Summary
Este artículo presenta un protocolo paso a paso para la implantación directa de cánulas en la cisterna magna de cerdos.
Abstract
El sistema glinfático es un sistema de eliminación de desechos en el cerebro que depende del flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR) en espacios perivasculares unidos a astrocitos y se ha implicado en el aclaramiento de péptidos neurotóxicos como la beta amiloide. La función glinfática deteriorada exacerba la patología de la enfermedad en modelos animales de enfermedades neurodegenerativas, como el Alzheimer, lo que destaca la importancia de comprender este sistema de eliminación. El sistema glinfático a menudo se estudia mediante cánulaciones de cisterna magna (CMc), donde los trazadores se administran directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR). La mayoría de los estudios, sin embargo, se han llevado a cabo en roedores. Aquí, demostramos una adaptación de la técnica CMc en cerdos. Usando CMc en cerdos, el sistema glinfático se puede estudiar a una alta resolución óptica en cerebros giroencefálicos y, al hacerlo, cierra la brecha de conocimiento entre los roedores y los glinfáticos humanos.
Introduction
El líquido cefalorraquídeo (LCR) es un ultrafiltrato de sangre que se encuentra dentro y alrededor del sistema nervioso central (SNC)1,2. Además de dar flotabilidad al cerebro o absorber fuerzas mecánicas dañinas, el LCR también juega un papel fundamental en la eliminación de desechos metabólicos del SNC3. La eliminación de residuos se ve facilitada por el sistema glinfático recientemente caracterizado que permite el flujo convectivo del LCR a través del parénquima cerebral a través de los espacios perivasculares (PVS), que rodean las arterias penetrantes3,4,5. Se ha demostrado que este proceso depende de la acuaporina-4 (AQP4), un canal de agua expresado principalmente en los extremos astrocíticos, unido al PVS4,6. El estudio del sistema glinfático se realiza mediante imágenes tanto in vivo como ex vivo, utilizando microscopía de luz avanzada o resonancia magnética (RM), tras la introducción de un marcador fluorescente/radiactivo o agente de contraste en el LCR7,8,9,10,11.
Una forma eficaz de introducir un trazador en el LCR sin sufrir daños en el parénquima cerebral es a través de la cánulación cisterna magna (CMc)12,13. Una gran mayoría de todos los estudios glinfáticos, hasta ahora se han llevado a cabo en roedores y se han evitado en mamíferos superiores debido a la invasividad de CMc junto con la simplicidad práctica de trabajar con un mamífero pequeño. Además, los delgados cráneos de ratones permiten la obtención de imágenes in vivo sin necesidad de una ventana craneal y, posteriormente, permiten una extracción cerebral sin complicaciones11,14. Los experimentos realizados en humanos han arrojado valiosos datos macroscópicos in vivo sobre la función glinfática, pero se han basado en inyecciones de trazadores intratecales en la columna lumbar distal y, además, utilizan resonancia magnética que no produce la resolución suficiente para capturar la microanatomía del sistema glinfático7,15,16 . Comprender la arquitectura y la extensión del sistema glinfático en mamíferos superiores es esencial para su traducción a los humanos. Para facilitar la traducción glinfática a los seres humanos, es importante aplicar técnicas que se llevan a cabo en roedores a mamíferos superiores para permitir comparaciones directas del sistema glinfático entre especies de creciente cognición y complejidad cerebral17. Los cerebros de cerdos y humanos son giroencefálicos, poseen una neuroarquitectura plegada, mientras que los cerebros de roedores son lisencefálicos, por lo que tienen una diferencia sustancial entre sí. En términos del tamaño total, los cerebros de cerdo son, también, más comparables a los humanos, siendo 10-15 veces más pequeños que el cerebro humano, mientras que los cerebros de ratón son 3.000 veces más pequeños18. Al comprender mejor el sistema glinfático en grandes mamíferos, puede ser posible utilizar el sistema glinfático humano para futuras intervenciones terapéuticas en afecciones como accidente cerebrovascular, lesión cerebral traumática y neurodegeneración. CMc directo en cerdos in vivo es un método que permite la microscopía de luz de alta resolución del sistema glinfático en un mamífero superior. Además, debido al tamaño de los cerdos utilizados, es posible aplicar sistemas de monitoreo similares a los utilizados en cirugías humanas, lo que hace posible documentar y regular estrechamente las funciones vitales para evaluar cómo estas contribuyen a la función glinfática.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la directiva europea 2010/63/UE y fueron aprobados por el Comité Ético de Investigación Animal de Malmö-Lund (Dnr 5.8.18-05527/2019) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del CODEX del Consejo de Investigación de Suecia.
1. Preparación
- Trazador
- Preparar LCR artificial (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucosa, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
- A 500 μL de LCR artificial, añadir 10 mg de albúmina de suero bovino (BSA) conjugado con Alexa Fluor 647 (BSA-647).
- Centrifugar a 5.000 x g durante 5 min y utilizar el sobrenadante.
- Cánula
- Conecte una jeringa de 1 ml a la conexión Luer hembra de la línea intravenosa (IV), grifo de 3 vías con una extensión de 10 cm.
- Coloque una aguja de 18 G en el extremo masculino.
- Abra el bloqueo de parada de 3 vías para permitir la continuidad desde la aguja hasta la jeringa.
- Desenfundar cuidadosamente la aguja y aspirar aproximadamente 300 μL de solución salina en la vía intravenosa.
- Retire la aguja de la solución salina y proceda a introducir un poco de aire para crear una pequeña burbuja de aire (5-10 mm) en la línea IV.
- Coloque la aguja en el marcador y aspire los 500 μL del trazador. La solución salina en la línea IV debe estar visiblemente separada por una burbuja de aire.
- Deseche la aguja y cierre la cerradura de parada de 3 vías.
- Animal
- Sedar a un cerdo mediante inyección intramuscular (i.m.) de tiletamina (3,75 mg/kg) y zolazepam (3,75 mg/kg) y dexmedetomidina (37,5 μg/kg). Espera a que quede inconsciente.
- Prepare una vía intravenosa insertando una cánula de 20 G en la vena del oído.
NOTA: Asegúrese de que la cánula esté en la vena inyectando 5-10 ml de solución salina a través de la cánula. Si se ha perdido la vena, esto se notará por un pequeño edema en el tejido del oído. - Intubar al cerdo para asegurarse de que la frecuencia respiratoria se pueda regular durante toda la cirugía.
NOTA: Asegure una intubación exitosa aplicando presión sobre el tórax del cerdo y confirme que el aire espirado por la fuerza está saliendo del tubo de intubación. - Conecte el tubo de intubación a un ventilador a una frecuencia respiratoria de 14 respiraciones/min.
- Conecte un oxímetro de pulso y un manguito a la cola para controlar la frecuencia cardíaca (FC), la presión arterial (PA) y la saturación de oxígeno (sats). Inserte un termómetro rectal para controlar la temperatura central.
- Prepare una bolsa intravenosa de ketamina (5 mg/kg/min), midazolam (0,25 mg/kg/min) y fentanilo (2,5 μg/kg/min), en solución salina y comience a infundir a través de la vena del oído a aproximadamente 2 gotas/s.
NOTA: A lo largo de la cirugía, la velocidad de infusión puede necesitar ser aumentada o disminuida en función de los signos vitales del animal. - Con el cerdo en posición prona, palpa la parte posterior de la cabeza y el cuello del animal para localizar y marcar la cresta occipital y la columna vertebral de las primeras vértebras torácicas y la base de cada oreja.
- Dibuja una línea recta entre la cresta y las vértebras a lo largo del eje longitudinal. Dibuja dos líneas desde la cresta hasta la base de cada oreja siguiendo la base del cráneo (Figura 1A).
- Verifique que el animal esté en un sueño profundo sujetando cuidadosamente la cola y observando la ausencia de un reflejo de la cola.
NOTA: Si el animal todavía es reflexivo, la velocidad de infusión de anestésico debe aumentarse gradualmente hasta que el animal ya no muestre un reflejo.
2. Cirugía
NOTA: Durante toda la cirugía, es necesario tener al menos un asistente para succionar el sangrado ligero y cauterizar los vasos cortados.
- Usando un bisturí con una cuchilla # 21, haga una incisión dérmica a lo largo de la línea longitudinal hasta el músculo.
- Extienda dos incisiones dérmicas perpendiculares más a lo largo de los hombros, de 10 a 15 cm de longitud.
- Desde las crestas occipitales, haga incisiones dérmicas a lo largo de la línea hasta la base de cada oreja.
- Agarrando las esquinas de la piel formadas en la cresta occipital con fórceps anatómicos, separe cuidadosamente la piel del músculo subyacente pasando ligeramente la hoja del bisturí sobre la fascia, moviéndose de la rostral a la caudal. Una vez que la piel ha sido resecada después de cada una de las cinco incisiones, las partes de los músculos trapecio deben ser visibles.
- Haga una incisión longitudinal con el bisturí, de aproximadamente 1 cm de profundidad, donde el trapecio se une en la línea media.
NOTA: Al cortar a través de los músculos, hay una mayor propensión al sangrado, por lo que el cauterizador debe estar listo. Si se corta un vaso más grande, una persona debe comprimirlo rápidamente con la gasa, mientras que la otra persona usa el cauterizador. - Usando una combinación de pinzas quirúrgicas rectas y curvas, realice una disección contundente trabajando a lo largo del corte longitudinal en los músculos. Esto separará los vientres del trapecio, así como el músculo semiespinal capitus biventer subyacente.
- Corte cualquier fibra muscular persistente con un bisturí y continúe la disección contundente hasta que semispinalis capitus complexus se haga visible.
- Cortar los orígenes de los músculos trapecio y semiespinalis capitus biventer a lo largo de la cara posterior del cráneo. Sepáralos cuidadosamente longitudinalmente con el bisturí realizando una disección roma hasta que el semispinalis capitus complexus sea completamente visible.
- Retraiga los músculos trapecio y semiespinalis capitus biventer utilizando retractores autocontenedores.
- Donde los vientres del semispinalis capitus complexus se unen en la línea media, haga una incisión longitudinal con el bisturí de aproximadamente 1 cm de profundidad.
NOTA: Tenga en cuenta cualquier sangrado adicional aquí. El sangrado se puede controlar utilizando una combinación de hisopos de algodón y cauterización. - Usando pinzas quirúrgicas, realice una disección contundente trabajando a lo largo del corte longitudinal entre los vientres musculares hasta que el aspecto dorsal del atlas (IC) sea palpable.
- Cortar los orígenes de los músculos semiespinalis capitus complexus a lo largo de la cara posterior del cráneo y separarlo longitudinalmente de las vértebras subyacentes mediante bisturí y disección roma.
- Retraiga los músculos semiespinalis capitus complexus utilizando otro conjunto de retractores autocontenedores.
- Con un bisturí, retire cuidadosamente cualquier tejido restante que cubra la región donde el atlas se encuentra con la base del cráneo.
- Colocando un brazo debajo del cuello del animal y un dedo en la coyuntura del atlas y el cráneo, eleva simultáneamente la cabeza y flexiona el cuello mientras palpa con el dedo para revelar la cisterna magna usando la otra mano.
NOTA: La cisterna magna es reconocible cuando se palpa como una estructura elástica fuerte con una pequeña cantidad de rebote a medida que se libera presión con el dedo.
3. Canulación e inyección
NOTA: Este paso también requiere al menos dos personas y se lleva a cabo con la cabeza del animal elevada y el cuello flexionado.
- Asegúrese de que una persona eleve y flexione la cabeza y el cuello del animal mientras que la otra palpa para la cisterna magna tomando nota de su ubicación anatómica.
- Introducir lenta y cuidadosamente una cánula de 22 G a través de la duramadre y en la cisterna magna en un ángulo oblicuo con respecto al eje longitudinal.
NOTA: No inserte la cánula demasiado profunda, ya que esto puede causar daño al cerebro. Saber hasta dónde insertar la cánula viene con la experiencia en la comprensión de cómo se siente que la cánula perfore la duramadre. Esencialmente, al igual que la duramadre ha sido perforada, la cánula es lo suficientemente profunda como para una inyección de trazador exitosa. Esta profundidad es de aproximadamente 3-5 mm, pero diferirá según el tamaño o la edad del animal. La canulación exitosa debe ser inmediatamente evidente a través de la visualización de LCR claro y pulsátil que asciende por la cánula. Para obtener el mejor resultado, se recomienda practicar varias canulaciones de antemano en animales sacrificados para comprender la perforación dural. - Retire la aguja de la cánula y coloque una tapa en la cerradura.
- Primero, aplique superpegamento y un acelerador donde la cánula ingresa al tejido, seguido de la aplicación del cemento dental. Espere 5 minutos para que el cemento se endurezca.
- Retire con cuidado la tapa de la cánula y fije el extremo macho del grifo de la línea IV previamente preparado con una extensión de 10 cm, con el trazador, a la cánula.
- Inyecte lentamente el marcador a mano o utilizando una bomba de microinfusión a una velocidad de 100 μL/min. Retire el grifo de línea IV de 3 vías con una extensión de 10 cm y reemplácelo con la tapa. El trazador ahora debe ser visible pulsando en la base de la cánula (Video suplementario 1).
NOTA: Si se inyecta a mano, haga esto hasta que el trazador todavía esté visible en el eje de la cánula, aproximadamente 1-2 mm por encima de donde el cemento dental está cubriendo el eje. - Después de la inyección, coloque sacos de arena debajo del cuello para mantener un poco de flexión. La cabeza puede ser liberada, y el animal se deja en una posición prona en reposo.
- Suelte los retractores autocontenetivos y coloque los músculos como se encuentran antes. Junte la piel sobre los músculos con pinzas de toalla quirúrgicas.
- Cubra las abrazaderas de toalla y la incisión con una gasa y luego una manta para limitar la pérdida de calor.
- Permita que el trazador circule durante el tiempo deseado antes de sacrificar al animal por i.v. Inyección de pentobarbital (140 mg/kg). Confirmar la eutanasia por la ausencia de sonidos cardíacos tras la auscultación con un estetoscopio.
4. Extracción y procesamiento cerebral
- Usando un bisturí con 20 cuchillas, extienda la incisión dérmica longitudinal desde la cresta occipital hasta aproximadamente 7 cm por encima de la nariz.
- Refleja la piel que recubre el aspecto dorsal del cráneo usando el bisturí.
NOTA: Hay varias formas de cortar y eliminar el aspecto dorsal del cráneo de cerdo animal por animal. Lo que sigue es el procedimiento que ha funcionado con mayor frecuencia para este experimento. - Usando una sierra compacta de mano, haga un corte coronal en el cráneo, aproximadamente 3 cm por encima de las dos venas grandes que se ven saliendo del cráneo. Extienda a dos cortes verticales adicionales de los cortes coronales y dos cortes más para unir los cortes verticales en la línea media.
NOTA: Mantenga un agarre firme de la sierra al hacer los cortes óseos del cráneo, ya que tenderá a alejarse al primer contacto con el hueso o tejido, lo que puede provocar una lesión grave. - Asegúrese de que los cortes del cráneo estén a través de todo el grosor del hueso siguiendo con un martillo y un cincel estrecho (10 mm) a cada uno de los cortes.
- Usando el martillo, finalmente golpee un cincel ancho (25-30 mm) en el corte coronal. Con una persona apoyando la cabeza, asegúrese de que la otra persona aplique palanca en el cincel para abrir el cráneo dorsal.
- Una vez que se haya extraído el fragmento de cráneo dorsal, diseccione la duramadre suprayacente con tijeras quirúrgicas curvas.
- Use una espátula para cortar la médula espinal desde el cerebelo en el aspecto rostral. Luego proceda a guiar la espátula debajo del cerebro desde el frente, cortando los bulbos olfativos, la glándula pituitaria y los nervios craneales.
- Coloque la espátula detrás del cerebelo y aplique una buena cantidad de presión para desalojar el cerebro de la cavidad craneal, levantándolo cuidadosamente una vez suelto.
- Fijar inmediatamente todo el cerebro por inmersión tisular en paraformaldehído al 4% durante la noche.
NOTA: Después de este paso, es posible llevar a cabo la imagen de todo el cerebro utilizando un estereoscopio (Figura 1E). - Al día siguiente, haga rodajas coronales del cerebro con un cuchillo de salmón y fije las rodajas durante la noche mediante la inmersión tisular en paraformaldehído al 4%.
- Finalmente, coloque las rodajas en azida al 0,01% en PBS para almacenamiento a largo plazo.
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Representative Results
Una vez que el cerdo está inconsciente, se palpa y se marca su anatomía superficial, comenzando en la cresta occipital (OC) y trabajando hacia las vértebras torácicas (TV) y cada base de la oreja (EB). Es en esta línea que se realizan las incisiones dérmicas (Figura 1A). Las tres capas musculares que incluyen trapecio, semiespinalis capitus biventer y semiespinalis capitus complexus son resecadas y mantenidas abiertas por dos conjuntos de retractores autocontenedores para exponer la cisterna magna (CM) (Figura 1B). Luego, la cabeza se flexiona para abrir el espacio entre la parte posterior del cráneo y el atlas y facilitar el acceso al CM (Figura 1C). Una cánula de 18 G se inserta cuidadosamente 3-5 mm en el CM y se fija en su lugar tanto con súper pegamento como con cemento dental (DC). El trazador se puede inyectar a una velocidad fija. Una vez que se ha inyectado el marcador, la línea IV y la jeringa se reemplazan con una tapa de cánula (Figura 1C-D). Los músculos se vuelven a colocar en el lugar y el cerdo se cubre y se mantiene caliente durante el tiempo que circula el trazador. Después de la circulación, el animal es sacrificado y el cerebro se elimina rápidamente. Es posible generar imágenes macroscópicas cosidas de la superficie dorsal del cerebro, que facilitan proporcionar información detallada sobre los patrones de distribución del trazador en la superficie dorsal del cerebro a través de los surcos y fisuras (Figura 1E). Se pueden generar imágenes similares a partir de las superficies ventral y lateral del cerebro, donde se puede investigar la distribución del trazador en el lóbulo temporal (TL) y la fisura lateral (LF) (Figura 1E). También se puede utilizar un estereoscopio para producir imágenes de mayor aumento de la superficie del cerebro donde es posible ver el marcador en el PVS a lo largo de las arterias (Figura 1F-G). Las secciones macroscópicas del cerebro coronal, de aproximadamente 8 mm de espesor, se cortan con un cuchillo de salmón y proporcionan una mayor comprensión de la profundidad de la penetración del trazador en la fisura interhemisférica (IHS), así como la distribución del trazador subcortical en estructuras como el hipocampo (HPC) y el cuerpo estriado (STR), (Figura 1H).
La tinción inmunohistoquímica para AQP4 expresada en extremos astrocíticos, proteína ácida glial-fibrilar (GFAP) expresada a través de los astrocitos y actina del músculo liso (AME) ubicada alrededor de las arteriolas mostró que el marcador se localizó tanto dentro del PVS como se mueve hacia el parénquima cerebral (Figura 1I-M). La tinción de AQP4 y GFAP se utiliza para identificar astrocitos y, más específicamente, los procesos del pie de astrocito que forman la superficie externa del PVS, mientras que la lectina y GLUT-1 tiñen las células endoteliales que forman la superficie interna del PVS (Figura 1I-L). Al llevar a cabo estas tinciones para definir los límites de PVS, es posible identificar el trazador inyectado por LCR localizado en el espacio PVS. Esto apoya la noción de que el LCR obtiene acceso al cerebro giroencefálico a través de un extenso transporte de PVS que luego facilita la afluencia glinfática al parénquima cerebral. La tinción de AME identifica arterias y arteriolas al unirse a las células musculares lisas que se encuentran en las paredes arteriales y se puede usar para mostrar que la afluencia de PVS ocurre a lo largo de las arterias en lugar de las venas, lo que constituye la fisiología básica de la función glinfática normal (Figura 1M).
Figura 1. Cisterna magna canulación en cerdos. (A) Cerdo preparado antes del inicio de la cirugía y marcado donde se realizarán incisiones dérmicas a partir de la cresta occipital (OC) y luego posterior a las vértebras torácicas (TV) y lateral a cada base de la oreja (EB). (B) Cabeza en posición relajada con los músculos trapecio, semiespinalis capitus biventer y semiespinalis capitus complexus retraídos, exponiendo así la cisterna magna (CM). (C) Cabezal flexionado manualmente para aumentar el acceso a CM para canulación e inyección. (D) Imagen de primer plano de una cánula insertada en CM después de la inyección y fijada en su lugar con el cemento dental (DC). (E) Superficies cerebrales dorsales, ventrales y laterales, respectivamente, después de imágenes fluorescentes con imágenes de luz blanca estructural acompañantes. Las áreas de interés que son visibles en estas superficies incluyen la fisura interhemisférica (IHS), el lóbulo temporal (TL) y la fisura lateral (LF). (F) Imagen estructural de luz blanca de la arteria y las venas en la superficie del cerebro. (G) Imagen fluorescente de (F) que muestra la distribución del trazador a lo largo de la arteria superficial. (H) Las rodajas macroscópicas de las regiones cerebrales anterior y posterior muestran dispersión y distribución de trazadores bidimensionales en fisuras (LF, IHS) y estructuras subcorticales como el cuerpo estriado (STR) y el hipocampo (HPC). (I-J). Imágenes confocales que muestran el trazador en el PVS, limitado por células endoteliales teñidas con lectina internamente y AQP4 en procesos de pie de astrocito externamente. (K-L). Imágenes confocales que muestran el trazador en el PVS, limitado por células endoteliales internamente con procesos de pie de astrocito teñidos para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) visible formando un límite externo. (M) Imagen confocal que muestra el marcador en el PVS alrededor de una arteriola teñida para actina del músculo liso (AME) con trazador también visible en y alrededor, rodeando el parénquima cerebral. CM, cisterna magna; DC, cemento dental; EB, base de la oreja; GFAP: proteína ácida fibrilar glial; HPC: hipocampo; IHS: fisura interhemisférica; LF: fisura lateral; OLB: bulbo olfativo; OC: cresta occipital; STR: estriado; TL: lóbulo temporal; TV, vértebras torácicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video complementario 1: Pulsación del LCR después de la inyección del marcador. Video en primer plano de la cisterna magna después de la inyección del trazador. El marcador azul es visible en el cuello de la cánula pulsando al ritmo del LCR y es indicativo de una canulación e inyección exitosas. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
A continuación, se describe, un protocolo detallado para realizar la canulación directa de la cisterna magna en cerdos, incluyendo la preparación necesaria, procedimiento quirúrgico, infusión trazadora y extracción del cerebro. Esto requiere de alguien con experiencia y certificación para trabajar con animales grandes. Si se lleva a cabo correctamente, esto permite la entrega de moléculas deseadas con garantía directamente en el LCR, después de lo cual se pueden utilizar una serie de diferentes modalidades avanzadas de imágenes de luz para explorar la distribución del LCR y la función glinfática a alta resolución en un mamífero grande.
Es importante tener en cuenta que aunque este es el mismo procedimiento que la canulación cisterna magna en roedores, es un poco más desafiante y requiere varias horas de entrenamiento. Dicha capacitación incluye el manejo de grandes mamíferos en condiciones de laboratorio, una comprensión de la anatomía y el sistema musculoesquelético, específicamente en cerdos, y cierto grado de competencia en el uso de instrumentos quirúrgicos. Una vez cumplidos estos criterios, es posible llevar a cabo esta técnica, que hasta el momento tiene una tasa de éxito del 100% frente a una tasa de éxito del 80-90% en ratones. El punto más crítico para realizar el procedimiento correctamente, es elevar la cabeza y flexionar el cuello mientras se inserta la cánula y se infunde el trazador. Aunque el trazador se inyectó aquí a mano, se hizo de manera controlada de 100 μL por minuto. En ratones se inyectan típicamente 10 μL de trazador y al comparar directamente los tamaños cerebrales esto se traduciría en aproximadamente 2 mL en un cerdo de 50 kg6,11,18. Por lo tanto, la inyección de 500 μL de trazador fue de hecho un volumen conservador y no debería haber producido perturbaciones prolongadas en la presión intracraneal (PIC). Además, recientemente se ha demostrado que la función glinfática perivascular no es simplemente un artefacto de aumentos transitorios en la PIC, sino que persiste cuando la PIC se mantiene en la línea de base utilizando un método de jeringa dual, lo que refuerza aún más la noción de que estos hallazgos no reflejan artefactos de la PIC alterada19.
Esta no es la única técnica que se puede utilizar para realizar CMc en cerdos, y aunque es sustancialmente más invasiva, parece dar una infusión trazadora más precisa. Otra forma de realizar CMc en cerdos es acostándolos de lado en posición de recostado lateral y yendo a ciegas con una aguja espinal de 150 mm20. Aunque este era un método atractivo debido a su mínima invasividad, la tasa de éxito potencial se percibió como menor. Dado que la parte posterior de la cabeza del cerdo es plana y cm se encuentra muy profunda (10-12 cm) de la superficie, la aguja espinal tiene una larga distancia para viajar antes de penetrar en la CM, lo que limita la certeza de una canulación exitosa. Aparte de la gran distancia al CM, el diámetro del CM en sí es de solo unos 10 mm, lo que reduce aún más la posibilidad de una canulación exitosa. Por el contrario, al utilizar el método de CMc directo, es posible visualizar directamente la canulación y, por lo tanto, saber con certeza que ha tenido éxito y que los agentes se han entregado al LCR y no se han filtrado en el tejido blando circundante. Garantizar una canulación exitosa es importante para tales experimentos debido al alto costo de los cerdos, las instalaciones quirúrgicas y los trazadores fluorescentes, así como para minimizar el número de cerdos utilizados.
Las limitaciones de este método, aparte de la invasividad, es que el costo y el tiempo desalientan muchas repeticiones en comparación con los roedores. La primera cirugía realizada duró alrededor de 3 horas, pero actualmente se está realizando en aproximadamente 45 minutos. Esto representa una mejora significativa en el tiempo, sin embargo, para realizar una canulación en un ratón, se tarda menos de 5 minutos para un investigador experto, lo que significa que el tiempo real de cirugía al alcanzar la competencia sigue siendo 9 veces más largo que en ratones. Además, el cerebro grande significa que los tiempos de circulación del trazador en el cerdo son más extensos, por ejemplo, de 2 a 6 horas, mientras que en ratones un tiempo de circulación estándar es de 30 minutos. Aparte del alto costo del trazador, necesario en grandes volúmenes para el cerdo, el costo real del cerdo en sí, así como su alojamiento, anestésicos y el costo de usar un quirófano completo hacen que el costo final de este procedimiento para un cerdo sea 15 veces más caro que en un solo ratón. Un desafío adicional relacionado con el tiempo es el tiempo necesario para la extracción del cerebro después de la circulación del trazador. Informes anteriores han demostrado que algún movimiento del trazador a través de PVS persiste después de la eutanasia21. Esto hace que sea importante extraer cerebros, lo más rápido posible, para minimizar cualquier efecto de confusión de este fenómeno. Mientras que la extracción del cerebro del ratón solo equivale a unos pocos minutos, las extracciones del cerebro del cerdo toman aproximadamente 15-20 minutos de tiempo. El cerebro debe extirparse lo más rápido posible para limitar este efecto, pero con el grosor y la arquitectura del cráneo de cerdo es difícil reducir los tiempos de extracción actuales.
Aunque la canulación directa hace que el procedimiento sea bastante invasivo, la pérdida total de sangre solo promedió 100 ml por cirugía, lo que constituye una pérdida de menos del 3% del volumen total de sangre. Además, el animal recibe una infusión salina continua con los anestésicos y una vía intravenosa adicional de lactato de Ringers, mitigando el riesgo de hipovolemia.
Se necesitan estudios futuros para explorar la traducción de los impulsores fisiológicos glinfáticos identificados en ratones, así como la función glinfática en cerdos despiertos o naturalmente dormidos para eliminar el impacto de los anestésicos22,23. Para investigar el sueño natural o el estado de vigilia, será necesario adaptar el protocolo actual de modo que el trazador se pueda administrar a través de medios menos invasivos y al mismo tiempo mantener una alta tasa de éxito. Esto podría lograrse potencialmente mediante la realización de inyecciones de CM bajo fluoroscopia por tomografía computarizada, que se ha utilizado previamente para la punción lumbar en cerdos24. En el futuro, sería de gran interés combinar esta técnica con manipulaciones genéticas del canal de agua AQP4 para comprender su papel en la función glinfática en un mamífero grande. Al explorar el alcance total del sistema glinfático en un mamífero grande, el campo se acerca más a la comprensión de la función glinfática en humanos y cómo podría utilizarse terapéuticamente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Knut y Alice Wallenberg, Hjärnfonden, las Fundaciones Wenner Gren y la Fundación Crafoord.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M.
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, Clifton, N.J. (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I.
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D'Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
