Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Rekonstruere humant retinoblastom in vitro

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/62629
Automatic Translation
1, 1
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

Summary

Vi beskriver en metode for å generere humant retinoblastom (RB) ved å introdusere bialleliske RB1-mutasjoner i humane embryonale stamceller (hESC). RB-cellelinjer kan også vellykket dyrkes ved hjelp av den isolerte RB i en tallerken.

Abstract

Human RB er pediatrisk kreft, som er dødelig hvis ingen behandling administreres. Siden RB stammer fra kjegleforløpere, som er relativt sjelden i gnagermodeller, er en sykdomsmodell avledet fra mennesker mer gunstig for å avdekke mekanismene til menneskelig RB og søke målene for terapi. Her beskriver protokollen genereringen av to genredigerte hESC-linjer med henholdsvis en biallelisk RB1-punktmutasjon (RB1 Mut/Mut) og en RB1-knockoutmutasjon (RB1-/-). Under prosessen med retinal utvikling observeres dannelsen av RB. RB-cellelinjene etableres også ved å segregere fra RB-organoidene. Til sammen, ved å differensiere de genredigerte hESC-linjene i retinale organoider ved hjelp av en 2D- og 3D-kombinert differensieringsprotokoll, har vi vellykket rekonstruert den menneskelige RB i en tallerken og identifisert dens kjegleforløperopprinnelse. Det ville gi en nyttig sykdomsmodell for å observere retinoblastomgenes, spredning og vekst, samt videreutvikle nye terapeutiske midler.

Introduction

Humant retinoblastom (RB) er en sjelden, dødelig svulst avledet fra retinal kjegleforløperne 1,2,3, er den vanligste typen intraokulær malignitet i barndommen4. Homozygot inaktivering av RB1-genet er den initierende genetiske lesjonen i RB5. Imidlertid klarer ikke mus med RB1-mutasjoner å danne retinaltumoren2. Selv om musetumorene kan genereres med kombinasjonen av Rb1-mutasjoner og andre genetiske modifikasjoner, mangler de fortsatt egenskapene til menneskelig RB6. Takket være utviklingen av retinal organoiddifferensiering, kunne den hESC-avledede RB oppnås, og vise tegnene til menneskelig RB1.

Tallrike protokoller for retinal organoiddifferensiering har blitt etablert i det siste tiåret, inkludert 2D7, 3D8 og en kombinasjon av 2D og 3D9. Metoden som brukes her for å generere den menneskelige RB er konsolideringen av tilhengerkultur og flytende kultur9. Ved å differensiere RB1 mutert hESC i retinale organoider, oppdages dannelsen av RB rundt dag 45, og deretter sprer den seg raskt på rundt dag 60. På dag 90 er isolering av RBer og generering av RB-cellelinjen mulig; Videre omgir RB nesten alle retinale organoider på dag 120.

hESC-avledet RB er en innovativ modell for å utforske opprinnelse, tumorigenese og behandlinger for RB. I denne protokollen er genereringen av genredigering hESC, differensiering av RB og karakterisering for RB beskrevet i detalj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien er godkjent av den institusjonelle etiske komiteen i Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESCs er hentet fra WiCell Research Institute.

1. Generering av RB1 mutert hESC

  1. CRISPR/Cas9 målvektor for knockout (KO) av RB1.
    1. Design et par sgRNA. For ablasjon av RB1, målrette den første ekson av dette genet. Den fremre primersekvensen er CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, og den omvendte primersekvensen er AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
      MERK: For den spesifikke RB1-mutasjonen er det også nødvendig med en reparert mal. I denne protokollen brukes RB1-KO cellelinje som et eksempel.
    2. Fordøye 1 μg pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro med BbsI-restriksjonsenzymer (se materialtabell) i 30 minutter ved 37 °C ved å følge produsentens instruksjoner.
    3. Rens de fordøyede plasmidene ved hjelp av et rensesett i henhold til produsentens instruksjoner.
      MERK: Enzymatiske reaksjoner kan rengjøres direkte uten agarosegel ved hjelp av rensesettet (se materialtabell).
    4. Fosforylat og glød hvert par oligoer ved bruk av T4 polynukleotidkinase (PNK) (Materialtabell) med reaksjonen som består av 1 μL oligo1 (100 μM), 1 μL oligo2 (100 μM), 1 μL av 10x T4 Ligation Buffer, 6,5 μL av ddH2O, og 0,5 μL av T4 PNK.
      MERK: De fremre og omvendte primerne i trinn 1.1.1 er et par oligoer. Fosforylat og glød oligoene i en termocykler ved bruk av følgende parametere: 37 ° C i 30 minutter; 95 °C i 5 minutter; rampe ned til 25 °C ved 5 °C per minutt.
    5. Fortynn fosforylerte og glødede oligoer 200 ganger ved å tilsette 1 μL oligoreagens til 199 μL nukleasefritt vann ved romtemperatur (RT).
    6. Sett opp ligasjonsreaksjonen og inkuber ved RT i 10 minutter ved å blande følgende: 50 ng Bbs1 fordøyd plasmid fra trinn 1.1.3, 1 μL oligo dupleks fra trinn 1.1.5, 5 μL 2x ligeringsbuffer, 1 μL ligase og fyll opp til 10 μL ved bruk av nukleasefritt vann.
    7. Transformer ligeringsblandingen og sekvenser de positive koloniene for neste trinn.
      MERK: Bruk U6 fremover eller bakover primer for sekvensering.
      1. Tine de kompetente cellene på is.
      2. Ta 50 μL av de kompetente cellene i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
      3. Tilsett 1 μL av ligeringsblandingen fra trinn 1.1.6 inn i de kompetente cellene.
      4. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned røret tre ganger.
        MERK: Ikke vortex.
      5. Legg blandingen på is i 30 minutter.
      6. Varmesjokk blandingen ved 42 °C i 90 s.
      7. Tilsett 950 μL romtemperatur Luria-Bertani (LB) kjøttkraft uten antibiotika til røret.
      8. Plasser røret i en shaker ved 300 o / min ved 37 ° C i 60 minutter.
      9. Varm LB-platene (pepton, pepton fra kasein, natriumklorid, agar-agar og ampicillin) til 37 °C på forhånd.
      10. Spred 50-100 μL av cellene og ligeringsblandingen på platene ved RT.
      11. Inkuber platene over natten ved 37 °C.
      12. Plukk opp 12 kolonier fra platen og overfør dem til LB-mediet med ampicillin. Plasser mediet på en shaker ved 300 o / min i 60 minutter.
      13. Bruk 1 μL av bakterieoppløsningen (fra trinn 1.1.7.12) som mal for PCR og velg de positive koloniene.
      14. Sekvenser de positive koloniene av U6-primerne, bruk kolonien med de designede sgRNA-sekvensene i neste trinn.
    8. Trekk ut plasmidet ved hjelp av et midi-sett (se Tabell over materialer).
      MERK: Kvaliteten og mengden av plasmidet ved hjelp av et minisett er ikke nok for følgende nukleofeksjonseksperiment. Midi- eller maxi-settet er mer egnet enn minisettet.
  2. HESC-kultur og nukleofeksjon.
    MERK: Forvarm alle reagensene til RT.
    1. Tine 1 x 10 6 H9-celler i en forhåndsbelagt 6-brønnsplate med 10 μM Y-27632 (ROCK-hemmer) og 2 ml friskt ncEpic-hiPSC/hESC-kulturmedium.
      MERK: Beleg 6-brønnsplaten med 1% Vekstfaktor reduserte kjellermembranmatrisen i minst 30 minutter ved 37 °C før bruk.
    2. Neste dag, fjern supernatanten, skyll cellene med 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS), og tilsett deretter 2 ml friskt ncEpic-hiPSC / hESC kulturmedium.
    3. Bytt medium hver dag med 2 ml friskt ncEpic-hiPSC/hESC kulturmedium i de følgende 3-5 dagene til cellene vokser til rundt 80% sammenløp.
    4. Passasje en eller to ganger for å justere tilstanden til hESC.
      MERK: Den enkleste måten å identifisere tilstanden til hESC er morfologien.
    5. Dyrk de udifferensierte H9-cellene i en 6-brønns plate til de når 80% sammenløp.
    6. Bytt medium 2 timer før nukleofeksjonen med 2 ml fersk ncEpic-hiPSC / hESC kulturmedium blandet med 10 μM Y-27632 og forbelegg en brønn av en 12-brønns plate ved bruk av 1% Vekstfaktor redusert kjellermembranmatrise.
    7. Aspirer mediet og skyll med 1 ml forvarmet DPBS.
    8. Fjern DPBS og inkuber med 1 ml celledissosiasjonsenzym (se materialtabell) i 3,5 minutter ved 37 °C.
    9. Tilsett 1 ml friskt ncEpic-hiPSC/hESC-kulturmedium til cellene og pipetten to ganger for å gjøre H9-cellene til en enkeltcellesuspensjon.
    10. Ta ut 100 μL av blandingen for celletelling og overfør de resterende til et 15 ml sentrifugerrør som inneholder ytterligere 2 ml ncEpic-hiPSC / hESC kulturmedium inni.
    11. Sentrifuge ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend rundt 2 x 106 celler i et 100 μL reaksjonsvolum. I henhold til produsentens protokoll optimaliserer du volumet for cellene, plasmidene, nukleofektoren og reaksjonsforholdene. Se tabell over materialer for nukleofeksjonssystemet som brukes i denne protokollen.
      MERK: Generelt er bobler ikke tillatt under nukleofeksjonen.
    12. Etter transfeksjon, overfør cellene til den forhåndsbelagte 12-brønnsplaten, supplere med 1,5 ml ncEpic-hiPSC / hESC-kulturmedium og 10 μM av Y-27632, og dyrk deretter cellene i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
    13. Bytt medium daglig. Etter 48 timer, tilsett 2 μg / ml puromycin for cellevalg rundt en uke.
      MERK: Mange celler dør i løpet av de første 3 dagene. De resterende cellene kan proliferere og generere til kolonier i den følgende uken etter puromycinvalget. I utvelgelsesuken må du sørge for at mediet alltid inneholder 2 μg / ml puromycin.
    14. Plukk koloniene manuelt under et mikroskop.
      MERK: Kolonimorfologien er den samme som hES-kolonien. Skjær koloniene i biter (2-6 stykker per koloni) med en 10 μL hvit/normal pipettespiss i mediet og overfør en koloni til en forhåndsbelagt brønn på en 12-brønns plate.
    15. Identifiser først RB1-mutasjonene og off-target-situasjonene (tabell 1), og deretter pluripotens for å karakterisere RB1 knockout H9-cellelinjen.
      MERK: Oppdag RB1-mutasjonene og off-target-situasjonene ved hjelp av PCR- og sanger-sekvensering. Identifiser pluripotensmarkørene ved RT-PCR og immunfluorescens.

2. Generering av humant retinoblastom

  1. Vedlikehold av RB1-KO hESC.
    1. Kultur de genredigerte H9-cellene i en vekstfaktor reduserte kjellermembranmatrise belagt 6-brønns plate med 2 ml ncEpic-hiPSC / hESC kulturmedium og bytte medium hver dag.
    2. Passasje med EDTA-buffer i 3,5 minutter ved 37 °C eller 5 min ved RT.
      MERK: EDTA-buffer er blandingen av 1x DPBS, 5 mM EDTA og 0,9 mg / ml NaCl.
  2. Retinal celledifferensiering.
    MERK: Forbered Medium I før differensieringen. For å tilberede Medium I, bland 24,5 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F-12(F12)-Glutamin (1x), 24,5 ml Neuronal basal medium, 250 μL av 100x supplement A, 500 μL av 50x supplement B, 0,1 mM ß-merkaptoetanol og 250 μL av 100x L-glutamin. Forvarm alle blandingene til RT før bruk.
    1. Dyrk RB1-KO hESC til 80% sammenløp i en brønn på en 6-brønns plate.
    2. Fjern mediet og skyll cellene med 1 ml 1x DPBS.
    3. Løft cellekoloniene ved å bruke 1 ml dispasebuffer (se materialtabell) i 5 minutter ved 37 °C.
      MERK: Kontroller cellekoloniene under et mikroskop. Vanligvis tar det 5 min før kanten av koloniene ruller ut.
    4. Aspirer dispasebufferen og skyll cellene forsiktig en gang med 1 ml 1x DPBS.
    5. Tilsett 1 ml Medium I i brønnen.
    6. Skjær koloniene i biter (6-9 stykker per koloni) med en 10 μL hvit/normal pipettespiss i mediet.
      MERK: Vanligvis løsner rundt 60% -70% av cellene fra brønnen. Bruk en celleskraper til å skrape de gjenværende cellene i mediet.
    7. Høst alle cellene ved sentrifugering i et 15 ml rør ved 200 x g i 5 minutter.
    8. La rundt 50 μL av supernatanten dispergere cellene i mediet, og bland deretter cellene med 250 μL vekstfaktor redusert kjellermembranmatrise ved mild agitasjon.
      MERK: Hold vekstfaktoren redusert kjellermembranmatrise enten ved 4 °C eller på isen før bruk. Hvis den aliquoted og oppbevares ved -20 °C, skal den plasseres ved 4 °C over natten eller minst 1 time før bruk.
    9. Hold 15 ml røret med de suspenderte cellene i en 37 ° C inkubator i 20 minutter.
      MERK: Sørg for at cellene og vekstfaktoren redusert kjellermembranmatrise danner en størknet gel.
    10. Tilsett 1 ml medium I i 15 ml røret, og pipet deretter den størknede gelen to til tre ganger for å spre klumpen med en 1 ml pipette.
    11. Tilsett 9 ml medium I og overfør cellesuspensjonen til en 10 cm cellekulturskål.
    12. Flytt retten til en 37 °C inkubator med 5 % CO2 og sett dagen som dag 0.
    13. Undersøk cellene ved hjelp av et mikroskop på dag 1.
      MERK: Tusenvis av hule cyster kunne observeres i parabolen. I gjennomsnitt observeres 3 til 4 cyster i ett stykke gel.
    14. Bytt medium på dag 5. Samle supernatanten i et 15 ml rør, vent til cystene legger seg til bunnen, og fjern deretter mediet og erstatt det med friskt medium I.
      MERK: Hvis mediet blir gult på dag 4, bytt medium på dag 4, ellers på dag 5. Tilsett 10 ml fersk Medium I i originalretten. Hundrevis av cyster har allerede festet seg til kulturoverflaten; holde dem der.
    15. Spred cystene i røret i to 10 cm retter.
      MERK: Pass på at minst 300 cyster er i en tallerken. Hvis cystene ikke er sammenflytende, må du ikke skille cystene i andre retter; returner dem til den originale 10 cm parabolen.
    16. På dag 7 fester de fleste cyster (over 95%) seg til parabolen, sprer seg ut og danner tilhørende kolonier.
      MERK: Så tidlig som dag 3 kan de tilhørende koloniene observeres.
    17. På dag 10, bytt medium med fersk Medium I. Sørg for at alle cyster er festet til parabolen.
    18. Forbered Medium II før neste trinn ved å blande følgende: 36 ml DMEM, 12 ml F12, 2% supplement B (v / v), 0,1 mM MEM ikke-essensiell aminosyreløsning (NEAA).
    19. Sørg for at cellene er spredt ut innen dag 13-17. Utfør neste trinn på dag 15 når cellene er spredt ut, men ikke interagerer med nabokoloniene.
    20. Skyll cellene én gang med 1 ml DPBS og tilsett 1 ml dispaseoppløsning i 5 minutter ved 37 °C.
      MERK: Innen 5 minutter heves kanten av cellene.
    21. Fjern dispasebufferen og skyll forsiktig kulturene med 1 ml 1x DPBS.
    22. Tilsett 10 ml Medium II til hver 10 cm tallerken og kultur i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
    23. Tilhengerkulturene løsner spontant etter 24 timer og samles i retinale organoider.
      MERK: Mange celler som ikke danner organoider ville dø i de følgende 2 dagene.
    24. Tre dager etter løsrivelse, samle cellene fra cellekulturskålen og la organoidene bosette seg i et 15 ml rør.
    25. Fjern supernatanten fra røret og overfør organoidene til en ny ikke-klebende (petriskål) med 10 ml Medium II i de følgende fire dagene.
    26. Forbered Medium III ved å blande DMEM: F12 ved 3: 1-forhold (v / v), 2% supplement B (v / v), 0,1 mM MEM ikke-essensiell aminosyreoppløsning (NEAA), 8% føtalt bovint serum (FBS) (v / v), 100 μM taurin og 2 mM glutamin.
    27. En uke etter løsningen, bytt medium til Medium III.
    28. Fra denne dagen og fremover, kultur organoider i Medium III og oppdater mediet to ganger i uken.
  3. Etablering av RB-cellelinje.
    MERK: Alle reagensene er forvarmet ved RT.
    1. På dag 90 omfatter RBs (80% -90%) retinal organoider. Velg derfor 90-dagers RB-organoider for generering av RB-cellelinjen.
    2. Forbered 1640-mediet ved å blande Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium med 10% FBS.
    3. Skjær RB i stykker (20-25 stykker per RB) med en mikrokirurgisk kniv under et mikroskop i RPMI-1640 medium.
    4. Fjern RPMI-1640-mediet og behandle bitene med 0,25% trypsin/EDTA i 10 minutter ved 37 °C.
    5. Tilsett RPMI-1640-mediet for å avslutte reaksjonen og sentrifugen ved 200 x g i 5 minutter.
    6. Fjern supernatanten og resuspend cellene i 1640 medium i en ikke-klebende tallerken.
    7. RB-cellelinjen er en flytende kultur. Bytt medium to ganger i uken og passasje RB-cellene innen 2 uker.
      MERK: Spredningshastigheten til primære RB-celler er ganske langsom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Prosedyren for RB-generering er belyst i figur 1, som kombinerer tilhenger og flytende kultur. Det var mulig å høste den menneskelige RB fra RB1-KO hESC, og oppnå RB-cellelinjen ved å isolere RB-organoider.

Her gir protokollen detaljer om differensieringen i ulike stadier (figur 2). Hule kuler dannes i løpet av de første 3 dagene som festes til kulturoverflaten og deretter utvides (figur 2A-E). Fra dag 15 og utover er cellene forhøyet og dyrker i suspensjon (figur 2F). Dagen etter løsningen dannes retinale organoider, og de lyse felgene er synlige (figur 2G, svarte piler). Videre vil disse cellene utenfor organoidene sannsynligvis dø i den følgende uken (figur 2G, oransje piler). På dag 27 er den optiske vesikkelarkitekturen tydelig, og rundt 90% av organoider viser denne strukturen (figur 2H); organoidene uten denne strukturen kunne kastes. Den første påvisningen av RB skjer på dag 45, og deretter blir den følbar på dag 50 (figur 2I). Når den vokser til dag 90, er de optiske vesikkelstrukturene hovedsakelig omsluttet av RB (figur 2J). I mellomtiden kan RB isoleres som en RB-cellelinje for videre kultur (figur 2K). Over 80% retinale organoider ville være fullt innhyllet av RB på dag 105 (figur 2L). De viser sterkt uttrykk for Ki67 (proliferasjonsmarkør) og SYK (onkogenmarkør) sammenlignet med H9-avledede retinale organoider, noe som indikerer tumorigenese i RB-organoider (figur 2M, N). I tillegg viser det høye uttrykket av ARR3 (kjegleforløper) og CRX (fotoreseptorforløpermarkør) i RB-organoider at de stammer fra kjegleforløperceller (figur 2O, P).

Prosedyren for RB-generering gjennomgår hovedsakelig tre stadier med morfologiendringer før RB-formasjonen; her gir studien de dårligere og overlegne resultatene på disse stadiene (figur 3). Differensiert og udifferensiert hESC (figur 3A,B) er lett å skille fra morfologien, og den udifferensierte hESC er valgt for RB-dannelse. På dag 5 skal en hul kule generere (figur 3D) i stedet for den faste (figur 3C). RB er avledet fra retinale organoider, som viser optisk vesikkelarkitektur (figur 3F). Det er ingen RB som vil generere i de dårligere organoider (figur 3E).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over RB-organoiddifferensieringen. Dag 0-dag 15, cellene er 2D-kultur i medium I, og etter dag 15 er cellene suspensjonskultur. RB dannes rundt dag 45. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: RB-generering og karakterisering. (A-C) Prosedyren for tidlig stadium, hESC er forhøyet for å danne cyster. De svarte pilene i (B) viser de rullede kantene av hESC etter dispasebehandling. (D,E) Cystene festes til platene (D) og utvides deretter (E). (F) Tilstøtende celler er forhøyet for å danne retinale organoider. Svarte piler indikerer de rullede kantene etter dispasebehandling. (G,H) Tidlige dager retinale organoider uten RB. (I, J) Retinale organoider med RB på dag 50 (I) og dag 90 (J), de grønne sirklene beviser RB-delene. (K) Den isolerte RB-cellelinjen fra 90-dagers retinale organoider. (L) RB-organoidene på dag 105. (M-P) Immunfluorescensbildene for onkogene markører (M,N) og fotoreseptormarkører (O,P). I A-L, skala barer = 200 μm; i M-P, skala barer = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av negative og positive resultater. De dårligere og overlegne bildene for differensiering på dag 0 (A, B), dag 5 (C, D) og dag 30 (E, F). Skala barer = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Humant retinoblastom (RB) er forårsaket av inaktivering av RB1 og dysfunksjon av Rb-protein. I denne protokollen er RB1-KO hESC det sentrale trinnet for generering av RB i en tallerken. Mens selv med RB1-/- hESC, er det mulig at det ikke er noen RB-dannelse på grunn av metodene for retinal organoiddifferensiering10. I denne protokollen er overføringen fra tilhengerkultur til flytende kultur viktig i differensieringsprosessen. Tettheten av cyster, typer pluripotente stamceller og spredningshastigheten er alle variablene som vil påvirke tidspunktet for løsrivelse. Det er ønskelig å løsne cellene når de utvides, men ikke samhandles av nabokolonier9. Hvis koloniene er tilstøtende, vil det føre til sammenhengende retinale organoider og deretter redusere differensieringseffektiviteten.

Ved å følge trinnene kritisk, ville det være ubekymret å høste RB. Imidlertid kunne denne metoden bare modellere RB med den bialleliske inaktiveringen av RB1. For de arvelige RB-pasientene, som hadde heterozygot RB1-mutasjon, er det ikke i stand til å etterligne prosessen med tumorigenese med den heterozygote RB1-mutasjonen 11. Likevel er det fortsatt en optimal RB-modell fordi den for tiden er nærmest den faktiske RB-tumorigenesen hos pasienter1. Den deler samme opprinnelse med primær RB 3,12 og overvinner artsforskjellen til musemodeller eller forenklet todimensjonalt miljø av udødelige kreftcellelinjer 3,12,13.

Den menneskelige RB er etablert i en tallerken avledet fra menneskelig ESC ved hjelp av den beskrevne metoden, og den viser stor likhet med menneskets primære RB. Derfor vil det gi en ideell plattform for å belyse molekylærpatologien til human RB og screening av farmakologiske midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne er ikke klar over noen tilknytninger, medlemskap, finansiering eller økonomiske beholdninger som kan påvirke objektiviteten til denne studien.

Acknowledgments

Vi takker 502-teamet for all hjelp. Dette arbeidet støttes delvis av Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) og National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Anti-ARR3 Sigma HPA063129 Antibody
Anti-CRX (M02) Abnove ABN-H00001406-M02 Antibody
Anti-Ki67 Abcam  ab15580 Antibody
Anti-Syk (D3Z1E) Cell Signaling Technology 13198 Antibody
BbsI NEB R3539S Restriction enzymes
Dispase (1U/mL) Stemcell Technologies 7923
DMEM basic Gibco 10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX Gibco 10565-042
DMSO Sigma D2650
DPBS Gibco C141905005BT
EDTA Thermo 15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells Biological Industry 04-002-1A
Glutamine Gibco 35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) Gibco 11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) Sigma M7145
Neurobasal Medium Gibco 21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S Lonza V4XP-3032 Nucleofection kit
Pen Strep Gibco 15140-122
Puromycin Gene Operation ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium Nuwacell RP01001 ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix BD 356231 Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme Gibco 12563-011 TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit QIAGEN 75144
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74104
Supplement A Life Technologies 17502-048 N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B Life Technologies 17105-041 B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase Life Technologies EK0032
Taurine Sigma T-8691-25G
Y-27632 2HCl Selleck S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro Addgene 42230
Nucleofector 4D Lonza
RPMI Sigma R0883-500ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  2. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
  3. Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
  4. Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. The biology of retinoblastoma. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).
  5. Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
  6. Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
  7. Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
  8. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  9. Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
  10. Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
  11. Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
  12. Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
  13. Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).

Tags

Kreftforskning utgave 188
Rekonstruere humant retinoblastom in vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct… More

Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct Human Retinoblastoma In Vitro. J. Vis. Exp. (188), e62629, doi:10.3791/62629 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter