Summary
Denne artikkelen presenterer en trinnvis protokoll for direkte kanyleimplantasjon i svinens cisterna magna.
Abstract
Det glymphatiske systemet er et avfallsklareringssystem i hjernen som er avhengig av strømmen av cerebrospinalvæske (CSF) i astrocyttbundne perivasculære rom og har blitt implisert i clearance av nevrotoksiske peptider som amyloid-beta. Nedsatt glymphatisk funksjon forverrer sykdomspatologi i dyremodeller av nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers, som fremhever viktigheten av å forstå dette klareringssystemet. Det glymphatiske systemet studeres ofte av cisterna magna cannulations (CMc), hvor tracere leveres direkte inn i cerebrospinalvæsken (CSF). De fleste studier har imidlertid blitt utført hos gnagere. Her demonstrerer vi en tilpasning av CMc-teknikken hos griser. Ved hjelp av CMc hos griser kan det glymphatiske systemet studeres ved en høy optisk oppløsning i gyrencephalic hjerner og dermed broer kunnskapsgapet mellom gnager og menneskelig glymphatics.
Introduction
Cerebrospinalvæske (CSF) er et ultrafiltrat av blod som finnes i og rundt sentralnervesystemet (CNS) 1,2. Bortsett fra å gi oppdrift til hjernen eller absorbere skadelige mekaniske krefter, spiller CSF også en sentral rolle i å fjerne metabolsk avfall fra CNS3. Avfallsklarering forenkles av det nylig karakteriserte glymphatiske systemet som tillater konvektiv strøm av CSF gjennom hjernen parenchyma via perivascular mellomrom (PVS), som omkranser gjennomtrengende arterier3,4,5. Denne prosessen har vist seg å være avhengig av aquaporin-4 (AQP4), en vannkanal uttrykt hovedsakelig på den astrocytiske endfeet, bundet til PVS4,6. Studien av glymphatiske systemet oppnås ved både in vivo- og ex vivo-avbildning, ved hjelp av enten avansert lysmikroskopi eller magnetisk resonansavbildning (MR), etter innføringen av en fluorescerende / radioaktiv tracer eller kontrastmiddel i CSF7, 8,9,10,11.
En effektiv måte å introdusere en tracer i CSF uten å pådra seg skade på hjernen parenchyma er gjennom cisterna magna kannasjon (CMc)12,13. Et stort flertall av alle glymphatiske studier, så langt har blitt utført hos gnagere og unngått hos høyere pattedyr på grunn av invasiviteten til CMc koblet til den praktiske enkelheten ved å jobbe med et lite pattedyr. I tillegg tillater de tynne hodeskallene av mus in vivo-avbildning uten behov for et kranialvindu og tillater deretter en ukomplisert hjerneutvinning11,14. Eksperimenter utført hos mennesker har gitt en verdifull makroskopisk in vivo-data om glymphatisk funksjon, men stolte på intratekale tracerinjeksjoner i den distale lumbal ryggraden og dessuten bruke MR som ikke gir tilstrekkelig oppløsning for å fange mikroanatrikken det glymphatiske systemet7,15,16 . Å forstå arkitekturen og omfanget av det glymphatiske systemet i høyere pattedyr er avgjørende for oversettelsen til mennesker. For å lette glymphatisk oversettelse til mennesker, er det viktig å bruke teknikker som utføres hos gnagere til høyere pattedyr for å muliggjøre direkte sammenligninger av glymphatisk system på tvers av arter av økende kognisjon og hjernekompleksitet17. Gris og menneskelige hjerner er gyrencephalic, som har en brettet nevroarkitektur, mens gnagerhjerner er lissencephalic, og har dermed betydelig forskjell blant hverandre. Når det gjelder den totale størrelsen, er grishjerner også mer sammenlignbare med mennesker, som er 10-15 ganger mindre enn den menneskelige hjernen, mens musehjerner er 3000 ganger mindre18. Ved å bedre forstå det glymphatiske systemet i store pattedyr, kan det være mulig å utnytte det menneskelige glymphatiske systemet for fremtidig terapeutisk inngrep i forhold som hjerneslag, traumatisk hjerneskade og nevrodegenerasjon. Direkte CMc hos griser in vivo er en metode som muliggjør høyoppløselig lysmikroskopi av glymphatisk system i et høyere pattedyr. Videre, på grunn av størrelsen på grisene som brukes, er det mulig å bruke overvåkingssystemer som ligner de som brukes i menneskelige operasjoner, noe som gjør det mulig å tett dokumentere og regulere vitale funksjoner for å vurdere hvordan disse bidrar til glymphatisk funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i henhold til det europeiske direktivet 2010/63/EU og ble godkjent av Malmö-Lund Etisk komité for dyreforskning (Dnr 5.8.18-05527/2019) og gjennomført i henhold til CODEX-retningslinjene i Det svenske forskningsrådet.
1. Forberedelse
- Tracer
- Forbered kunstig CSF (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glukose, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
- Til 500 μL kunstig CSF, tilsett 10 mg albumin fra bovint serum (BSA) konjugert med Alexa Fluor 647 (BSA-647).
- Sentrifuge ved 5000 x g i 5 min og bruk supernatanten.
- Kanyle
- Fest en 1 ml sprøyte til den kvinnelige Luer-tilkoblingen av den intravenøse (IV) linjen, 3-veis kran med 10 cm forlengelse.
- Fest en 18 G nål til den mannlige enden.
- Åpne 3-veis stopplåsen for å tillate kontinuitet fra kanylen til sprøyten.
- Fjern forsiktig nålen og aspirer ca. 300 μL saltvann inn i IV-linjen.
- Fjern nålen fra saltvannsvæsken og fortsett å introdusere i litt luft for å skape en liten luftboble (5-10 mm) i IV-linjen.
- Plasser nålen i traceren og aspirer alle 500 μL av traceren. Saltvannsvæsken i IV-linjen skal være synlig adskilt av en luftboble.
- Kast kanylen og lukk 3-veis stopplåsen.
- Dyr
- Sedate en gris ved intramuskulær (i.m.) injeksjon av tiletamin (3,75 mg/kg) og zolazepam (3,75 mg/kg) og deksmedetomidin (37,5 μg/kg). Vent til det blir bevisstløs.
- Forbered en intravenøs linje ved å sette inn en 20 G kanyle i ørevenen.
MERK: Pass på at kanylen er i venen ved å injisere 5-10 ml saltvann gjennom kanylen. Hvis venen har blitt savnet, vil dette bli merkbart av lite ødem i ørevevet. - Intuber grisen for å sikre at pustefrekvensen kan reguleres gjennom hele operasjonen.
MERK: Sørg for vellykket intubasjon ved å legge press på grisens thorax og bekreft at tvangs utløpt luft kommer ut av intubasjonsrøret. - Fest intubasjonsrøret til et ventilatorsett til en pustehastighet på 14 pust/min.
- Koble et pulsoksymeter og mansjett til halen for å overvåke hjertefrekvensen (HR), blodtrykket (BP) og oksygenmetningen (sats). Sett inn et rektaltermometer for å overvåke kjernetemperaturen.
- Forbered en IV-pose med ketamin (5 mg/kg/min), midazolam (0,25 mg/kg/min) og fentanyl (2,5 μg/kg/min), i saltvann og begynn å tilsette gjennom ørevenen ved ca. 2 dråper/s.
MERK: Gjennom hele operasjonen kan infusjonshastigheten måtte økes eller reduseres basert på dyrets vitale. - Med grisen i utsatt stilling, palpate baksiden av dyrets hode og nakke for å finne og markere occipital kam og ryggrad av de første thorax ryggvirvlene og bunnen av hvert øre.
- Tegn en rett linje mellom kammen og ryggvirvlene langs langsgående akse. Tegn to linjer fra kammen til bunnen av hvert øre ved å følge bunnen av skallen (figur 1A).
- Kontroller at dyret er i dyp søvn ved å forsiktig klemme halen og se etter fravær av hale refleks.
MERK: Hvis dyret fortsatt er refleksivt, bør bedøvelsesinfusjonshastigheten økes trinnvis til dyret ikke lenger viser en refleks.
2. Kirurgi
MERK: Gjennom hele operasjonen er det nødvendig å ha minst en assistent for å suge lysblødningen og cauterize noen avskårne kar.
- Bruk en skalpell med et # 21 blad, gjør et dermal snitt langs langsgående linje ned til muskelen.
- Utvid to vinkelrette dermale snitt videre langs skuldrene, 10-15 cm i lengde.
- Fra occipital crests, gjør dermale snitt langs linjen ned til bunnen av hvert øre.
- Gripe hudhjørnene dannet på oksipital kam med anatomiske tang, skille huden forsiktig fra den underliggende muskelen ved å kjøre skalpellbladet lett over fascia, beveger seg fra rostral til kaudal. Når huden er resektert etter hver av de fem snittene, bør deler av trapesmusklene da være synlige.
- Lag et langsgående snitt med skalpellen, ca 1 cm dyp, hvor trapezius kommer sammen ved midtlinjen.
MERK: Når du skjærer gjennom musklene, er det økt tilbøyelighet til blødning, så cauterizeren skal være klar. Hvis et større fartøy blir kuttet, bør en person raskt komprimere det med gasbindet, mens den andre personen bruker cauterizer. - Ved hjelp av en kombinasjon av rette og buede kirurgiske tang, utfør stump disseksjon som arbeider langs langsgående kutt i musklene. Dette vil skille magene i trapezius, samt den underliggende semispinalis capitus biventer muskelen.
- Sever eventuelle vedvarende muskelfibre med en skalpell og fortsette stump disseksjon til semispinalis capitus complexus blir synlig.
- Sever opprinnelsen til trapezius og semispinalis capitus biventer muskler langs bakre aspekt av skallen. Separer dem forsiktig langsgående med skalpellen som utfører stump disseksjon til semispinalis capitus-komplekset er fullt synlig.
- Trekk tilbake trapezius og semispinalis capitus biventer muskler ved hjelp av selvbevarende retraktorer.
- Hvor magene til semispinalis capitus complexus kommer sammen i midtlinjen, gjør et langsgående snitt med skalpellen ca 1 cm dyp.
MERK: Vær oppmerksom på ytterligere blødninger her. Blødning kan håndteres ved hjelp av en kombinasjon av bomullspinne og cauterization. - Bruk kirurgiske tang, utfør en stump disseksjon som arbeider langs langsgående kutt mellom muskelklokkene til dorsalaspektet av atlaset (CI) er håndgripelig.
- Sever opprinnelsen til semispinalis capitus complexus muskler langs bakre aspektet av skallen og skille den langsgående fra underliggende ryggvirvler ved skalpell og stump disseksjon.
- Trekk tilbake semispinalis capitus complexus muskler ved hjelp av et annet sett med selvbevarende retraktorer.
- Bruk en skalpell, fjern forsiktig eventuelt gjenværende vev som overliggende regionen der atlaset møter skallebasen.
- Plasser den ene armen under dyrets nakke og en finger ved atlasets og skallens juncture, løft samtidig hodet og bøy nakken mens du palperer med fingeren for å avsløre cisternamagnaten ved hjelp av den andre hånden.
MERK: Cisternamagnaten er gjenkjennelig når den palperes som en sterk elastisk struktur med en liten mengde rebound når trykket slippes ut med fingeren.
3. Kannkulasjon og injeksjon
MERK: Dette trinnet krever også minst to personer og utføres med dyrets hode forhøyet og nakke bøyd.
- Forsikre deg om at en person løfter og bøyer dyrets hode og nakke mens den andre palpates for cisterna magna gjør et notat om sin anatomiske plassering.
- Introduser sakte og forsiktig en 22 G kanyle gjennom dura og inn i cisternamagnaten i skrå vinkel til langsgående akse.
MERK: Ikke sett kanylen for dypt inn, da dette kan forårsake skade på hjernen. Å vite hvor langt å sette inn kanylen kommer med erfaring i å forstå hvordan det føles for kanylen å pierce dura. I hovedsak, akkurat som dura har blitt gjennomboret, er kanylen da dyp nok til en vellykket tracer injeksjon. Denne dybden er ca 3-5 mm, men vil variere basert på dyrets størrelse eller alder. Vellykket kanylering bør umiddelbart være tydelig gjennom visualisering av klar, pulsatile CSF stigende kanylen. For det beste resultatet anbefales det å praktisere flere kannulations på forhånd i euthanized dyr for å få ens forståelse av dural piercing. - Trekk kanylen tilbake fra kanylen og sett en hette på låsen.
- Først bruker du superlim og en akselerator der kanylen kommer inn i vevet, etterfulgt av påføring av tannsementen. Vent i 5 min til sementen herdes.
- Fjern forsiktig hetten fra kanylen og fest den mannlige enden av den tidligere forberedte IV-linjekranen med 10 cm forlengelse, med traceren, til kanylen.
- Injiser traceren langsomt for hånd eller ved hjelp av en mikroinfusjonspumpe med en hastighet på 100 μL/min. Fjern 3-veis IV-linjekranen med 10 cm forlengelse og bytt den ut med hetten. Tracer skal nå være synlig pulserende ved bunnen av kanylen (ekstra video 1).
MERK: Hvis du injiserer for hånd, gjør du dette til sporstoffet bare er synlig i kanyleakselen, ca. 1-2 mm over der tannsementen dekker akselen. - Etter injeksjon, plasser sandsekker under nakken for å opprettholde litt fleksjon. Hodet kan da frigjøres, og dyret blir igjen i en hvileutsatt stilling.
- Slipp de selvbevarende retraktorene og plasser musklene mens de ligger før. Ta huden sammen over musklene ved hjelp av kirurgiske håndkleklemmer.
- Dekk håndkleklemmer og snitt med gasbind og deretter et teppe for å begrense varmetapet.
- La traceren sirkulere i ønsket tid før du euthanizing dyret av i.v. Pentobarbital injeksjon (140 mg/kg). Bekreft eutanasi ved fravær av hjertelyder ved auskultasjon med et stetoskop.
4. Hjerneutvinning og prosessering
- Bruk en skalpell med 20-blad, utvid det langsgående dermale snittet fra oksipital kam til ca. 7 cm over nesen.
- Reflekter huden som overbestår det dorsale aspektet av skallen ved hjelp av skalpellen.
MERK: Det er flere måter å kutte og fjerne det dorsale aspektet av grisskallen på dyr-for-dyr-basis. Det som følger er prosedyren som har fungert oftest for dette eksperimentet. - Bruk en håndholdt kompakt sag, lag et koronal kutt i skallen, ca 3 cm over de to store venene sett ut av skallen. Utvid til ytterligere to vertikale kutt fra koronakuttene og ytterligere to kutt for å bringe de vertikale kuttene sammen i midtlinjen.
MERK: Hold et fast grep på sagen når du lager skallens beinkutt, da det vil ha en tendens til å trekke seg bort ved første kontakt med beinet eller vevet, noe som kan føre til en alvorlig skade. - Pass på at skallekuttene er gjennom hele tykkelsen på beinet ved å følge opp med en hammer og smal meisel (10 mm) til hvert av kuttene.
- Bruk hammeren til slutt å slå en bred meisel (25-30 mm) inn i koronalsnittet. Med en person som støtter hodet, må du sørge for at den andre personen bruker giring på meiselen for å vinne opp dorsalskallen.
- Når dorsalskallefragmentet er fjernet, dissekerer dura mater ut med buet kirurgisk saks.
- Bruk en spatel for å alvorlig ryggmargen fra cerebellum på rostral aspektet. Fortsett deretter med å lede spatelen under hjernen fra forsiden, kutte de olfaktoriske pærene, hypofysen og kranialnervene.
- Plasser spatelen bak cerebellum og påfør en god del trykk for å løsne hjernen fra kranialhulen, løft den forsiktig ut når den er løs.
- Umiddelbart fikse hele hjernen ved vev nedsenking i 4% paraformaldehyd over natten.
MERK: Etter dette trinnet er det mulig å utføre hele hjerneavbildningen ved hjelp av et stereoskop (figur 1E). - Neste dag lager du koronalskiver i hjernen ved hjelp av en laksekniv og fikser skivene over natten ved vevs nedsenking i 4% paraformaldehyd.
- Til slutt legger du skivene i 0,01% azide i PBS for langsiktig lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når grisen er bevisstløs, blir den palpert, og overflateanatomien er merket, starter ved occipital crest (OC) og arbeider mot thoracic ryggvirvler (TV) og hver ørebase (EB). Det er langs disse linjene at dermale snitt er laget (figur 1A). De tre muskellagene, inkludert trapezius, semispinalis capitus biventer og semispinalis capitus complexus, blir resected og holdt åpne av to sett med selvbevarende retraktorer for å eksponere cisterna magna (CM) (figur 1B). Hodet bøyes deretter for å åpne rommet mellom baksiden av skallen og atlaset og lette tilgangen til CM (figur 1C). En kanyle på 18 G settes forsiktig 3-5 mm inn i CM og festes på plass av både superlim og tannsement (DC). Tracer kan deretter injiseres med en fast rente. Når sporstoffet er injisert, erstattes IV-linjen og sprøyten med en kanylehette (figur 1C-D). Musklene blir deretter satt tilbake på plass og grisen er dekket og holdt varm for tiden traceren sirkuleres. Etter sirkulasjon blir dyret euthanized, og hjernen fjernes raskt. Det er mulig å generere sydde makroskopiske bilder av hjernens dorsale overflate, noe som letter med å gi detaljert innsikt i distribusjonsmønstrene til tracer på dorsal hjerneoverflaten over sulci og sprekker (figur 1E). Lignende bilder kan genereres fra hjernens ventrale og laterale overflater der sporstofffordelingen kan undersøkes i temporal lobe (TL) og lateral sprekk (LF) (figur 1E). Et stereoskop kan i tillegg brukes til å produsere høyere forstørrelsesbilder av hjerneoverflaten der det er mulig å se sporstoffet i PVS langs arterier (figur 1F-G). Makroskopiske koronal hjerneseksjoner, ca. 8 mm tykke, kuttes med en laksekniv og gir ytterligere innsikt i dybden av tracerpenetrasjon i interhemisfærisk sprekk (IHS), samt subkortisk tracerfordeling i strukturer som hippocampus (HPC) og striatum (STR), (figur 1H).
Immunhiistokjemisk farging for AQP4 uttrykt ved astrocytisk endfeet, glial-fibrillary acidic protein (GFAP) uttrykt gjennom astrocytter og glatt muskel aktin (SMA) ligger rundt arterioles viste at tracer lokalisert både innenfor PVS og beveger seg inn i hjernen parenchyma (Figur 1I-M). AQP4- og GFAP-farging brukes til å identifisere astrocytter og mer spesifikt astrocyttfotprosessene som danner den ytre overflaten av PVS mens lectin og GLUT-1 flekker endotelcellene som danner den indre overflaten av PVS (figur 1I-L). Ved å utføre disse flekkene for å definere PVS-grensene, er det mulig å identifisere CSF-injisert tracer lokalisert til PVS-rommet. Dette støtter forestillingen om at CSF får tilgang til gyrencephalic hjernen via omfattende PVS transport som deretter letter glymphatic tilstrømning i hjernen parenchyma. SMA farging identifiserer arterier og arterioler ved binding til glatte muskelceller som finnes i arterielle vegger og kan brukes til å vise at PVS tilstrømning oppstår langs arterier i motsetning til årer, som utgjør den grunnleggende fysiologien til normal glymphatisk funksjon (figur 1M).
Figur 1. Cisterna magna kannkulasjon hos griser. (A) Gris prepped før starten av operasjonen og merket der dermal snitt vil bli utført fra occipital crest (OC) deretter bakre til thoracic ryggvirvler (TV) og lateral til hver ørebase (EB). (B) Hodet i avslappet posisjon med trapezius, semispinalis capitus biventer og semispinalis capitus complexus muskler trukket tilbake, og dermed utsette cisterna magna (CM). (C) Hodet bøyd manuelt for å øke tilgangen til CM for kannkulering og injeksjon. (D) Nærbilde av en kanyle satt inn i CM etter injeksjon og festet på plass med tannsementen (DC). (E) Dorsale, ventrale og laterale hjerneoverflater, henholdsvis etter fluorescerende avbildning med tilhørende strukturelle hvite lysbilder. Interesseområder som er synlige på disse overflatene inkluderer interhemisfærisk sprekk (IHS), temporal lobe (TL) og lateral sprekk (LF). (F) Strukturelt hvitt lys bilde av arterien og venene på hjerneoverflaten. (G) Fluorescerende bilde av (F) som viser sporstofffordelingen langs overflatearterien. (H) Makroskopiske skiver fra de fremre og bakre cerebral regionene viser todimensjonal tracer dispersjon og distribusjon i sprekker (LF, IHS) og subkortiske strukturer som striatum (STR) og hippocampus (HPC). (I-J). Konfokale bilder som viser sporstoffet i PVS, avgrenset av lectin-fargede endotelceller internt og AQP4 på astrocyttfotprosesser eksternt. (K-L). Konfokale bilder som viser sporstoffet i PVS, avgrenset av endotelceller internt med astrocyttfotprosesser farget for glial fibrillært surt protein (GFAP) synlig danner en ytre grense. (M) Konfokalt bilde som viser sporstoffet i PVS rundt en arteriole farget for glatt muskel aktin (SMA) med tracer også synlig i og rundt, rundt hjernen parenchyma. CM, cisterna magna; DC, tannsement; EB, ørebase; GFAP, glial fibrillært surt protein; HPC, hippocampus; IHS, interhemisfærisk sprekk; LF, lateral sprekk; OLB, olfaktorisk pære; OC, occipital kam; STR, striatum; TL, temporal lobe; Tv, thorax ryggvirvler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ekstra video 1: CSF-pulsering etter tracerinjeksjonen. Nærbildevideo av cisternamagnaten etter tracerinjeksjonen. Blå tracer er synlig i kanylehalsen pulserende ved rytmen til CSF og indikerer en vellykket kanylering og injeksjon. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Herein, er beskrevet, en detaljert protokoll for å utføre direkte kannkulasjon av cisterna magna hos griser, inkludert nødvendig forberedelse, kirurgisk prosedyre, tracer infusjon og utvinning av hjernen. Dette krever noen med erfaring og sertifisering for å jobbe med store dyr. Hvis det utføres riktig, tillater dette levering av ønskede molekyler med sikkerhet direkte inn i CSF, hvorpå en rekke forskjellige avanserte lysavbildningsmodaliteter kan brukes til å utforske CSF-distribusjon og glymphatisk funksjon ved høy oppløsning i et stort pattedyr.
Det er viktig å merke seg at selv om dette er samme prosedyre som cisterna magna kannasjon i gnagere, er det litt mer utfordrende og krever flere timer med trening. Slik opplæring inkluderer håndtering av store pattedyr under laboratorieforhold, forståelse av anatomien og muskel-skjelettsystemet, spesielt hos griser, og en viss grad av ferdighet i bruk av kirurgiske instrumenter. Når disse kriteriene er oppfylt, er det mulig å utføre denne teknikken, som så langt har en suksessrate på 100% sammenlignet med en suksessrate på 80-90% hos mus. Det mest kritiske punktet for å utføre prosedyren riktig, er å heve hodet og bøye nakken mens du setter inn kanylen og tilfører traceren. Selv om tracer ble injisert her for hånd, ble det gjort på en kontrollert måte på 100 μL per minutt. Hos mus injiseres vanligvis 10 μL tracer, og når man sammenligner hjernestørrelser direkte, vil dette oversettes til ca. 2 ml i en 50 kg gris6,11,18. Derfor var injeksjonen av 500 μL tracer faktisk et konservativt volum og burde ikke ha produsert utvidede perturbances i intrakranielt trykk (ICP). I tillegg har det nylig blitt vist at perivascular glymphatic funksjon ikke bare er en artefakt av forbigående økninger i ICP, men vedvarer når ICP opprettholdes ved grunnlinjen ved hjelp av en dobbel sprøytemetode som ytterligere styrker forestillingen om at disse funnene ikke gjenspeiler artefakter av endret ICP19.
Dette er ikke den eneste teknikken som kan brukes til å utføre CMc hos griser, og selv om den er vesentlig mer invasiv, ser det ut til å gi en mer nøyaktig tracerinfusjon. En annen måte å utføre CMc hos griser er ved å ligge dem på deres side i lateral heftelsesposisjon og gå i blind med en 150 mm spinal nål20. Selv om dette var en attraktiv metode på grunn av sin minimale invasivitet, ble den potensielle suksessraten oppfattet å være lavere. Siden baksiden av grishodet er flatt og CM sitter veldig dypt (10-12 cm) fra overflaten, har ryggnålen lang avstand til å reise før den trer inn i CM, og begrenser dermed sikkerheten til vellykket kanylering. Bortsett fra den store avstanden til CM, er diameteren på CM selv bare ca. 10 mm, noe som reduserer sjansen for vellykket kannasjon ytterligere. I motsetning, ved å bruke den direkte CMc-metoden, er det mulig å visualisere kannasjonen direkte og dermed vite med sikkerhet at den har vært vellykket og at midlene er levert til CSF og ikke lekket ut i omkringliggende bløtvev. Å sikre vellykket kannasjon er viktig for slike eksperimenter på grunn av høye kostnader for griser, kirurgianlegg og fluorescerende sporstoffer, samt for å minimere antall griser som brukes.
Begrensningene ved denne metoden, bortsett fra invasiviteten, er at kostnaden og tiden fraråder mange repetisjoner sammenlignet med gnagere. Den første operasjonen som ble utført tok rundt 3 timer, men den utføres for tiden på omtrent 45 minutter. Dette representerer en betydelig tidsforbedring, men for å utføre en kannasjon i en mus, tar det mindre enn 5 minutter for en dyktig forsker, noe som betyr at den faktiske operasjonstiden ved å nå ferdighet fortsatt er 9 ganger lengre enn hos mus. I tillegg betyr den store hjernen at sporingssirkulasjonstidene i grisen er mer omfattende, for eksempel 2-6 timer, mens hos mus er en standard sirkulasjonstid 30 minutter. Bortsett fra den høye prisen på traceren, som trengs i store mengder for grisen, gjør den faktiske kostnaden for grisen selv så vel som dens bolig, bedøvelse og kostnaden ved å bruke et fullt operasjonsteater sluttkostnaden for denne prosedyren for en gris 15 ganger dyrere enn i en enkelt mus. En ekstra tidsrelatert utfordring er tiden det tar for hjerneutvinningen etter sporstoffsirkulasjonen. Tidligere rapporter har vist at en viss bevegelse av sporstoffet gjennom PVS vedvarer etter eutanasi21. Dette gjør det viktig å trekke ut hjerner, så raskt som mulig, for å minimere eventuelle forvirrende effekter fra dette fenomenet. Mens musen hjerneutvinning bare utgjør noen få minutter, tar grishjerneutvinning omtrent 15-20 minutter. Hjernen bør fjernes så raskt som mulig for å begrense denne effekten, men med tykkelsen og arkitekturen til grisskallen er det vanskelig å redusere dagens ekstraksjonstider.
Selv om direkte kannasjon gjør prosedyren ganske invasiv, var det totale blodtapet bare gjennomsnittlig 100 ml per operasjon, noe som utgjør et tap på mindre enn 3% av det totale blodvolumet. Videre mottar dyret en kontinuerlig saltvannsinfusjon med bedøvelse og en ekstra IV-linje av Ringers laktat, noe som reduserer risikoen for hypovolemi.
Fremtidige studier er nødvendig for å utforske oversettelsen av de glymphatiske fysiologiske driverne identifisert hos mus, samt glymphatisk funksjon i våken eller naturlig sovende svin for å fjerne virkningen av anestesi22,23. For å undersøke den naturlige søvnen eller våken tilstand, vil det være nødvendig å tilpasse den nåværende protokollen slik at tracer kan leveres via mindre invasive midler, samtidig som den opprettholder en høy suksessrate. Dette kan potensielt oppnås ved å utføre CM-injeksjoner under beregnet tomografi fluoroskopi, som tidligere har blitt brukt til lumbal punktering hos griser24. Fremover ville det være av stor interesse å kombinere denne teknikken med genetiske manipulasjoner av AQP4 vannkanalen for å forstå sin rolle i glymphatisk funksjon i et stort pattedyr. Ved å utforske hele omfanget av det glymphatiske systemet i et stort pattedyr, beveger feltet seg nærmere å forstå glymphatisk funksjon hos mennesker og hvordan det kan brukes terapeutisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Knut og Alice Wallenberg Foundation, Hjärnfonden, Wenner Gren Foundations og Crafoord foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M.
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, Clifton, N.J. (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I.
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D'Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
