Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لزرع القنية المباشرة في ماجنا cisterna من الخنازير.
Abstract
النظام الجليميفي هو نظام لإزالة النفايات في الدماغ يعتمد على تدفق السائل النخاعي (CSF) في المساحات المحيطة بفترة ما حول الأوعية الدموية المرتبطة بالخلايا الفلكية وقد تورط في إزالة الببتيدات العصبية السمية مثل أميلويد بيتا. يؤدي ضعف وظيفة الجلمفاتيك إلى تفاقم أمراض الأمراض في النماذج الحيوانية للأمراض العصبية التنكسية ، مثل مرض الزهايمر ، مما يسلط الضوء على أهمية فهم نظام التخليص هذا. غالبا ما تتم دراسة النظام الجليمافي بواسطة عبوات cisterna magna (CMc) ، حيث يتم تسليم التتبع مباشرة إلى السائل النخاعي (CSF). ومع ذلك، فقد أجريت معظم الدراسات على القوارض. هنا، ونحن نظهر التكيف من تقنية CMc في الخنازير. باستخدام CMc في الخنازير ، يمكن دراسة النظام الجليمفي بدقة بصرية عالية في الأدمغة الجيرنسيفالية ، وبذلك يسد الفجوة المعرفية بين القوارض والجاذبية البشرية.
Introduction
السائل النخاعي (CSF) هو نسبة فائقة من الدم موجود داخل وحول الجهاز العصبي المركزي (CNS)1,2. وبصرف النظر عن إعطاء الطفو للدماغ أو امتصاص القوى الميكانيكية الضارة، CSF يلعب أيضا دورا محوريا في إزالة النفايات الأيضية من CNS3. يتم تسهيل إزالة النفايات من خلال نظام الجليمافتا الذي تم توصيفه مؤخرا والذي يسمح بالتدفق الحراري ل CSF عبر بارنشيما الدماغ عبر المساحات المحيطة بوعية الدموية (PVS) ، والتي تطوق الشرايين المخترقة3،4،5. وقد تبين أن هذه العملية تعتمد على aquaporin-4 (AQP4)، وهي قناة مائية يتم التعبير عنها في المقام الأول على النهاية الفلكية، المرتبطة ب PVS4,6. وتتحقق دراسة النظام الجليمفاتيكي من خلال التصوير الحي والجسم الحي السابق، باستخدام المجهر الضوئي المتقدم أو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، بعد إدخال متتبع فلوري/مشع أو عامل تباين في CSF7,8,9,10,11.
وهناك طريقة فعالة لإدخال التتبع في CSF دون تكبد أضرار في الدماغ parenchyma هو من خلال cisterna ماجنا cannulation (CMc)12,13. وقد أجريت أغلبية كبيرة من جميع الدراسات الجليمفية، حتى الآن في القوارض وتجنبها في الثدييات العليا بسبب الغازية من CMc إلى جانب البساطة العملية للعمل مع الثدييات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الجماجم الرقيقة للفئران بالتصوير الحي دون الحاجة إلى نافذة الجمجمة وتسمح لاحقا باستخراج الدماغ غير المعقد1114. وقد أسفرت التجارب التي أجريت على البشر عن تنظير كبير قيم في بيانات الجسم الحي على وظيفة الجليمافيتيك، ولكنها اعتمدت على حقن التتبع داخل اللثة في العمود الفقري القطني البعيدة، وعلاوة على ذلك، الاستفادة من التصوير بالرنين المغناطيسي الذي لا يسفر عن دقة كافية لالتقاط استئصال الدقيقة النظام الجليمافي7،15،16 . فهم الهندسة المعمارية ومدى النظام الجلمفي في الثدييات العليا أمر ضروري لترجمته إلى البشر. من أجل تسهيل الترجمة الجليمفاتيكية للبشر ، من المهم تطبيق التقنيات التي يتم تنفيذها في القوارض على الثدييات العليا من أجل السماح بإجراء مقارنات مباشرة للنظام الجليمفي عبر أنواع من الإدراك المتزايد وتعقيد الدماغ17. الخنازير والأدمغة البشرية هي جيرونسيفال، وامتلاك neuroarchitecture مطوية، في حين أن أدمغة القوارض هي lissencephalic، وبالتالي وجود فرق كبير بين بعضها البعض. من حيث الحجم الإجمالي ، فإن أدمغة الخنازير هي أيضا أكثر قابلية للمقارنة مع البشر ، كونها أصغر 10-15 مرة من الدماغ البشري ، في حين أن أدمغة الفئران أصغر 3000 مرة18. من خلال فهم أفضل للنظام الجليمفاتيكي في الثدييات الكبيرة ، قد يكون من الممكن استخدام نظام الجليمفاتيك البشري للتدخل العلاجي في المستقبل في ظروف مثل السكتة الدماغية وإصابات الدماغ الرضية والتنكس العصبي. CMc المباشر في الخنازير في الجسم الحي هو الأسلوب الذي يسمح للفحص المجهري الخفيف عالي الدقة للنظام الجلمفي في الثدييات العليا. وعلاوة على ذلك، ونظرا لحجم الخنازير المستخدمة، فمن الممكن تطبيق أنظمة رصد مماثلة لتلك المستخدمة في العمليات الجراحية البشرية مما يجعل من الممكن لتوثيق وتنظيم الوظائف الحيوية بإحكام من أجل تقييم كيفية مساهمة هذه في وظيفة الجليمفاتيك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للتوجيه الأوروبي 2010/63/EU ووافقت عليها لجنة مالمو لوند الأخلاقية لأبحاث الحيوان (Dnr 5.8.18-05527/2019) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية ل CODEX لمجلس البحوث السويدي.
1. إعداد
- الراسم
- إعداد CSF الاصطناعي (126 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM NaH2PO4، 2 mM MgCl2، 2 mM CaCl2، 10 mM الجلوكوز، 26 mM NaHCO3؛ pH 7.4)
- إلى 500 ميكرولتر من CSF الاصطناعية، إضافة 10 ملغ من الألبومين من مصل البقر (BSA) المقترنة مع اليكسا فلور 647 (BSA-647).
- الطرد المركزي في 5000 x ز لمدة 5 دقائق واستخدام supernatant.
- قنيه
- إرفاق حقنة 1 مل إلى اتصال لوير الإناث من خط الوريد (IV)، 3 طرق الصنبور مع تمديد 10 سم.
- إرفاق إبرة 18 G إلى نهاية الذكور.
- افتح قفل التوقف الثلاثي للسماح بالاستمرارية من الإبرة إلى الحقنة.
- فك تسخين الإبرة بعناية و يستنشق ما يقرب من 300 ميكرولتر من المالحة في خط IV.
- إزالة الإبرة من المالحة والمضي قدما لإدخال في بعض الهواء لخلق فقاعة الهواء الصغيرة (5-10 ملم) في خط IV.
- ضع الإبرة في التتبع واسبر جميع 500 ميكرولتر من التتبع. يجب فصل المالحة في خط IV بشكل واضح بواسطة فقاعة الهواء.
- تجاهل الإبرة وإغلاق قفل وقف 3-الاتجاه.
- تخدير خنزير عن طريق الحقن العضلي (i.m.) من البلاط (3.75 ملغم /كجم) والزولازيبام (3.75 ملغم/كجم) وديكسيميدوميدين (37.5 ميكروغرام/كجم). انتظر حتى يصبح فاقد الوعي
- إعداد خط وريدي عن طريق إدخال قنية 20 غرام في وريد الأذن.
ملاحظة: تأكد من أن القنية في الوريد عن طريق حقن 5-10 مل من المالحة من خلال القنية. إذا غاب الوريد، وهذا سيكون ملحوظا من قبل وذمة صغيرة في أنسجة الأذن. - Intubate الخنزير لضمان أن معدل التنفس يمكن تنظيمها طوال فترة الجراحة.
ملاحظة: تأكد من نجاح التنبيب عن طريق الضغط على الصدر الخنزير وتأكد من أن الهواء منتهية الصلاحية بالقوة يخرج من أنبوب التنبيب. - قم بتوصيل أنبوب التنبيب بجهاز التنفس الصناعي المحدد بمعدل التنفس 14 نفسا / دقيقة.
- قم بتوصيل مقياس أكسدة النبض والأصفاد بالذيل لمراقبة معدل ضربات القلب (HR) وضغط الدم (BP) وتشبع الأكسجين (sats). أدخل ميزان حرارة المستقيم لمراقبة درجة الحرارة الأساسية.
- إعداد كيس IV من الكيتامين (5 ملغم / كجم / دقيقة) ، ميدازولام (0.25 ملغ / كجم / دقيقة) ، والفنتانيل (2.5 ميكروغرام / كجم / دقيقة) ، في المالحة والبدء في غرس من خلال الوريد الأذن في ما يقرب من 2 قطرات / ثانية.
ملاحظة: طوال الجراحة، قد يحتاج معدل التسريب إلى زيادة أو انخفاض بناء على حيوية الحيوان. - مع الخنزير في موقف عرضة، بالبات الجزء الخلفي من الرأس والرقبة من الحيوان لتحديد موقع ووضع علامة على قمة القذالي والعمود الفقري للفقرات الصدرية الأولى وقاعدة كل أذن.
- رسم خط مستقيم بين قمة والفقرات على طول المحور الطولي. رسم خطين من قمة إلى قاعدة كل أذن باتباع قاعدة الجمجمة (الشكل 1A).
- تأكد من أن الحيوان في نوم عميق عن طريق لقط الذيل بعناية ومشاهدة عدم وجود رد فعل الذيل.
ملاحظة: إذا كان الحيوان لا يزال انعكاسيا ، فيجب زيادة معدل التسريب المخدر تدريجيا حتى لا يظهر الحيوان رد فعل.
2. الجراحة
ملاحظة: من خلال الجراحة، من الضروري أن يكون لديك مساعد واحد على الأقل لشفط النزيف الخفيف وكيا أي أوعية مقطوعة.
- باستخدام مشرط مع شفرة # 21، وجعل شق الجلد على طول الخط الطولي وصولا الى العضلات.
- تمديد اثنين من الشقوق الجلدية عمودي كذلك على طول الكتفين، 10-15 سم في الطول.
- من القمم القذالية، قم بعمل شقوق جلدية على طول الخط وصولا إلى قاعدة كل أذن.
- تجتاح زوايا الجلد التي تشكلت في قمة القذالي مع ملقط التشريحية، وفصل بعناية الجلد من العضلات الكامنة عن طريق تشغيل طفيفة شفرة مشرط على اللفافة، والانتقال من rostral إلى caudal. بمجرد أن يتم استئصال الجلد بعد كل من الشقوق الخمسة ، يجب أن تكون أجزاء من عضلات الترابيزيوس مرئية.
- إجراء شق طولي مع مشرط، ما يقرب من 1 سم عميق، حيث ال trapezius يأتي معا في خط الوسط.
ملاحظة: عند قطع من خلال العضلات، وهناك ميل متزايد للنزيف، لذلك يجب أن يكون جاهزا الكي. إذا تم قطع وعاء أكبر ، يجب على شخص واحد ضغطه بسرعة بالشاش ، في حين يستخدم الشخص الآخر الكي. - باستخدام مزيج من ملقط الجراحية المستقيمة والمنحنية، إجراء تشريح حاد العمل على طول قطع طولية في العضلات. وهذا سيفصل بين البطون من trapezius، فضلا عن العضلات الكامنة شبهpinalis capitus biventer.
- قطع أي ألياف العضلات المستمرة مع مشرط ومواصلة تشريح حادة حتى يصبح شبهpinalis capitus complexus مرئية.
- قطع أصول trapezius وشبهpinalis كابيتوس biventer العضلات على طول الجانب الخلفي من الجمجمة. فصل بعناية لهم طوليا مع مشرط إجراء تشريح حاد حتى مجمع الكابيتوس semispinalis مرئيا تماما.
- تراجع عن trapezius وشبهpinalis كابيتوس biventer العضلات باستخدام الاحتفاظ الذاتي التراجع.
- حيث البطون من مجمع الكابيتوس semispinalis معا في خط الوسط، وجعل شق طولي مع مشرط ما يقرب من 1 سم عميق.
ملاحظة: كن على علم بأي نزيف إضافي هنا. يمكن إدارة النزيف باستخدام مزيج من مسحات القطن والكي. - باستخدام ملقط الجراحية، وإجراء تشريح حاد العمل على طول قطع طولية بين البطون العضلات حتى الجانب الظهري من أطلس (CI) واضح.
- قطع أصول العضلات شبهpinalis capitus complexus على طول الجانب الخلفي من الجمجمة وفصلها طوليا من الفقرات الكامنة عن طريق المشرط وتشريح حادة.
- تراجع عن عضلات شبهpinalis capitus complexus باستخدام مجموعة أخرى من الحفارات ذاتية الاحتفاظ.
- باستخدام مشرط، وإزالة بعناية أي الأنسجة المتبقية فوق المنطقة حيث يلتقي أطلس قاعدة الجمجمة.
- وضع ذراع واحدة تحت عنق الحيوان وإصبع واحد عند منعطف الأطلس والجمجمة ، ورفع الرأس في وقت واحد وثني الرقبة أثناء الخفقان بإصبع للكشف عن ماجنا السيسترنا باستخدام اليد الأخرى.
ملاحظة: يمكن التعرف على ماجنا cisterna عند الخفقان كبنية مرنة قوية مع كمية صغيرة من الارتداد كما يتم تحرير الضغط مع الإصبع.
3. القنينة والحقن
ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة أيضا شخصين على الأقل ويتم تنفيذها مع ارتفاع رأس الحيوان وثني الرقبة.
- تأكد من أن شخصا واحدا يرفع وينثني رأس وعنق الحيوان في حين أن الخفقان الآخر للشهامة cisterna جعل مذكرة من موقعه التشريحي.
- ببطء وبعناية إدخال قنية 22 G من خلال دورا وإلى ماجنا cisterna في زاوية مائلة إلى المحور الطولي.
ملاحظة: لا تقم بإدخال القنية عميقة جدا، لأن هذا يمكن أن يسبب تلفا في الدماغ. معرفة إلى أي مدى لإدراج القنية يأتي مع الخبرة في فهم كيف يشعر للقنية لاختراق دورا. أساسا، تماما كما تم ثقب دورا، القنية ثم عميقة بما يكفي لحقن التتبع ناجحة. هذا العمق هو ما يقرب من 3-5 ملم ولكن سوف تختلف على أساس حجم أو عمر الحيوان. وينبغي أن يكون التشجير الناجح واضحا على الفور من خلال تصور CSF النابض الواضح الذي يصعد القنية. للحصول على أفضل النتائج, فمن المستحسن لممارسة العديد من cannulations مسبقا في الحيوانات القتل الرحيم للحصول على فهم المرء من ثقب الجافية. - سحب الإبرة من القنية ووضع غطاء على القفل.
- أولا، تطبيق superglue ومسرع حيث تدخل القنية الأنسجة، تليها تطبيق الاسمنت الأسنان. انتظر لمدة 5 دقائق حتى يصلب الإسمنت.
- إزالة الغطاء بعناية من القنية وإرفاق نهاية الذكور من الصنبور خط الرابع المعدة سابقا مع تمديد 10 سم، مع التتبع، إلى القنية.
- حقن التتبع ببطء باليد أو باستخدام مضخة ضخ صغيرة بمعدل 100 ميكرولتر / دقيقة. قم بإزالة الصنبور الخط الرابع ثلاثي الطرق مع تمديد 10 سم واستبداله بالغطاء. يجب أن يكون التتبع الآن نابضا مرئيا عند قاعدة القنية (فيديو تكميلي 1).
ملاحظة: إذا حقن باليد، القيام بذلك حتى التتبع هو فقط لا تزال مرئية في رمح القنية، ما يقرب من 1-2 مم أعلاه حيث يغطي الاسمنت الأسنان رمح. - بعد الحقن، ضع أكياس الرمل تحت الرقبة للحفاظ على بعض الإنثناء. ثم يمكن إطلاق الرأس ، ويترك الحيوان في وضع عرضة للراحة.
- الإفراج عن الحفارات الذاتي الاحتفاظ ووضع العضلات لأنها تكمن من قبل. جمع الجلد معا على العضلات باستخدام المشابك منشفة الجراحية.
- تغطية المشابك منشفة وشق مع الشاش ثم بطانية للحد من فقدان الحرارة.
- السماح للمتتبع بالانتشار في الوقت المطلوب قبل القتل الرحيم للحيوان عن طريق أي v. حقن بنتوباربيتال (140 ملغم/كغ). تأكيد القتل الرحيم من خلال عدم وجود أصوات القلب على auscultation مع سماعة الطبيب.
4. استخراج الدماغ وتجهيزه
- باستخدام مشرط مع 20 شفرة، وتوسيع شق الجلد الطولي من قمة القذالي إلى ما يقرب من 7 سم فوق الأنف.
- تعكس الجلد overlying الجانب الظهري للجمجمة باستخدام مشرط.
ملاحظة: هناك عدة طرق لقطع وإزالة الجانب الظهري من جمجمة الخنزير على أساس كل على حدة. ما يلي هو الإجراء الذي نجح في معظم الأحيان لهذه التجربة. - باستخدام منشار مدمج محمول باليد ، قم بقطع تاجي في الجمجمة ، على بعد 3 سم تقريبا فوق الوريدين الكبيرين اللذين شوهدا يخرجان من الجمجمة. تمتد إلى اثنين من التخفيضات العمودية أخرى من التخفيضات التاجية واثنين من تخفيضات أخرى لتحقيق التخفيضات العمودية معا في خط الوسط.
ملاحظة: الحفاظ على قبضة قوية من المنشار عند إجراء تخفيضات العظام الجمجمة لأنها سوف تميل إلى سحب بعيدا عند أول اتصال مع العظام أو الأنسجة، والتي يمكن أن تؤدي إلى إصابة شديدة. - تأكد من أن قطع الجمجمة هي من خلال سمك كامل من العظام عن طريق متابعة مع مطرقة وإزميل ضيق (10 ملم) إلى كل من التخفيضات.
- باستخدام المطرقة، وأخيرا ضرب إزميل واسعة (25-30 ملم) في قطع التاجية. مع شخص واحد دعم الرأس، وضمان أن الشخص الآخر ينطبق النفوذ على إزميل لwince فتح الجمجمة الظهرية.
- بمجرد إزالة جزء الجمجمة الظهرية ، تشريح ماطر دورا المفرط باستخدام مقص جراحي منحني.
- استخدام ملعقة لتشد الحبل الشوكي من المخيخ في الجانب rostral. ثم المضي قدما لتوجيه ملعقة تحت الدماغ من الجبهة، وقطع المصابيح الشمية، الغدة النخامية، والأعصاب الجمجمة.
- ضع ملعقة خلف المخيخ وتطبيق كمية لا بأس بها من الضغط لطرد الدماغ من تجويف الجمجمة، ورفع بعناية بها مرة واحدة فضفاضة.
- إصلاح الدماغ كله على الفور عن طريق الانغماس في الأنسجة 4٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة، من الممكن إجراء تصوير الدماغ بأكمله باستخدام مجسم (الشكل 1E). - في اليوم التالي، وجعل شرائح تاجية من الدماغ باستخدام سكين السلمون وإصلاح شرائح بين عشية وضحاها عن طريق الانغماس في الأنسجة 4٪ paraformaldehyde.
- وأخيرا، ضع الشرائح في 0.01٪ azide في برنامج تلفزيوني للتخزين على المدى الطويل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بمجرد أن يفقد الخنزير وعيه ، يتم ملامسته ، ويتم وضع علامة على تشريح سطحه ، بدءا من قمة القذالي (OC) والعمل نحو الفقرات الصدرية (التلفزيون) وكل قاعدة أذن (EB). وعلى هذا المنوال يتم إجراء الشقوق الجلدية (الشكل 1A). يتم إعادة استئصال طبقات العضلات الثلاث بما في ذلك trapezius ، semispinalis capitus biventer وشبهpinalis capitus complexus وعقد مفتوحة من قبل مجموعتين من المتراجعين الاحتفاظ الذاتي لفضح ماجنا cisterna (CM) (الشكل 1B). ثم يتم عرض الرأس لفتح المسافة بين الجزء الخلفي من الجمجمة والأطلس وتسهيل الوصول إلى CM (الشكل 1C). يتم إدخال قنية 18 G بعناية 3-5 مم في CM وثابتة في مكانها من قبل كل من الغراء السوبر وأسمنت الأسنان (DC). ويمكن بعد ذلك حقن التتبع بسعر ثابت. وبمجرد حقن المتتبع، يتم استبدال الخط الرابع والمحاقن بغطاء قنية (الشكل 1C-D). ثم يتم وضع العضلات مرة أخرى في المكان ويتم تغطية الخنزير وأبقى دافئا للمرة التي يتم فيها تعميم التتبع. بعد الدورة الدموية ، يتم قتل الحيوان ، ويتم إزالة الدماغ بسرعة. من الممكن توليد صور مجهرية مخيطة للسطح الظهري للدماغ ، والتي تسهل في تقديم رؤى مفصلة في أنماط توزيع التتبع على سطح الدماغ الظهري عبر الكبريت والشقوق (الشكل 1E). ويمكن توليد صور مماثلة من السطوح البطنية والأطرافية للدماغ حيث يمكن التحقيق في توزيع التتبع في الفص الصدغي (TL) والشقوق الجانبية (LF) (الشكل 1E). ويمكن استخدام مجسمة بالإضافة إلى ذلك لإنتاج صور التكبير أعلى من سطح الدماغ حيث أنه من الممكن أن نرى التتبع في PVS على طول الشرايين (الشكل 1F-G). يتم قطع أقسام الدماغ التاجية العيانية ، التي يبلغ سمكها حوالي 8 مم ، باستخدام سكين السلمون وتوفر المزيد من البصيرة في عمق اختراق التتبع في الشق بين نصف الكرة الأرضية (IHS) ، وكذلك توزيع التتبع تحت القشري في هياكل مثل قرن آمون (HPC) والمرحلة (STR) ، (الشكل 1H).
تلطيخ المناعي الكيميائية ل AQP4 أعرب في endfeet الفلكية، والبروتين الحمضي الرجفان الدبقية (GFAP) أعرب في جميع أنحاء الخلايا الفلكية والعضلات الملساء actin (SMA) تقع حول الشرايين أظهرت أن التتبع المترجمة على حد سواء داخل PVS وينتقل إلى بارينشيما الدماغ (الشكل 1I-M). AQP4 وGFAP تلطيخ تستخدم لتحديد الخلايا الفلكية وبشكل أكثر تحديدا، وعمليات القدم الفلكية التي تشكل السطح الخارجي للPVS في حين lectin وGLU-1 وصمة عار الخلايا البطانية التي تشكل السطح الداخلي للPVS (الشكل 1I-L). من خلال تنفيذ هذه البقع لتحديد حدود PVS ، من الممكن بعد ذلك تحديد التتبع الذي تحقنه CSF المترجم إلى الفضاء PVS. وهذا يدعم فكرة أن CSF يحصل على الوصول إلى الدماغ الجيرنسيفالي عن طريق النقل PVS واسعة النطاق التي تسهل بعد ذلك تدفق الجليمافية إلى بارنشيما الدماغ. يحدد تلطيخ SMA الشرايين والشرايين عن طريق الربط لخلايا العضلات الملساء الموجودة في جدران الشرايين ويمكن استخدامها لإظهار أن تدفق PVS يحدث على طول الشرايين بدلا من الأوردة ، مما يشكل فسيولوجيا أساسية للوظيفة الجليمفاتيكية العادية (الشكل 1M).
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 Cisterna ماجنا cannulation في الخنازير. (أ) الخنزير تستعد قبل بدء الجراحة ووضع علامة حيث سيتم إجراء شقوق جلدية بدءا من قمة القذالي (OC) ثم الخلفي إلى الفقرات الصدرية (التلفزيون) وال الجانبية لكل قاعدة الأذن (EB). (ب) رئيس في موقف استرخاء مع trapezius، semispinalis كابيتوس biventer وشبهpinalis العضلات capitus المعقدة تراجع، وبالتالي فضح ماجنا cisterna (CM). (ج) استعرض الرأس يدويا لزيادة الوصول إلى CM للتمكن والحقن. (د) صورة عن قرب من قنية إدراجها في CM بعد الحقن وثابتة في مكان مع الاسمنت الأسنان (DC). (ه) الظهر، البطني، وأسطح الدماغ الجانبية، على التوالي، بعد التصوير الفلوري مع الصور ضوء أبيض الهيكلية المصاحبة. وتشمل المناطق ذات الاهتمام المرئية على هذه الأسطح الشق بين نصف الكرة الأرضية (IHS) والفص الصدغي (TL) والتصدع الجانبي (LF). (F) صورة الضوء الأبيض الهيكلي للشريان والأوردة على سطح الدماغ. (G) صورة فلورية ل (F) تظهر توزيع التتبع على طول الشريان السطحي. (ح) تظهر الشرائح العيانية من المناطق الدماغية الأمامية والخلفية تشتت التتبع ثنائي الأبعاد وتوزيعه في الشقوق (LF، IHS) والهياكل تحت القشرية مثل المخطط (STR) وفرس النهر (HPC). (I-J). صور Confocal تظهر التتبع في PVS ، يحدها خلايا البطانية الملطخة بالليكتين داخليا و AQP4 على عمليات القدم الفلكية خارجيا. (ك-ل). صور Confocal تظهر التتبع في PVS ، يحدها خلايا البطانية داخليا مع عمليات القدم الفلكية الملطخة بالبروتين الحمضي الرجفانى الدبقية (GFAP) مرئية تشكل حدودا خارجية. (M) صورة Confocal تظهر التتبع في PVS حول الشريان الملطخة أكتين العضلات الملساء (SMA) مع التتبع مرئية أيضا في وحولها، المحيطة parenchyma الدماغ. CM، سيدرنا ماجنا؛ DC، أسمنت الأسنان. EB، قاعدة الأذن. GFAP, بروتين حمضي الرجفان الدبقية; HPC, قرن آمون; IHS، التصدع بين نصف الكرة الأرضية؛ LF، شق الجانبية؛ OLB، لمبة الشم؛ OC, قمة القذالي; STR, المخطط; TL، الفص الصدغي؛ تلفاز، فقرات صدرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو تكميلي 1: نبض CSF بعد حقن التتبع. عن قرب فيديو للشسترنا ماجنا بعد حقن التتبع. الأزرق التتبع مرئيا في عنق القنية النابض في إيقاع CSF ويدل على القنية الناجحة والحقن. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، يوصف، بروتوكول مفصل لتنفيذ العلبة المباشرة للشهامة cisterna في الخنازير، بما في ذلك الإعداد اللازم، وإجراء العمليات الجراحية، ضخ التتبع واستخراج الدماغ. وهذا يتطلب شخص لديه خبرة وشهادة للعمل مع الحيوانات الكبيرة. إذا نفذت بشكل صحيح، وهذا يسمح لتسليم الجزيئات المطلوبة مع ضمان مباشرة في CSF، وبعد ذلك سلسلة من مختلف طرائق التصوير الضوئي المتقدمة يمكن استخدامها لاستكشاف توزيع CSF ووظيفة الجلاميلفاتيك بدقة عالية في الثدييات الكبيرة.
من المهم ملاحظة أنه على الرغم من أن هذا هو نفس الإجراء مثل علبة cisterna magna في القوارض ، إلا أنه أكثر تحديا قليلا ويتطلب عدة ساعات من التدريب. ويشمل هذا التدريب التعامل مع الثدييات الكبيرة في ظل ظروف مختبرية، وفهم التشريح والجهاز العضلي الهيكلي، وتحديدا في الخنازير، ودرجة ما من الكفاءة في استخدام الأدوات الجراحية. وبمجرد استيفاء هذه المعايير، من الممكن تنفيذ هذه التقنية، التي حققت حتى الآن معدل نجاح 100٪ مقارنة بمعدل نجاح 80-90٪ في الفئران. النقطة الأكثر أهمية لتنفيذ الإجراء بشكل صحيح، هو رفع الرأس وثني الرقبة أثناء إدخال القنية وغرس التتبع. على الرغم من أن التتبع تم حقنه هنا باليد ، إلا أنه تم القيام بذلك بطريقة خاضعة للرقابة تبلغ 100 ميكرولتر في الدقيقة. في الفئران عادة ما يتم حقن 10 ميكرولتر من التتبع وعند المقارنة المباشرة لأحجام الدماغ هذا من شأنه أن يترجم إلى ما يقرب من 2 مل في خنزير 50 كجم6،11،18. ولذلك، كان حقن 500 ميكرولتر من التتبع في الواقع حجم متحفظ، وينبغي أن لا تنتج الاضطرابات الموسعة في الضغط داخل الجمجمة (برنامج المقارنات الدولية). وبالإضافة إلى ذلك، تبين مؤخرا أن وظيفة الجلمفية المحيطة بوعية القلب ليست مجرد قطعة أثرية من الزيادات العابرة في برنامج المقارنات الدولية ولكنها تستمر عندما يحافظ على برنامج المقارنات الدولية عند خط الأساس باستخدام طريقة حقن مزدوجة تزيد من تعزيز الفكرة القائلة بأن هذه النتائج لا تعكس قطعا أثرية من برنامج المقارنات الدولية المعدل19.
هذه ليست التقنية الوحيدة التي يمكن استخدامها لأداء CMc في الخنازير ، وعلى الرغم من أنها أكثر توغلا ، إلا أنها تبدو كذلك لإعطاء ضخ أكثر دقة. طريقة أخرى لأداء CMc في الخنازير عن طريق الكذب عليها على جانبهم في موقف شغل الجانب والذهاب في أعمى مع إبرة العمود الفقري 150 ملم20. على الرغم من أن هذه الطريقة كانت جذابة بسبب الحد الأدنى من الغازية ، كان ينظر إلى معدل النجاح المحتمل على أنه أقل. منذ الجزء الخلفي من رأس الخنزير مسطحة وCM يجلس عميق جدا (10-12cm) من السطح، وإبرة العمود الفقري لديه مسافة طويلة للسفر قبل اختراق CM، مما يحد من اليقين من القنية الناجحة. وبصرف النظر عن المسافة الكبيرة إلى CM قطر CM نفسها حوالي 10 ملم فقط، مما يقلل من فرصة التمكن بنجاح. في المقابل، من خلال استخدام طريقة CMc المباشرة، فمن الممكن تصور مباشرة cannulation وبالتالي نعرف على وجه اليقين أنه كان ناجحا وأنه تم تسليم وكلاء إلى CSF وليس تسربت إلى الأنسجة الرخوة المحيطة بها. ضمان التمكن الناجح مهم لمثل هذه التجارب بسبب ارتفاع تكلفة الخنازير، ومرفق الجراحة، والمتتبعات الفلورية، فضلا عن تقليل عدد الخنازير المستخدمة.
القيود المفروضة على هذه الطريقة ، وبصرف النظر عن الغازية ، هو أن التكلفة والوقت يثبط العديد من التكرار بالمقارنة مع القوارض. استغرقت الجراحة الأولى حوالي 3 ساعات، ولكن يتم إجراؤها حاليا في حوالي 45 دقيقة. هذا يمثل تحسنا كبيرا في الوقت ، ومع ذلك ، لأداء cannulation في الماوس ، فإنه يأخذ أقل من 5 دقائق للباحث المهرة ، وهذا يعني أن الوقت الفعلي لعملية جراحية عند الوصول إلى الكفاءة لا يزال 9 مرات أطول مما كانت عليه في الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، يعني الدماغ الكبير أن أوقات دوران التتبع في الخنزير أكثر شمولا ، على سبيل المثال ، 2-6 ساعات ، بينما في الفئران يكون وقت الدورة الدموية القياسي 30 دقيقة. وبصرف النظر عن ارتفاع تكلفة التتبع ، اللازمة بكميات كبيرة للخنزير ، فإن التكلفة الفعلية للخنزير نفسه وكذلك مسكنه ، والتخدير ، وتكلفة استخدام غرفة عمليات كاملة تجعل التكلفة النهائية لهذا الإجراء لخنزير واحد أغلى 15 مرة مما كانت عليه في فأر واحد. التحدي الإضافي المرتبط بالوقت هو الوقت المستغرق لاستخراج الدماغ بعد الدورة الدموية التتبعية. وقد أظهرت التقارير السابقة أن بعض حركة التتبع من خلال PVS لا تزال قائمة بعد القتل الرحيم21. وهذا يجعل من المهم استخراج الأدمغة، في أسرع وقت ممكن، لتقليل أي آثار محيرة من هذه الظاهرة. في حين أن استخراج دماغ الفأر يصل فقط إلى بضع دقائق ، فإن استخراج دماغ الخنزير يستغرق ما يقرب من 15-20 دقيقة من الوقت. يجب إزالة الدماغ في أسرع وقت ممكن للحد من هذا التأثير ولكن مع سمك وبنية جمجمة الخنزير من الصعب تقليل أوقات الاستخراج الحالية.
على الرغم من أن العلبة المباشرة تجعل الإجراء غازيا إلى حد ما ، إلا أن إجمالي فقدان الدم بلغ في المتوسط 100 مل فقط لكل عملية جراحية ، مما يشكل خسارة أقل من 3٪ من إجمالي حجم الدم. وعلاوة على ذلك، يتلقى الحيوان ضخ المالحة المستمر مع التخدير وخط IV إضافية من اللاكتات رينجرز، والتخفيف من خطر نقص الدم.
هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية لاستكشاف ترجمة السائقين الفسيولوجية الجليمفاتيكية التي تم تحديدها في الفئران ، وكذلك وظيفة الجليمفاتيك في الخنازير المستيقظة أو النائمة بشكل طبيعي لإزالة تأثير التخدير2223. من أجل التحقيق في حالة النوم الطبيعي أو مستيقظا، سيكون من الضروري تكييف البروتوكول الحالي بحيث يمكن تسليم التتبع عن طريق وسائل أقل الغازية مع الحفاظ على معدل نجاح مرتفع. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق إجراء حقن CM تحت تنظير التصوير المقطعي المحوسب، والذي سبق استخدامه للثقب القطني في الخنازير24. وفي المستقبل، سيكون من المهم للغاية الجمع بين هذه التقنية والتلاعب الجيني لقناة المياه AQP4 لفهم دورها في وظيفة الجليمفاتيك في الثدييات الكبيرة. في استكشاف المدى الكامل للنظام الجلاميلفاتيك في الثدييات الكبيرة ، يتحرك الحقل أقرب إلى فهم الوظيفة الجلالطفية في البشر وكيف يمكن استخدامها علاجيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة كنوت وأليس والنبرغ، وهجارفوندن، ومؤسسات وينر غرين، ومؤسسة كرافورد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M.
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, Clifton, N.J. (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I.
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D'Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
