से कम 1 घंटे पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    9. निलंबित कोशिकाओं के साथ 15 एमएल ट्यूब को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं और विकास कारक ने तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को कम कर दिया है जो एक ठोस जेल बनाते हैं।
    10. 15 एमएल ट्यूब में 1 एमएल मीडियम I जोड़ें, और फिर 1 एमएल पिपेट के साथ झुरमुट को फैलाने के लिए ठोस जेल को दो से तीन बार हल्के से पाइप करें।
    11. मीडियम I के 9 एमएल जोड़ें और सेल निलंबन को 10 सेमी सेल कल्चर डिश में स्थानांतरित करें।
    12. डिश को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ले जाएं और दिन को दिन 0 के रूप में सेट करें।
    13. दिन 1 पर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की जांच करें।
      नोट: पकवान में हजारों खोखले अल्सर देखे जा सकते हैं। औसतन, जेल के एक टुकड़े में 3 से 4 अल्सर देखे जाते हैं।
    14. 5 वें दिन माध्यम बदलें। सुपरनैटेंट को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें, अल्सर को नीचे तक बसने की प्रतीक्षा करें, और फिर माध्यम को हटा दें और इसे ताजा माध्यम I के साथ बदलें।
      नोट: यदि माध्यम 4 वें दिन पीला हो जाता है, तो दिन 4 पर माध्यम बदलें, अन्यथा दिन 5 पर। मूल पकवान में 10 एमएल ताजा माध्यम I जोड़ें। सैकड़ों अल्सर पहले से ही संस्कृति की सतह से जुड़े हुए हैं; उन्हें वहां रखें।
    15. ट्यूब में अल्सर को दो 10 सेमी व्यंजनों में फैलाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि एक डिश में कम से कम 300 सिस्ट हैं। यदि अल्सर कॉन्फ्लुएंट नहीं हैं, तो अल्सर को अन्य व्यंजनों में अलग न करें; उन्हें मूल 10 सेमी डिश पर वापस करें।
    16. 7 वें दिन, अधिकांश अल्सर (95% से ऊपर) पकवान से जुड़ते हैं, फैलते हैं, और अनुयायी उपनिवेश बनाते हैं।
      नोट: दिन 3 की शुरुआत में, अनुयायी कॉलोनियों को देखा जा सकता है।
    17. 10 वें दिन, माध्यम को ताजे माध्यम से बदलें I. सुनिश्चित करें कि सभी अल्सर पकवान से जुड़े हुए हैं।
    18. निम्नलिखित को मिलाकर अगले चरण से पहले मध्यम II तैयार करें: डीएमईएम के 36 एमएल, एफ 12 के 12 एमएल, पूरक बी (वी / वी), 0.1 एमएम एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (एनईएए) का 2%।
    19. सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं 13-17 दिन तक फैल गई हैं। 15 वें दिन अगला चरण करें जब कोशिकाएं फैली हुई हैं लेकिन पड़ोसी उपनिवेशों के साथ बातचीत नहीं कर रही हैं।
    20. डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को एक बार धोएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1 एमएल डिस्पेज़ घोल जोड़ें।
      नोट: 5 मिनट के भीतर, कोशिकाओं का किनारा बढ़ जाता है।
    21. डिस्पेस बफर को हटा दें और धीरे से 1 एमएल 1x DPBS के साथ संस्कृतियों को कुल्ला करें।
    22. प्रत्येक 10 सेमी डिश में 10 एमएल मध्यम II जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर मेंसंस्कृति जोड़ें।
    23. अनुयायी संस्कृतियां अनायास 24 घंटे के बाद अलग हो जाती हैं और रेटिना ऑर्गेनोइड्स में इकट्ठा होती हैं।
      नोट: कई कोशिकाएं जो ऑर्गेनोइड नहीं बनाती हैं, वे अगले 2 दिनों में मर जाएंगी।
    24. अलगाव के तीन दिन बाद, सेल कल्चर डिश से कोशिकाओं को इकट्ठा करें और ऑर्गेनोइड्स को 15 एमएल ट्यूब में बसने की अनुमति दें।
    25. ट्यूब से सतह पर तैरने वाले को हटा दें और अगले चार दिनों के लिए ऑर्गेनोइड्स को 10 एमएल मीडियम II के साथ एक नए गैर-अनुगामी डिश (पेट्री डिश) में स्थानांतरित करें।
    26. डीएमईएम: एफ 12 को 3: 1 अनुपात (वी / वी), 2% पूरक बी (वी / वी), 0.1 एमएम एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (एनईएए), 8% भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) (वी / वी), टॉरिन के 100 μM, और 2 mM ग्लूटामाइन को मिलाकर मध्यम III तैयार करें।
    27. अलगाव के एक सप्ताह बाद, माध्यम को मध्यम III में बदलें।
    28. इस दिन से, मध्यम III में ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करें और सप्ताह में दो बार माध्यम को ताज़ा करें।
  3. आरबी सेल लाइन की स्थापना।
    नोट: सभी अभिकर्मकों को आरटी पर पूर्वप्रवेशित किया जाता है।
    1. 90 वें दिन, आरबी (80% -90%) रेटिना ऑर्गेनोइड्स को शामिल करते हैं। इसलिए, आरबी सेल लाइन की पीढ़ी के लिए 90-दिवसीय आरबी ऑर्गेनोइड्स चुनें।
    2. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई)-1640 माध्यम को 10% एफबीएस के साथ मिलाकर 1640 माध्यम तैयार करें।
    3. आरपीएमआई -1640 माध्यम में माइक्रोस्कोप के तहत माइक्रोसर्जिकल चाकू के साथ आरबी को टुकड़ों (20-25 टुकड़े प्रति आरबी) में काटें।
    4. RPMI-1640 माध्यम निकालें और टुकड़ों को 0.25% ट्रिप्सिन / ईडीटीए के साथ 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इलाज करें।
    5. प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए RPMI-1640 माध्यम जोड़ें और 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और 1640 के माध्यम में कोशिकाओं को एक गैर-अनुयायी डिश में फिर से निलंबित करें।
    7. आरबी सेल लाइन एक फ्लोटिंग कल्चर है। सप्ताह में दो बार माध्यम बदलें और 2 सप्ताह के भीतर आरबी कोशिकाओं को पारित करें।
      नोट: प्राथमिक आरबी कोशिकाओं की प्रसार दर काफी धीमी है।

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Representative Results

आरबी पीढ़ी की प्रक्रिया को चित्रा 1 में स्पष्ट किया गया है, जो अनुयायी और फ्लोटिंग संस्कृति को जोड़ती है। आरबी 1-केओ एचईएससी से मानव आरबी की कटाई करना और आरबी ऑर्गेनोइड्स को अलग करके आरबी सेल लाइन प्राप्त करना संभव था।

यहां, प्रोटोकॉल विभिन्न चरणों में भेदभाव का विवरण प्रदान करता है (चित्रा 2)। खोखले गोले पहले 3 दिनों में बनते हैं जो संस्कृति की सतह से जुड़ते हैं और फिर विस्तार करते हैं (चित्रा 2ए-ई)। 15 वें दिन से, कोशिकाओं को ऊंचा किया जाता है और निलंबन में संस्कृति होती है (चित्रा 2 एफ)। डिटेचमेंट के अगले दिन, रेटिना ऑर्गेनोइड्स बनते हैं, और उज्ज्वल रिम दिखाई देते हैं (चित्रा 2 जी, काले तीर)। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड्स के बाहर उन कोशिकाओं को अगले सप्ताह में मरने की संभावना है (चित्रा 2 जी, नारंगी तीर)। दिन 27 पर, ऑप्टिक पुटिका वास्तुकला स्पष्ट है और लगभग 90% ऑर्गेनोइड इस संरचना को प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 2 एच); इस संरचना के बिना ऑर्गेनोइड्स को छोड़ दिया जा सकता है। आरबी का पहला पता 45 वें दिन होता है, और फिर यह 50 वें दिन स्पष्ट हो जाता है (चित्रा 2 आई)। जब यह 90 वें दिन तक बढ़ता है, तो ऑप्टिक पुटिका संरचनाओं को मुख्य रूप से आरबी (चित्रा 2 जे) द्वारा संलग्न किया जाता है। इस बीच, आरबी को आगे की संस्कृति (चित्रा 2 के) के लिए आरबी सेल लाइन के रूप में अलग किया जा सकता है। 80% से अधिक रेटिना ऑर्गेनोइड 105 वें दिन आरबी द्वारा पूरी तरह से कवर किए जाएंगे (चित्रा 2 एल)। वे एच 9-व्युत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड्स की तुलना में Ki67 (प्रसार मार्कर) और SYK (ऑन्कोजीन मार्कर) की अभिव्यक्ति दिखाते हैं, जो आरबी ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 2 एम, एन) में ट्यूमरजेनिसिस को इंगित करता है। इसके अतिरिक्त, आरबी ऑर्गेनोइड्स में एआरआर 3 (शंकु अग्रदूत निर्माता) और सीआरएक्स (फोटोरिसेप्टर अग्रदूत मार्कर) की उच्च अभिव्यक्ति दर्शाती है कि वे शंकु अग्रदूत कोशिकाओं (चित्रा 2 ओ, पी) से उत्पन्न होते हैं।

आरबी पीढ़ी की प्रक्रिया मुख्य रूप से आरबी गठन से पहले आकृति विज्ञान परिवर्तन के साथ तीन चरणों से गुजरती है; यहां, अध्ययन उन चरणों में हीन और बेहतर परिणाम प्रदान करता है (चित्रा 3)। विभेदित और उदासीन एचईएससी (चित्रा 3 ए, बी) आकृति विज्ञान से अलग करना आसान है, और आरबी गठन के लिए अविभाजित एचईएससी को चुना जाता है। दिन 5 पर, एक खोखले गोले को ठोस के बजाय (चित्रा 3 डी) उत्पन्न करना चाहिए (चित्रा 3 सी)। आरबी रेटिना ऑर्गेनोइड्स से लिया गया है, जो ऑप्टिक पुटिका वास्तुकला (चित्रा 3 एफ) प्रदर्शित करते हैं। कोई आरबी नहीं है जो अवर ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 3 ई) में उत्पन्न होगा।

Figure 1
चित्रा 1: आरबी ऑर्गेनोइड्स भेदभाव का योजनाबद्ध दृश्य। दिन 0-दिन 15, कोशिकाएं माध्यम I में 2 डी संस्कृति हैं, और 15 वें दिन के बाद, कोशिकाएं निलंबन संस्कृति हैं। आरबी का गठन लगभग 45 वें दिन होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: आरबी पीढ़ी और लक्षण वर्णन। (ए-सी) प्रारंभिक चरण की प्रक्रिया, एचईएससी को अल्सर बनाने के लिए ऊंचा किया जाता है। (बी) में काले तीर डिस्पेस उपचार के बाद एचईएससी के लुढ़के हुए किनारों को दिखाते हैं। (D, E) अल्सर प्लेटों (डी) से जुड़ते हैं और फिर विस्तार (ई) करते हैं। (एफ) रेटिना ऑर्गेनोइड बनाने के लिए अनुयायी कोशिकाओं को ऊंचा किया जाता है। काले तीर डिस्पेस उपचार के बाद लुढ़के हुए किनारों को इंगित करते हैं। (G, H) आरबी के बिना शुरुआती दिनों रेटिना ऑर्गेनोइड्स। (I, J) दिन 50 (I) और दिन 90 (J) पर आरबी के साथ रेटिना ऑर्गेनोइड्स, हरे घेरे आरबी भागों का प्रमाण देते हैं। (के) 90-दिवसीय रेटिना ऑर्गेनोइड्स से पृथक आरबी सेल लाइन। (एल) आरबी ऑर्गेनोइड्स 105 वें दिन। (एम-पी) ऑन्कोजीन मार्करों (एम, एन) और फोटोरिसेप्टर मार्करों (ओ, पी) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। ए-एल में, स्केल बार = 200 μm; M-P में, स्केल सलाखों = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नकारात्मक और सकारात्मक परिणामों की तुलना। दिन 0 (ए, बी), दिन 5 (सी, डी), और दिन 30 (ई, एफ) पर भेदभाव के लिए हीन और बेहतर छवियां। स्केल पट्टियाँ = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

मानव रेटिनोब्लास्टोमा (आरबी) आरबी 1 की निष्क्रियता और आरबी प्रोटीन की शिथिलता के कारण होता है। इस प्रोटोकॉल में, आरबी 1-केओ एचईएससी एक डिश में आरबी की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण कदम है। जबकि आरबी 1-/- एचईएससी के साथ भी, यह संभव है कि रेटिना ऑर्गेनॉइड भेदभाव10 के तरीकों के कारण कोई आरबी गठन नहीं है। इस प्रोटोकॉल में, भेदभाव की प्रक्रिया में अनुयायी संस्कृति से फ्लोटिंग संस्कृति में स्थानांतरण आवश्यक है। अल्सर का घनत्व, प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के प्रकार, और प्रसार दर सभी चर हैं जो अलगाव के समय को प्रभावित करेंगे। कोशिकाओं को अलग करना वांछनीय है जब वे विस्तारित होते हैं लेकिन पड़ोसी उपनिवेशों द्वारा बातचीत नहीं की जातीहै। यदि उपनिवेश आस-पास हैं, तो यह सन्निहित रेटिना ऑर्गेनोइड्स को जन्म देगा और फिर भेदभाव दक्षता को कम करेगा।

गंभीर रूप से चरणों का पालन करके, आरबी की कटाई करना मुश्किल होगा। हालांकि, यह विधि केवल आरबी 1 की द्विवार्षिक निष्क्रियता के साथ आरबी को मॉडल कर सकती है। विरासत में मिले आरबी रोगियों के लिए, जिन्होंने विषम आरबी 1 उत्परिवर्तन को आश्रय दिया, यह विषम आरबी 1 उत्परिवर्तन 11 के साथ ट्यूमरजेनिसिस की प्रक्रिया की नकल करने में असमर्थ है। फिर भी, यह अभी भी एक इष्टतम आरबी मॉडल है क्योंकि यह वर्तमान में रोगियों1 में वास्तविक आरबी ट्यूमरजेनिसिस के सबसे करीब है। यह प्राथमिक आरबी 3,12 के साथ एक ही मूल साझा करता है और चूहों के मॉडल या अमर कैंसर सेल लाइनों 3,12,13 के सरलीकृत दो-आयामी वातावरण के प्रजातियों के अंतर को दूर करता है।

मानव आरबी को वर्णित विधि का उपयोग करके मानव ईएससी से प्राप्त एक डिश में स्थापित किया गया है, और यह मानव प्राथमिक आरबी के लिए बहुत समानता प्रदर्शित करता है। इसलिए, यह मानव आरबी के आणविक विकृति और औषधीय एजेंटों की स्क्रीनिंग को स्पष्ट करने के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करेगा।

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Disclosures

लेखकों को किसी भी संबद्धता, सदस्यता, वित्त पोषण या वित्तीय होल्डिंग्स के बारे में पता नहीं है जो इस अध्ययन की निष्पक्षता को प्रभावित कर सकता है।

Acknowledgments

हम 502 टीम को सभी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। यह काम आंशिक रूप से बीजिंग म्यूनिसिपल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (जेड 200014) और चीन के राष्ट्रीय कुंजी आर एंड डी कार्यक्रम (2017वाईएफए0105300) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Anti-ARR3 Sigma HPA063129 Antibody
Anti-CRX (M02) Abnove ABN-H00001406-M02 Antibody
Anti-Ki67 Abcam  ab15580 Antibody
Anti-Syk (D3Z1E) Cell Signaling Technology 13198 Antibody
BbsI NEB R3539S Restriction enzymes
Dispase (1U/mL) Stemcell Technologies 7923
DMEM basic Gibco 10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX Gibco 10565-042
DMSO Sigma D2650
DPBS Gibco C141905005BT
EDTA Thermo 15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells Biological Industry 04-002-1A
Glutamine Gibco 35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) Gibco 11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) Sigma M7145
Neurobasal Medium Gibco 21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S Lonza V4XP-3032 Nucleofection kit
Pen Strep Gibco 15140-122
Puromycin Gene Operation ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium Nuwacell RP01001 ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix BD 356231 Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme Gibco 12563-011 TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit QIAGEN 75144
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74104
Supplement A Life Technologies 17502-048 N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B Life Technologies 17105-041 B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase Life Technologies EK0032
Taurine Sigma T-8691-25G
Y-27632 2HCl Selleck S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro Addgene 42230
Nucleofector 4D Lonza
RPMI Sigma R0883-500ML

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 188
विट्रो में मानव रेटिनोब्लास्टोमा का पुनर्निर्माण
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Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct… More

Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct Human Retinoblastoma In Vitro. J. Vis. Exp. (188), e62629, doi:10.3791/62629 (2022).

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