Summary
Vi beskriver en metod för att generera humant retinoblastom (RB) genom att införa bialleliska RB1-mutationer i mänskliga embryonala stamceller (hESC). RB-cellinjer kan också framgångsrikt odlas med hjälp av den isolerade RB i en skål.
Abstract
Mänsklig RB är barncancer, som är dödlig om ingen behandling ges. Eftersom RB härstammar från konprekursorer, vilket är relativt sällsynt i gnagarmodeller, är det under tiden när det gäller skillnaderna mellan arter mellan människor och gnagare, en sjukdomsmodell som härrör från människor mer fördelaktig för att avslöja mekanismerna för mänsklig RB och söka terapimålen. Häri beskriver protokollet genereringen av två genredigerade hESC-linjer med en biallelic RB1-punktmutation (RB1 Mut/Mut) respektive en RB1 knockout-mutation (RB1-/-). Under processen med retinal utveckling observeras bildandet av RB. RB-cellinjerna etableras också genom att separera från RB-organoiderna. Sammantaget, genom att differentiera de genredigerade hESC-linjerna i retinala organoider med hjälp av ett 2D- och 3D-kombinerat differentieringsprotokoll, har vi framgångsrikt rekonstruerat den mänskliga RB i en maträtt och identifierat dess kon-föregångare ursprung. Det skulle ge en användbar sjukdomsmodell för att observera retinoblastomens uppkomst, proliferation och tillväxt samt vidareutveckla nya terapeutiska medel.
Introduction
Humant retinoblastom (RB) är en sällsynt, dödlig tumör som härrör från näthinnekonprekursorerna 1,2,3, är den vanligaste typen av intraokulär malignitet i barndomen4. Homozygot inaktivering av RB1-genen är den initierande genetiska lesionen i RB5. Möss med RB1-mutationer misslyckas dock med att bilda näthinnetumören2. Även om mustumörerna kan genereras med kombinationen av Rb1-mutationer och andra genetiska modifieringar, saknar de fortfarande funktionerna hos human RB6. Tack vare utvecklingen av retinal organoiddifferentiering kunde den hESC-härledda RB erhållas, som visar karaktärerna hos human RB1.
Många protokoll för retinal organoiddifferentiering har upprättats under det senaste decenniet, inklusive 2D7, 3D8 och en kombination av 2D och 3D9. Metoden som används här för att generera den mänskliga RB är konsolideringen av vidhäftande kultur och flytande kultur9. Genom att differentiera RB1-muterat hESC till retinala organoider detekteras bildandet av RB runt dag 45, och sedan sprider det sig snabbt runt dag 60. På dag 90 är isolering av RB och generering av RB-cellinjen möjlig; dessutom omger RB nästan alla retinala organoider vid dag 120.
hESC-härledd RB är en innovativ modell för att utforska ursprung, tumorigenes och behandlingar för RB. I detta protokoll beskrivs genereringen av genredigerings-hESC, differentieringen av RB och karakteriseringen för RB i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie är godkänd av den institutionella etikkommittén vid Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESC erhålls från WiCell Research Institute.
1. Generering av RB1-muterad hESC
- CRISPR/Cas9 målvektor för knockout (KO) av RB1.
- Designa ett par sgRNA. För ablation av RB1, rikta in dig på den första exonen av denna gen. Den främre primersekvensen är CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, och den omvända primersekvensen är AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
OBS: För den specifika RB1-mutationen krävs också en reparerad mall. I detta protokoll används RB1-KO-cellinjen som ett exempel. - Smält 1 μg pX330-U6-chimär BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro med BbsI-restriktionsenzymer (se materialförteckning) i 30 minuter vid 37 °C genom att följa tillverkarens anvisningar.
- Rena de smälta plasmiderna med hjälp av ett reningssats enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Enzymatiska reaktioner kan rengöras direkt utan agarosgel med hjälp av reningssatsen (se materialtabell). - Fosforylat och glödgat varje par oligos med användning av T4-polynukleotidkinas (PNK) (materialtabell) med reaktionen innefattande 1 μL oligo1 (100 μM), 1 μL oligo2 (100 μM), 1 μL 10x T4-ligeringsbuffert, 6,5 μLddH2O- och 0,5 μL T4 PNK.
OBS: De främre och bakre primersna i steg 1.1.1 är ett par oligos. Fosforylera och glödga oligos i en termocykler med hjälp av följande parametrar: 37 °C i 30 minuter; 95 °C i 5 minuter; rampen ner till 25 °C vid 5 °C per minut. - Späd de fosforylerade och glödgade oligoerna 200 gånger genom att tillsätta 1 μl oligoreagens till 199 μl nukleasfritt vatten vid rumstemperatur (RT).
- Ställ in ligeringsreaktionen och inkubera vid RT i 10 minuter genom att blanda följande: 50 ng Bbs1 smält plasmid från steg 1.1.3, 1 μl oligodetplex från steg 1.1.5, 5 μl 2x ligeringsbuffert, 1 μL ligas och fyll på till 10 μl med nukleasfritt vatten.
- Transformera ligeringsblandningen och sekvensera de positiva kolonierna för nästa steg.
OBS: Använd U6 framåt eller bakåt primer för sekvensering.- Tina de kompetenta cellerna på is.
- Ta 50 μL av de kompetenta cellerna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1 μl av ligeringsblandningen från steg 1.1.6 till de behöriga cellerna.
- Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner i röret tre gånger.
OBS: Virvla inte. - Lägg blandningen på is i 30 min.
- Värmechocka blandningen vid 42 °C i 90 s.
- Tillsätt 950 μl rumstemperatur Luria-Bertani (LB) buljong utan antibiotika till röret.
- Placera röret i en skakapparat vid 300 rpm vid 37 °C i 60 minuter.
- Värm LB-plattorna (pepton, pepton från kasein, natriumklorid, agar-agar och ampicillin) till 37 °C i förväg.
- Sprid 50-100 μL av cellerna och ligeringsblandningen på plattorna vid RT.
- Inkubera plattorna över natten vid 37 °C.
- Plocka upp 12 kolonier från plattan och överför dem till LB-mediet med ampicillin. Placera mediet på en shaker vid 300 rpm i 60 min.
- Använd 1 μL av bakterielösningen (från steg 1.1.7.12) som mall för PCR och välj de positiva kolonierna.
- Sekvensera de positiva kolonierna av U6-primersna, använd kolonin med de designade sgRNA-sekvenserna i nästa steg.
- Extrahera plasmiden med hjälp av ett midi-kit (se Materialförteckning).
OBS: Kvaliteten och kvantiteten på plasmiden med hjälp av ett mini-kit räcker inte för följande nukleofektionsexperiment. Midi eller maxi kit är mer lämpligt än mini-kit.
- Designa ett par sgRNA. För ablation av RB1, rikta in dig på den första exonen av denna gen. Den främre primersekvensen är CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, och den omvända primersekvensen är AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
- HESC-kultur och nukleofection.
OBS: Förvärm alla reagenser till RT.- Tina 1 x 106 H9-celler i en förbelagd 6-brunnsplatta med 10 μM Y-27632 (ROCK-hämmare) och 2 ml färskt ncEpic-hiPSC / hESC-odlingsmedium.
OBS: Täck 6-brunnsplattan med 1% tillväxtfaktor reducerad källarmembranmatris i minst 30 minuter vid 37 ° C före användning. - Nästa dag, ta bort supernatanten, skölj cellerna med 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) och tillsätt sedan 2 ml färskt ncEpic-hiPSC / hESC-odlingsmedium.
- Byt medium varje dag med 2 ml färskt ncEpic-hiPSC / hESC-odlingsmedium under de följande 3-5 dagarna tills cellerna växer till cirka 80% sammanflöde.
- Passera en eller två gånger för att justera hESC: s tillstånd.
OBS: Det enklaste sättet att identifiera hESC: s tillstånd är morfologin. - Odla de odifferentierade H9-cellerna i en 6-brunnsplatta tills de når 80% sammanflöde.
- Byt medium 2 h före nukleofektionen med 2 ml färskt ncEpic-hiPSC / hESC-odlingsmedium blandat med 10 μM Y-27632 och förbelägg en brunn av en 12-brunnsplatta med 1% tillväxtfaktorreducerad källarmembranmatris.
- Aspirera mediet och skölj med 1 ml förvärmd DPBS.
- Avlägsna DPBS och inkubera med 1 ml celldissociationsenzym (se materialtabell) i 3,5 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 1 ml färskt ncEpic-hiPSC / hESC-odlingsmedium till cellerna och pipettera två gånger för att göra H9-cellerna till en enda cellsuspension.
- Ta ut 100 μl av blandningen för cellräkning och överför återstoden till ett 15 ml centrifugrör som innehåller ytterligare 2 ml ncEpic-hiPSC/hESC-odlingsmedium inuti.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återsuspendera cirka 2 x 106 celler till en reaktionsvolym på 100 μl. Enligt tillverkarens protokoll, optimera volymen för cellerna, plasmiderna, nukleofektorn och reaktionsbetingelserna. Se materialförteckningen för det nukleofektionssystem som används i detta protokoll.
OBS: I allmänhet är bubblor inte tillåtna under nukleofektionen. - Efter transfektion, överför cellerna till den förbelagda 12-brunnsplattan, komplettera med 1,5 ml ncEpic-hiPSC / hESC-odlingsmedium och 10 μM Y-27632 och odla sedan cellerna i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
- Byt medium dagligen. Efter 48 timmar, tillsätt 2 μg/ml puromycin för cellval cirka en vecka.
OBS: Många celler dör under de första 3 dagarna. De återstående cellerna kan föröka sig och generera till kolonier under den följande veckan efter puromycinvalet. Under urvalsveckan, se till att mediet alltid innehåller 2 μg/ml puromycin. - Välj kolonierna manuellt under ett mikroskop.
OBS: Kolonimorfologin är densamma som hES-kolonin. Skär kolonierna i bitar (2-6 stycken per koloni) med en 10 μL vit/normal pipettspets i mediet och överför en koloni till en förbelagd brunn av en 12-brunnsplatta. - Identifiera först RB1-mutationerna och off-target-situationerna (tabell 1) och sedan pluripotens för att karakterisera RB1 knockout H9-cellinjen.
OBS: Upptäck RB1-mutationerna och off-target-situationerna med PCR- och Sanger-sekvensering. Identifiera pluripotensmarkörerna med RT-PCR och immunofluorescens.
- Tina 1 x 106 H9-celler i en förbelagd 6-brunnsplatta med 10 μM Y-27632 (ROCK-hämmare) och 2 ml färskt ncEpic-hiPSC / hESC-odlingsmedium.
2. Generering av humant retinoblastom
- Underhåll av RB1-KO hESC.
- Odla de genredigerade H9-cellerna i en tillväxtfaktor reducerad källarmembranmatrisbelagd 6-brunnsplatta med 2 ml ncEpic-hiPSC / hESC-odlingsmedium och byt medium varje dag.
- Passera med EDTA-buffert i 3,5 min vid 37 °C eller 5 min vid RT.
OBS: EDTA-buffert är blandningen av 1x DPBS, 5 mM EDTA och 0,9 mg / ml NaCl.
- Retinal cell differentiering.
OBS: Förbered medium I före differentieringen. För att förbereda medium I, blanda 24,5 ml Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) / näringsblandning F-12 (F12) -glutamin (1x), 24,5 ml neuronalt basalt medium, 250 μL 100x tillägg A, 500 μL 50x tillägg B, 0,1 mM ß-merkaptoetanol och 250 μL 100x L-glutamin. Förvärm alla blandningar till RT före användning.- Odla RB1-KO hESC till 80% sammanflöde i en brunn på en 6-brunnsplatta.
- Ta bort mediet och skölj cellerna med 1 ml 1x DPBS.
- Höj cellkolonierna med 1 ml dispasbuffert (se materialförteckningen) i 5 minuter vid 37 °C.
OBS: Kontrollera cellkolonierna under ett mikroskop. Vanligtvis tar det 5 minuter för koloniernas kant att rulla ut. - Aspirera dispasebufferten och skölj försiktigt cellerna en gång med 1 ml 1x DPBS.
- Tillsätt 1 ml medium I i brunnen.
- Skär kolonierna i bitar (6-9 stycken per koloni) med en 10 μL vit/normal pipettspets i mediet.
OBS: I allmänhet lossnar cirka 60% -70% av cellerna från brunnen. Använd en cellskrapa för att skrapa de återstående cellerna i mediet. - Skörda alla celler genom att centrifugera i ett 15 ml rör vid 200 x g i 5 min.
- Lämna cirka 50 μL av supernatanten för att sprida cellerna i mediet och blanda sedan cellerna med 250 μL tillväxtfaktorreducerad källarmembranmatris genom mild omrörning.
OBS: Håll tillväxtfaktorn reducerad källarmembranmatris antingen vid 4 ° C eller på isen före användning. Om den alikvoteras och förvaras vid -20 °C, placera den vid 4 °C över natten eller minst 1 timme före användning. - Förvara 15 ml röret med de suspenderade cellerna i en 37 °C inkubator i 20 minuter.
OBS: Se till att cellerna och tillväxtfaktorn reducerad källarmembranmatris bildar en stelnad gel. - Tillsätt 1 ml medium I i 15 ml röret och pipa sedan lätt den stelnade gelén två till tre gånger för att sprida klumpen med en 1 ml pipett.
- Tillsätt 9 ml medium I och överför cellsuspensionen till en 10 cm cellodlingsskål.
- Flytta skålen till en 37 °C inkubator med 5% CO2 och ställ in dagen som dag 0.
- Undersök cellerna med hjälp av ett mikroskop på dag 1.
OBS: Tusentals ihåliga cystor kunde observeras i skålen. I genomsnitt observeras 3 till 4 cyster i en bit gel. - Byt medium på dag 5. Samla supernatanten i ett 15 ml rör, vänta tills cystorna sätter sig i botten och ta sedan bort mediet och ersätt det med färskt medium I.
OBS: Om mediet blir gult på dag 4, byt medium på dag 4, annars på dag 5. Tillsätt 10 ml färskt medium I i originalrätten. Hundratals cystor har redan fästs på odlingsytan; Håll dem där. - Sprid cystorna i röret i två 10 cm rätter.
OBS: Se till att minst 300 cystor finns i en maträtt. Om cystorna inte är sammanflytande, separera inte cystorna i andra rätter; Sätt tillbaka dem till den ursprungliga 10 cm skålen. - På dag 7 fäster de flesta cystor (över 95%) i skålen, sprids ut och bildar vidhäftande kolonier.
OBS: Redan dag 3 kan de vidhäftande kolonierna observeras. - På dag 10, byt medium med färskt medium I. Se till att alla cystor är fästa vid skålen.
- Förbered Medium II före nästa steg genom att blanda följande: 36 ml DMEM, 12 ml F12, 2% tillägg B (v / v), 0,1 mM MEM icke-essentiell aminosyralösning (NEAA).
- Se till att cellerna är utspridda dag 13-17. Utför nästa steg på dag 15 när cellerna är utspridda men inte interagerar med de närliggande kolonierna.
- Skölj cellerna en gång med 1 ml DPBS och tillsätt 1 ml dispaslösning i 5 min vid 37 °C.
OBS: Inom 5 minuter höjs cellernas kant. - Ta bort dispasebufferten och skölj försiktigt kulturerna med 1 ml 1x DPBS.
- Tillsätt 10 ml medium II till varje 10 cm skål och odla i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- De vidhäftande kulturerna lossnar spontant efter 24 timmar och monteras i retinala organoider.
OBS: Många celler som inte bildar organoiderna skulle dö under de följande 2 dagarna. - Tre dagar efter lossning, samla cellerna från cellodlingsskålen och låt organoiderna sätta sig i ett 15 ml rör.
- Ta bort supernatanten från röret och överför organoiderna till en ny icke-vidhäftande skål (petriskål) med 10 ml Medium II under de följande fyra dagarna.
- Förbered medium III genom att blanda DMEM: F12 vid förhållandet 3: 1 (v / v), 2% tillägg B (v / v), 0,1 mM MEM icke-essentiell aminosyralösning (NEAA), 8% fosterbovint serum (FBS) (v / v), 100 μM taurin och 2 mM glutamin.
- En vecka efter lossningen, byt medium till medium III.
- Från och med denna dag, odla organoiderna i Medium III och uppdatera mediet två gånger i veckan.
- Etablering av RB-cellinje.
OBS: Alla reagenser förvärms vid RT.- På dag 90 omfattar RB: erna (80% -90%) retinala organoider. Välj därför 90-dagars RB-organoider för generering av RB-cellinjen.
- Förbered 1640-mediet genom att blanda Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640-mediet med 10% FBS.
- Skär RB i bitar (20-25 stycken per RB) med en mikrokirurgisk kniv under ett mikroskop i RPMI-1640-medium.
- Ta bort RPMI-1640-mediet och behandla bitarna med 0,25% Trypsin/EDTA i 10 min vid 37 °C.
- Tillsätt RPMI-1640-mediet för att avsluta reaktionen och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1640-medium i en icke-vidhäftande skål.
- RB-cellinjen är en flytande kultur. Byt medium två gånger i veckan och passera RB-cellerna inom 2 veckor.
OBS: Proliferationshastigheten för primära RB-celler är ganska långsam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förfarandet för RB-generering belyses i figur 1, som kombinerar den vidhäftande och flytande kulturen. Det var möjligt att skörda den mänskliga RB från RB1-KO hESC och erhålla RB-cellinjen genom att isolera RB-organoiderna.
Här ger protokollet detaljer om differentieringen i olika steg (figur 2). Ihåliga sfärer bildas under de första 3 dagarna som fäster vid odlingsytan och sedan expanderar (figur 2A-E). Från dag 15 och framåt är cellerna förhöjda och odlas i suspension (figur 2F). Dagen efter frigöringen bildas retinala organoider och de ljusa fälgarna är synliga (Figur 2G, svarta pilar). Dessutom kommer dessa celler utanför organoiderna sannolikt att dö under den följande veckan (figur 2G, orange pilar). På dag 27 är den optiska vesikelarkitekturen uppenbar och cirka 90% av organoiderna visar denna struktur (figur 2H); Organoiderna utan denna struktur kan kasseras. Den första upptäckten av RB sker på dag 45, och sedan blir den påtaglig på dag 50 (figur 2I). När den växer till dag 90 är de optiska vesikelstrukturerna huvudsakligen omslutna av RB (figur 2J). Under tiden kan RB isoleras som en RB-cellinje för vidare odling (figur 2K). Över 80% retinala organoider skulle vara helt omslutna av RB på dag 105 (Figur 2L). De visar starkt uttryck av Ki67 (spridningsmarkör) och SYK (onkogenmarkör) som jämförs med de H9-härledda retinala organoiderna, vilket indikerar tumorigenesen i RB-organoiderna (figur 2M,N). Dessutom visar det höga uttrycket av ARR3 (konprekursortillverkare) och CRX (fotoreceptorprekursormarkör) i RB-organoiderna att de härstammar från konprekursorceller (figur 2O,P).
Förfarandet för RB-generering genomgår huvudsakligen tre steg med morfologiförändringar före RB-bildningen; här ger studien de sämre och överlägsna resultaten i dessa skeden (figur 3). Differentierad och odifferentierad hESC (figur 3A,B) är lätt att skilja från morfologin, och den odifferentierade hESC väljs för RB-bildning. På dag 5 bör en ihålig sfär generera (figur 3D) snarare än den fasta (figur 3C). RB härrör från retinala organoider, som visar optisk vesikelarkitektur (figur 3F). Det finns ingen RB som skulle generera i de sämre organoiderna (figur 3E).
Figur 1: Schematisk vy av RB-organoiddifferentieringen. Dag 0-dag 15 är cellerna 2D-odling i medium I, och efter dag 15 är cellerna suspensionsodling. RB bildas runt dag 45. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: RB-generering och karakterisering. (A-C) Förfarandet i det tidiga skedet, hESC är förhöjt för att bilda cysterna. De svarta pilarna i (B) visar de rullade kanterna på hESC efter dispasebehandling. (D,E) Cystorna fäster vid plattorna (D) och expanderar sedan (E). (F) Vidhäftande celler är förhöjda för att bilda retinala organoider. Svarta pilar indikerar de rullade kanterna efter dispase behandling. (G,H) Tidiga dagar retinala organoider utan RB. (Jag, J) Retinala organoider med RB på dag 50 (I) och dag 90 (J), de gröna cirklarna bevisar RB-delarna. (K) Den isolerade RB-cellinjen från 90-dagars retinala organoider. (L) RB-organoiderna på dag 105. (M–P) Immunofluorescensbilderna för onkogenmarkörerna (M,N) och fotoreceptormarkörerna (O,P). I A-L är skalstänger = 200 μm; i M-P, skalstänger = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Jämförelse av negativa och positiva resultat. De sämre och överlägsna bilderna för differentiering på dag 0 (A,B), dag 5 (C,D) och dag 30 (E,F). Skalstänger = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Humant retinoblastom (RB) orsakas av inaktivering av RB1 och dysfunktion av Rb-protein. I detta protokoll är RB1-KO hESC det avgörande steget för generering av RB i en maträtt. Även med RB1-/- hESC är det möjligt att det inte finns någon RB-bildning på grund av metoderna för retinal organoiddifferentiering10. I detta protokoll är överföringen från vidhäftande kultur till flytande kultur avgörande i differentieringsprocessen. Tätheten av cystorna, typer av pluripotenta stamceller och spridningshastigheten är alla variabler som skulle påverka tidpunkten för avskiljning. Det är önskvärt att lossa cellerna när de expanderas men inte interageras av angränsande kolonier9. Om kolonierna gränsar till varandra skulle det leda till de sammanhängande retinala organoiderna och sedan minska differentieringseffektiviteten.
Genom att följa stegen kritiskt skulle det vara oroligt att skörda RB. Denna metod kunde dock bara modellera RB med den bialleliska inaktiveringen av RB1. För de ärvda RB-patienterna, som hade heterozygot RB1-mutation, kan den inte efterlikna processen för tumorigenes med den heterozygota RB1-mutationen 11. Ändå är det fortfarande en optimal RB-modell eftersom den för närvarande är närmast den faktiska RB-tumorigenesen hos patienter1. Den delar samma ursprung med primär RB 3,12 och övervinner artskillnaden mellan mössmodeller eller förenklad tvådimensionell miljö av odödliga cancercellinjer 3,12,13.
Den mänskliga RB är etablerad i en maträtt som härrör från mänsklig ESC med hjälp av den beskrivna metoden, och den uppvisar stor likhet med mänsklig primär RB. Därför skulle det ge en idealisk plattform för att belysa molekylär patologi för human RB och screening av farmakologiska medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna är inte medvetna om några anknytningar, medlemskap, finansiering eller finansiella innehav som kan påverka objektiviteten i denna studie.
Acknowledgments
Vi tackar 502-teamet för all hjälp. Detta arbete stöds delvis av Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) och National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
- Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
- Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E.
- Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
- Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
- Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
- Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
- Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
- Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).
