Summary
İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC) bialelik RB1 mutasyonlarını tanıtarak insan retinoblastomu (RB) üretmek için bir yöntem tanımladık. RB hücre hatları, bir tabakta izole RB kullanılarak başarılı bir şekilde kültürlenebilir.
Abstract
İnsan RB'si pediatrik kanserdir ve tedavi uygulanmazsa öldürücüdür. RB, kemirgen modellerinde nispeten nadir görülen koni öncüllerinden kaynaklandığından, insanlar ve kemirgenler arasındaki türler arası farklılıklarla ilgili olarak, insanlardan türetilen bir hastalık modeli, insan RB'sinin mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve tedavinin hedeflerini aramak için daha faydalıdır. Burada protokol, sırasıyla bialelik RB1 nokta mutasyonu (RB1 Mut / Mut) ve bir RB1 nakavt mutasyonu (RB1-/-) ile iki gen düzenlenmiş hESC hattının oluşumunu açıklamaktadır. Retina gelişimi sürecinde RB oluşumu gözlenir. RB hücre hatları ayrıca RB organoidlerinden ayrılarak da kurulur. Toplamda, gen düzenlenmiş hESC hatlarını retinal organoidlere 2D ve 3D kombine farklılaşma protokolü kullanarak farklılaştırarak, insan RB'sini bir tabakta başarıyla yeniden yapılandırdık ve koni-öncü kökenini belirledik. Retinoblastoma oluşumunu, proliferasyonunu ve büyümesini gözlemlemek ve yeni terapötik ajanların daha da geliştirilmesi için yararlı bir hastalık modeli sağlayacaktır.
Introduction
İnsan retinoblastomu (RB), retinal koni öncüllerinden 1,2,3 köken alan nadir görülen, ölümcül bir tümördür ve çocukluk çağında en sık görülen göz içi malignite tipidir 4. RB1 geninin homozigot inaktivasyonu, RB5'te başlatıcı genetik lezyondur. Bununla birlikte, RB1 mutasyonlarına sahip fareler retinal tümör2'yi oluşturamaz. Fare tümörleri Rb1 mutasyonlarının ve diğer genetik modifikasyonların kombinasyonu ile üretilebilse de, hala insan RB6'nın özelliklerinden yoksundurlar. Retinal organoid farklılaşmasının gelişmesi sayesinde, insan RB1'in karakterlerini gösteren hESC türevi RB elde edilebilir.
Son on yılda, retinal organoid farklılaşması için 2D7, 3D8 ve 2D ve 3D9'un bir kombinasyonu da dahil olmak üzere çok sayıda protokol oluşturulmuştur. Burada insan RB'sini üretmek için kullanılan yöntem, yapışkan kültürün ve yüzen kültürün konsolidasyonudur9. RB1 mutasyona uğramış hESC'yi retinal organoidlere ayırarak, RB oluşumu yaklaşık 45. günde tespit edilir ve daha sonra 60. günde hızla çoğalır. 90. günde, RB'lerin izolasyonu ve RB hücre hattının oluşturulması mümkündür; Ayrıca, RB 120. günde neredeyse tüm retinal organoidleri çevreler.
hESC kaynaklı RB, RB'nin kökenini, tümörigenezini ve tedavilerini araştırmak için yenilikçi bir modeldir. Bu protokolde, gen düzenleme hESC'nin üretimi, RB'nin farklılaşması ve RB için karakterizasyon ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Tongren Hastanesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. H9 hESC'ler WiCell Araştırma Enstitüsü'nden temin edilmektedir.
1. RB1 mutasyona uğramış hESC üretimi
- RB1'in nakavtı (KO) için CRISPR / Cas9 hedefleme vektörü.
- Bir çift sgRNA tasarlayın. RB1'in ablasyonu için, bu genin ilk ekzonunu hedefleyin. İleri astar dizisi CACCGCGTGGCGGCCGTTTTTCGG ve ters astar dizisi AAACCCGAAAAACGGCCGCCCCCCACCGC'dir.
NOT: Belirli RB1 mutasyonu için, onarılmış bir şablon da gereklidir. Bu protokolde örnek olarak RB1-KO hücre hattı kullanılmıştır. - Üreticinin talimatlarını izleyerek 1 μg pX330-U6-Kimerik BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro'yu BbsI kısıtlama enzimleri ile ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de 30 dakika boyunca sindirin.
- Sindirilmiş plazmidleri, üreticilerin talimatlarına göre bir saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın.
NOT: Enzimatik reaksiyonlar, saflaştırma kiti kullanılarak agaroz jeli olmadan doğrudan temizlenebilir (bkz. - T4 polinükleotid kinaz (PNK) (Malzeme Tablosu) kullanılarak her bir oligo çiftini fosforilat ve tavlama, 1 μL oligo1 (100 μM), 1 μL oligo2 (100 μM), 1 μL 10x T4 Ligasyon Tamponu, 6.5 μL ddH2O ve 0.5 μL T4 PNK'dan oluşan reaksiyonla.
NOT: Adım 1.1.1'deki ileri ve geri primerler bir çift oligodur. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir termosikler içindeki oligoları fosforile edin ve tavlayın: 30 dakika boyunca 37 ° C; 5 dakika boyunca 95 °C; dakikada 5 °C'de 25 °C'ye kadar rampa. - Oda sıcaklığında (RT) 199 μL nükleaz içermeyen suya 1 μL oligo reaktifi ekleyerek fosforile edilmiş ve tavlanmış oligoları 200 kez seyreltin.
- Ligasyon reaksiyonunu ayarlayın ve aşağıdakileri karıştırarak RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin: Adım 1.1.3'ten 50 ng Bbs1 sindirilmiş plazmid, adım 1.1.5'ten 1 μL oligo dubleks, 5 μL 2x ligasyon tamponu, 1 μL ligaz ve nükleaz içermeyen su kullanarak 10 μL'ye kadar doldurun.
- Ligasyon karışımını dönüştürün ve bir sonraki adım için pozitif kolonileri sıralayın.
NOT: Sıralama için U6 ileri veya geri astar kullanın.- Yetkin hücreleri buz üzerinde çözün.
- 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde yetkin hücrelerin 50 μL'sini alın.
- Ligasyon karışımının 1 μL'sini 1.1.6 adımından yetkin hücrelere ekleyin.
- Tüpü üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, hafifçe karıştırın.
NOT: Girdap yapmayın. - Karışımı 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
- Karışımı 42 °C'de 90 sn için ısıtın.
- Tüpe antibiyotiksiz 950 μL oda sıcaklığında Luria-Bertani (LB) suyu ekleyin.
- Tüpü 60 dakika boyunca 37 ° C'de 300 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- LB plakalarını (pepton, kazeinden pepton, sodyum klorür, agar-agar ve ampisilin) önceden 37 ° C'ye ısıtın.
- RT'deki plakalara 50-100 μL hücre ve ligasyon karışımı yayın.
- Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Plakadan 12 koloni alın ve bunları ampisilin ile LB ortamına aktarın. Ortamı 60 dakika boyunca 300 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- PCR için şablon olarak bakteri çözeltisinin 1 μL'sini (adım 1.1.7.12'den) kullanın ve pozitif kolonileri seçin.
- Pozitif kolonileri U6 primerleri ile sıralayın, bir sonraki adımda tasarlanan sgRNA dizileri ile koloniyi kullanın.
- Plazmidi bir midi kiti kullanarak çıkarın (bkz.
NOT: Mini kit kullanan plazmidin kalitesi ve miktarı, aşağıdaki nükleofeksiyon deneyi için yeterli değildir. Midi veya maxi kit, mini kitten daha uygundur.
- Bir çift sgRNA tasarlayın. RB1'in ablasyonu için, bu genin ilk ekzonunu hedefleyin. İleri astar dizisi CACCGCGTGGCGGCCGTTTTTCGG ve ters astar dizisi AAACCCGAAAAACGGCCGCCCCCCACCGC'dir.
- HESC kültürü ve nükleofeksiyonu.
NOT: Tüm reaktifleri RT'ye önceden ısıtın.- 1 x 10 6 H9 hücrelerini, 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitörü) ve 2 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı içeren önceden kaplanmış6 delikli bir plakaya çözün.
NOT: 6 delikli plakayı, kullanımdan önce 37 °C'de en az 30 dakika boyunca %1 Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi ile kaplayın. - Ertesi gün, süpernatanı çıkarın, hücreleri 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) ile durulayın ve ardından 2 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ekleyin.
- Hücreler yaklaşık% 80 akıcılığa ulaşana kadar takip eden 3-5 gün içinde ortamı 2 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ile her gün değiştirin.
- hESC'nin durumunu ayarlamak için bir veya iki kez geçiş.
NOT: hESC'nin durumunu tanımlamanın en kolay yolu morfolojidir. - Farklılaşmamış H9 hücrelerini% 80 akıcılığa ulaşana kadar 6 delikli bir plakada kültürleyin.
- 10 μM Y-27632 ile karıştırılmış 2 mL taze ncEpic-hiPSC/hESC kültür ortamı ile nükleofeksiyondan 2 saat önce ortamı değiştirin ve% 1 Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi kullanarak 12 delikli bir plakanın bir kuyuğunu önleyin.
- Ortamı aspire edin ve 1 mL önceden ısıtılmış DPBS ile durulayın.
- DPBS'yi çıkarın ve 37 ° C'de 3,5 dakika boyunca 1 mL hücre ayrışma enzimi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
- H9 hücrelerini tek hücreli bir süspansiyon haline getirmek için hücrelere 1 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ve pipet iki kez ekleyin.
- Hücre sayımı için karışımın 100 μL'sini çıkarın ve kalanını içinde 2 mL ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve yaklaşık 2 x 106 hücreyi 100 μL reaksiyon hacmine geri sarkıtın. Üreticinin protokolüne göre, hücreler, plazmidler, nükleofektör ve reaksiyon koşulları için hacmi optimize edin. Bu protokolde kullanılan nükleofeksiyon sistemi için Malzeme Tablosuna bakınız.
NOT: Genel olarak, nükleofeksiyon sırasında kabarcıklara izin verilmez. - Transfeksiyondan sonra, hücreleri önceden kaplanmış 12 delikli plakaya aktarın, 1.5 mL ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ve 10 μM Y-27632 ile takviye edin ve daha sonra hücreleri 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde kültürleyin.
- Ortamı günlük olarak değiştirin. 48 saat sonra, bir hafta civarında hücre seçimi için 2 μg / mL puromisin ekleyin.
NOT: İlk 3 gün boyunca çok sayıda hücre ölür. Kalan hücreler çoğalabilir ve puromisin seçiminden sonraki hafta içinde koloniler halinde üretebilir. Seçim haftasında, ortamın her zaman 2 μg / mL puromisin içerdiğinden emin olun. - Kolonileri mikroskop altında manuel olarak seçin.
NOT: Koloni morfolojisi hES kolonisi ile aynıdır. Kolonileri, ortamda 10 μL beyaz / normal pipet ucu ile parçalara ayırın (koloni başına 2-6 adet) ve bir koloniyi 12 delikli bir plakanın önceden kaplanmış bir kuyucuğuna aktarın. - İlk olarak, RB1 mutasyonlarını ve hedef dışı durumları tanımlayın (Tablo 1) ve ardından RB1 nakavt H9 hücre hattını karakterize etmek için pluripotensi.
NOT: PCR ve sanger dizilimini kullanarak RB1 mutasyonlarını ve hedef dışı durumları tespit edin. RT-PCR ve İmmünofloresan ile pluripotens belirteçlerini tanımlayın.
- 1 x 10 6 H9 hücrelerini, 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitörü) ve 2 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı içeren önceden kaplanmış6 delikli bir plakaya çözün.
2. İnsan retinoblastomunun oluşumu
- RB1-KO hESC'nin bakımı.
- Kültür gen-düzenlenmiş H9 hücreleri bir Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matris kaplı 6 delikli plaka ile 2 mL ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ve her gün ortamı değiştirin.
- EDTA tamponunu kullanarak 37 °C'de 3,5 dakika veya RT'de 5 dakika boyunca geçiş.
NOT: EDTA tamponu, 1x DPBS, 5 mM EDTA ve 0.9 mg / mL NaCl karışımıdır.
- Retinal hücre farklılaşması.
NOT: Farklılaştırmadan önce Medium I'i hazırlayın. Orta I'i hazırlamak için, 24.5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) / Besin Karışımı F-12 (F12)-Glutamin (1x), 24.5 mL Nöronal bazal ortam, 250 μL 100x takviyesi A, 500 μL 50x takviyesi B, 0.1 mM ß-merkaptoetanol ve 250 μL 100x L-glutamin karışımı. Kullanmadan önce tüm karışımları RT'ye önceden ısıtın.- RB1-KO hESC'yi 6 delikli plakanın bir kuyucuğunda %80 birleşime kadar büyütün.
- Ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mL 1x DPBS ile durulayın.
- Hücre kolonilerini 1 mL dispase tamponu kullanarak ( bakınız Malzeme Tablosu) 37 °C'de 5 dakika boyunca yükseltin.
NOT: Hücre kolonilerini mikroskop altında kontrol edin. Genellikle, kolonilerin kenarının ortaya çıkması 5 dakika sürer. - Dispase tamponunu aspire edin ve hücreleri 1 mL 1x DPBS ile bir kez nazikçe durulayın.
- Kuyuya 1 mL Orta I ekleyin.
- Kolonileri, ortada 10 μL beyaz/normal pipet ucu ile parçalara ayırın (koloni başına 6-9 adet).
NOT: Genel olarak, hücrelerin yaklaşık% 60-70'i kuyudan ayrılır. Ortamdaki kalan hücreleri kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın. - Tüm hücreleri, 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 mL'lik bir tüpte santrifüj yaparak toplayın.
- Ortamdaki hücreleri dağıtmak için süpernatantın yaklaşık 50 μL'sini bırakın ve daha sonra hücreleri 250 μL Büyüme faktörü ile karıştırın ve nazik ajitasyonla azaltılmış bazal membran matrisini karıştırın.
NOT: Kullanmadan önce Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisini 4 °C'de veya buz üzerinde tutun. Aliquoted edilir ve -20 ° C'de saklanırsa, kullanımdan önce gece boyunca veya en az 1 saat önce 4 ° C'ye yerleştirin. - Asılı hücrelerle birlikte 15 mL'lik tüpü 20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde tutun.
NOT: Hücrelerin ve Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisinin katılaşmış bir jel oluşturduğundan emin olun. - 15 mL tüpe 1 mL Orta I ekleyin ve ardından kümeyi 1 mL'lik bir pipetle dağıtmak için katılaşmış jeli iki ila üç kez hafifçe pipetin.
- 9 mL Orta I ekleyin ve hücre süspansiyonunu 10 cm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın.
- Çanağı% 5 CO2 ile 37 ° C'lik bir inkübatöre taşıyın ve günü 0. gün olarak ayarlayın.
- 1. günde mikroskop kullanarak hücreleri inceleyin.
NOT: Çanakta binlerce içi boş kist görülebilir. Ortalama olarak, bir parça jelde 3 ila 4 kist gözlenir. - 5. günde ortamı değiştirin. Süpernatantı 15 mL'lik bir tüpe toplayın, kistlerin dibe çökmesini bekleyin ve ardından ortamı çıkarın ve taze Orta I ile değiştirin.
NOT: Ortam 4. günde sararırsa, ortamı 4. günde, aksi takdirde 5. günde değiştirin. Orijinal yemeğe 10 mL taze Orta I ekleyin. Yüzlerce kist zaten kültür yüzeyine bağlanmıştır; onları orada tutun. - Tüpteki kistleri iki adet 10 cm'lik kaba dağıtın.
NOT: Bir tabakta en az 300 kist olduğundan emin olun. Kistler birleşmiş değilse, kistleri diğer bulaşıklara ayırmayın; onları orijinal 10 cm'lik tabağa geri getirin. - 7. günde, çoğu kist (% 95'in üzerinde) yemeğe bağlanır, yayılır ve yapışkan koloniler oluşturur.
NOT: 3. gün gibi erken bir tarihte, yapışkan koloniler gözlemlenebilir. - 10. günde, ortamı taze Orta I ile değiştirin.
- Aşağıdakileri karıştırarak bir sonraki adımdan önce Medium II'yi hazırlayın: 36 mL DMEM, 12 mL F12, takviye B'nin% 2'si (v / v), 0.1 mM MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (NEAA).
- Hücrelerin 13-17. güne kadar yayıldığından emin olun. Hücrelerin yayıldığı ancak komşu kolonilerle etkileşime girmediği 15. günde bir sonraki adımı uygulayın.
- Hücreleri 1 mL DPBS ile bir kez durulayın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca 1 mL dispase çözeltisi ekleyin.
NOT: 5 dakika içinde hücrelerin kenarı yükselir. - Dispase tamponunu çıkarın ve kültürleri 1 mL 1x DPBS ile nazikçe durulayın.
- Her 10 cm'lik çanağa ve kültüre 37 °C, %5 CO2 inkübatörde 10 mL Orta II ekleyin.
- Yapışkan kültürler 24 saat sonra kendiliğinden ayrılır ve retinal organoidlere birleşir.
NOT: Organoidleri oluşturmayan çok sayıda hücre takip eden 2 gün içinde ölecektir. - Ayrılmadan üç gün sonra, hücreleri hücre kültürü kabından toplayın ve organoidlerin 15 mL'lik bir tüpe yerleşmesine izin verin.
- Süpernatantı tüpten çıkarın ve organoidleri takip eden dört gün boyunca 10 mL Orta II ile yeni bir yapışkan olmayan kaba (Petri kabı) aktarın.
- DMEM'yi karıştırarak Orta III'ü hazırlayın: F12'yi 3: 1 oranında (v / v), % 2 takviye B (v / v), 0.1 mM MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (NEAA), % 8 Fetal Sığır Serumu (FBS) (v / v), 100 μM Taurin ve 2 mM Glutamin.
- Ayrılmadan bir hafta sonra, ortamı Orta III olarak değiştirin.
- Bu günden itibaren, organoidleri Orta III'te kültürleyin ve haftada iki kez ortamı yenileyin.
- RB hücre hattının kurulması.
NOT: Tüm reaktifler RT'de önceden ısıtılır.- 90. günde, RB'ler (%80-%90) retinal organoidleri kapsar. Bu nedenle, RB hücre hattının oluşturulması için 90 günlük RB organoidlerini seçin.
- Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 ortamını %10 FBS ile karıştırarak 1640 ortamını hazırlayın.
- RB'yi RPMI-1640 ortamında mikroskop altında mikrocerrahi bir bıçakla parçalara ayırın (RB başına 20-25 adet).
- RPMI-1640 ortamını çıkarın ve parçaları 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.25 Tripsin / EDTA ile tedavi edin.
- Reaksiyonu sonlandırmak için RPMI-1640 ortamını ekleyin ve 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı çıkarın ve hücreleri 1640 ortamında yapışkan olmayan bir kapta yeniden askıya alın.
- RB hücre hattı yüzen bir kültürdür. Ortamı haftada iki kez değiştirin ve RB hücrelerini 2 hafta içinde geçirin.
NOT: Primer RB hücrelerinin proliferasyon hızı oldukça yavaştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RB üretiminin prosedürü, yapışkan ve yüzen kültürü birleştiren Şekil 1'de açıklanmıştır. İnsan RB'sini RB1-KO hESC'den toplamak ve RB organoidlerini izole ederek RB hücre hattını elde etmek mümkündü.
Burada, protokol farklı aşamalardaki farklılaşmanın ayrıntılarını sağlar (Şekil 2). İlk 3 gün içinde kültür yüzeyine yapışan ve daha sonra genişleyen içi boş küreler oluşur (Şekil 2A-E). 15. günden itibaren, hücreler yükselir ve kültür süspansiyondadır (Şekil 2F). Ayrılmadan sonraki gün, retinal organoidler oluşur ve parlak jantlar görünür (Şekil 2G, siyah oklar). Dahası, organoidlerin dışındaki hücrelerin bir sonraki hafta içinde ölmesi muhtemeldir (Şekil 2G, turuncu oklar). 27. günde, optik vezikül mimarisi belirgindir ve organoidlerin yaklaşık% 90'ı bu yapıyı gösterir (Şekil 2H); bu yapıya sahip olmayan organoidler atılabilir. RB'nin ilk tespiti 45. günde gerçekleşir ve daha sonra 50. günde elle tutulur hale gelir (Şekil 2I). 90. güne kadar büyüdüğünde, optik vezikül yapıları esas olarak RB tarafından kaplanır (Şekil 2J). Bu arada, RB daha fazla kültür için bir RB hücre hattı olarak izole edilebilir (Şekil 2K). % 80'in üzerinde retinal organoidler, 105. günde RB tarafından tamamen sarılmış olacaktır (Şekil 2L). RB organoidlerindeki tümörigenezi gösteren H9 türevi retinal organoidlerle karşılaştırıldığında Ki67 (proliferasyon belirteci) ve SYK (onkogen belirteci) ekspresyonunu yüksek oranda gösterirler (Şekil 2M, N). Ek olarak, RB organoidlerinde ARR3 (koni öncü yapıcı) ve CRX'in (fotoreseptör öncü belirteci) yüksek ekspresyonu, koni öncü hücrelerinden kaynaklandıklarını göstermektedir (Şekil 2O, P).
RB üretimi prosedürü esas olarak RB oluşumundan önce morfoloji değişiklikleri ile üç aşamadan geçer; burada çalışma bu aşamalarda alt ve üstün sonuçlar vermektedir (Şekil 3). Diferansiye ve farklılaşmamış hESC'nin (Şekil 3A,B) morfolojiden ayırt edilmesi kolaydır ve RB oluşumu için farklılaşmamış hESC seçilir. 5. günde, katı küre yerine içi boş bir küre (Şekil 3D) üretmelidir (Şekil 3C). RB, optik vezikül mimarisini gösteren retinal organoidlerden türetilmiştir (Şekil 3F). İnferior organoidlerde oluşacak RB yoktur (Şekil 3E).
Şekil 1: RB organoidlerinin farklılaşmasının şematik görünümü. 0. gün 15. gün, hücreler orta I'de 2D kültürdür ve 15. günden sonra hücreler süspansiyon kültürüdür. RB yaklaşık 45. günde oluşur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: RB jenerasyonu ve karakterizasyonu. (A-C) Erken evredeki prosedürde, hESC kistleri oluşturacak şekilde yükseltilir. (B) içindeki siyah oklar, dispase işleminden sonra hESC'nin yuvarlanmış kenarlarını gösterir. (D,E) Kistler plakalara (D) bağlanır ve sonra genişler (E). (F) Yapışkan hücreler retinal organoidleri oluşturmak için yükseltilir. Siyah oklar, dispase işleminden sonra yuvarlanmış kenarları gösterir. (G,H) RB'siz retinal organoidlerin erken günleri. (I, J) RB'li retinal organoidler 50. gün (I) ve 90. gün (J), yeşil daireler RB kısımlarını kanıtlar. (K) 90 günlük retinal organoidlerden izole RB hücre hattı. (L) RB organoidleri 105. günde. (M-P) Onkogen belirteçleri (M,N) ve fotoreseptör belirteçleri (O,P) için immünofloresan görüntüler. A-L'de, ölçek çubukları = 200 μm; M-P'de, ölçek çubukları = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Olumsuz ve olumlu sonuçların karşılaştırılması. 0. gün (A,B), gün 5 (C,D) ve gün 30'da (E,F) farklılaşma için aşağı ve üstün görüntüler. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsan retinoblastomu (RB), RB1'in inaktivasyonu ve Rb proteininin işlev bozukluğundan kaynaklanır. Bu protokolde, RB1-KO hESC, bir tabakta RB üretimi için çok önemli bir adımdır. RB1-/- hESC ile bile, retinal organoid farklılaşma10 yöntemlerine bağlı olarak RB oluşumunun olmaması mümkündür. Bu protokolde, yapışkan kültürden yüzen kültüre geçiş, farklılaşma sürecinde esastır. Kistlerin yoğunluğu, pluripotent kök hücre tipleri ve proliferasyon hızı, dekolmanı zamanlamasını etkileyecek değişkenlerdir. Hücrelerin genişlediği ancak komşu koloniler tarafından etkileşime girmediği zaman ayrılması arzu edilir9. Koloniler bitişik ise, bitişik retinal organoidlere yol açacak ve daha sonra farklılaşma verimliliğini azaltacaktır.
Adımları eleştirel bir şekilde izleyerek, RB'yi hasat etmek zahmetsiz olacaktır. Bununla birlikte, bu yöntem RB'yi yalnızca RB1'in bialelik inaktivasyonu ile modelleyebilir. Heterozigot RB1 mutasyonu barındıran kalıtsal RB hastaları için, heterozigot RB1 mutasyonu 11 ile tümörigenez sürecini taklit edemez. Bununla birlikte, hala optimal bir RB modelidir, çünkü şu anda hasta1'de gerçek RB tümörigenezine en yakın olanıdır. Birincil RB3,12 ile aynı kökeni paylaşır ve fare modellerinin tür farkının veya ölümsüzleştirilmiş kanser hücresi hatlarının basitleştirilmiş iki boyutlu ortamının 3,12,13'ünün üstesinden gelir.
İnsan RB'si, tarif edilen yöntem kullanılarak insan ESC'sinden türetilen bir çanakta kurulur ve insan birincil RB'sine büyük benzerlik gösterir. Bu nedenle, insan RB'sinin moleküler patolojisini aydınlatmak ve farmakolojik ajanların taranması için ideal bir platform sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu çalışmanın tarafsızlığını etkileyebilecek herhangi bir bağlantı, üyelik, finansman veya finansal holdingin farkında değildir.
Acknowledgments
Tüm yardımları için 502 ekibine teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Pekin Belediyesi Doğa Bilimleri Vakfı (Z200014) ve Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2017YFA0105300) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
- Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
- Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E.
- Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
- Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
- Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
- Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
- Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
- Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).
