Summary
Denna artikel presenterar ett steg-för-steg protokoll för den direkta kanyl implantation i cisterna magna av grisar.
Abstract
Det glymfatiska systemet är ett avfallsrensningssystem i hjärnan som förlitar sig på flödet av cerebrospinalvätska (CSF) i astrocytbundna perivaskulära utrymmen och har varit inblandad i clearance av neurotoxiska peptider som amyloid-beta. Nedsatt glymfatisk funktion förvärrar sjukdomspatologi i djurmodeller av neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers, vilket belyser vikten av att förstå detta clearance-system. Det glymfatiska systemet studeras ofta av cisterna magna cannulations (CMc), där spårämnen levereras direkt till ryggmärgsvätskan (CSF). De flesta studier har dock utförts på gnagare. Här visar vi en anpassning av CMc-tekniken hos grisar. Med hjälp av CMc hos grisar kan det glymfatiska systemet studeras med hög optisk upplösning i gyrencephalic hjärnor och därigenom överbrygga kunskapsgapet mellan gnagare och mänskliga glymfatiska.
Introduction
Cerebrospinalvätska (CSF) är en ultrafiltrat av blod som finns i och runt centrala nervsystemet (CNS)1,2. Förutom att ge flytkraft till hjärnan eller absorbera skadliga mekaniska krafter, spelar CSF också en central roll för att rensa metaboliskt avfall från CNS3. Avfallsfrigång underlättas av det nyligen karakteriserade glymfatiska systemet som tillåter det konvektiva flödet av CSF genom hjärnan parenkym via perivaskulära utrymmen (PVS), som omger genomträngande artärer3,4,5. Denna process har visat sig vara beroende av aquaporin-4 (AQP4), en vattenkanal som främst uttrycks på den astrocytiska endfeet, bunden till PVS4,6. Studien av det glymfatiska systemet uppnås genom både in vivo- och ex vivo-avbildning, med antingen avancerad ljusmikroskopi eller magnetisk resonanstomografi (MRI), efter införandet av en fluorescerande/radioaktiv spårämne eller kontrastmedel i CSF7,8,9,10,11.
Ett effektivt sätt att införa en spårämne i CSF utan att ådra sig skador på hjärnan parenkym är genom cisterna magna cannulation (CMc)12,13. En stor majoritet av alla glymfatiska studier har hittills utförts på gnagare och undvikits hos högre däggdjur på grund av CMc-invasiviteten kopplad till den praktiska enkelheten att arbeta med ett litet däggdjur. Dessutom tillåter mössens tunna skallar in vivo-avbildning utan behov av ett hjärnskålenfönster och möjliggör därefter en okomplicerad hjärnutvinning11,14. Experiment som utförts på människor har gett en värdefull makroskopisk in vivo-data om den glymfatiska funktionen, men förlitat sig på intratekal spårämnesinjektioner i den distala ländryggen och dessutom använda MRI som inte ger tillräcklig upplösning för att fånga mikroanatomin det glymfatiska systemet7,15,16 . Att förstå det glymfatiska systemets arkitektur och omfattning hos högre däggdjur är avgörande för dess översättning till människor. För att underlätta glymfatisk översättning till människor är det viktigt att tillämpa tekniker som utförs hos gnagare på högre däggdjur för att möjliggöra direkta jämförelser av det glymfatiska systemet mellan arter av ökande kognition och hjärnans komplexitet17. Gris och mänskliga hjärnor är gyrencephalic, har en vikt neuroarkitektur, medan gnagare hjärnor är lissencephalic, vilket har betydande skillnad mellan varandra. När det gäller den totala storleken är grishjärnor också mer jämförbara med människor, som är 10-15 gånger mindre än den mänskliga hjärnan, medan mushjärnor är 3 000 gånger mindre18. Genom att bättre förstå det glymfatiska systemet hos stora däggdjur kan det vara möjligt att använda det mänskliga glymfatiska systemet för framtida terapeutisk intervention i tillstånd som stroke, traumatisk hjärnskada och neurodegeneration. Direkt CMc hos grisar in vivo är en metod som möjliggör högupplöst ljusmikroskopi av det glymfatiska systemet i ett högre däggdjur. På grund av storleken på de svin som används är det dessutom möjligt att tillämpa övervakningssystem som liknar dem som används vid mänskliga operationer, vilket gör det möjligt att tätt dokumentera och reglera vitala funktioner för att bedöma hur dessa bidrar till den glymfatiska funktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla ingrepp genomfördes i enlighet med EU-direktivet 2010/63/EU och godkändes av Malmö-Lunds etiska kommitté för djurforskning (Dnr 5.8.18-05527/2019) och genomfördes enligt Vetenskapsrådets CODEX-riktlinjer.
1. Förberedelse
- Spårämne
- Förbered konstgjord CSF (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glukos, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
- Till 500 μL artificiell csf, tillsätt 10 mg albumin från bovin serum (BSA) konjugerat med Alexa Fluor 647 (BSA-647).
- Centrifugera vid 5 000 x g i 5 minuter och använd supernatanten.
- Kanyl
- Fäst en 1 ml spruta på den kvinnliga Luer-anslutningen av den intravenösa (IV) linjen, 3-vägs kran med 10 cm förlängning.
- Fäst en 18 G nål i den manliga änden.
- Öppna 3-vägs stopplåset för att möjliggöra kontinuitet från nålen till sprutan.
- Lossa försiktigt nålen och aspirera cirka 300 μL av saltlinjen i IV-linjen.
- Ta bort nålen från saltlösning och fortsätt att införa i lite luft för att skapa en liten luftbubbla (5-10 mm) i IV-linjen.
- Placera nålen i spårämnet och aspirera alla 500 μL av spårämnet. Saltlinjen i IV-linjen ska synligt separeras av en luftbubbla.
- Kassera nålen och stäng 3-vägs stopplåset.
- Djur
- Söva en gris genom intramuskulär (i.m.) injektion av tiletamin (3,75 mg/kg) och zolazepam (3,75 mg/kg) och dexmedetomidin (37,5 μg/kg). Vänta tills den blir medvetslös.
- Förbered en intravenös linje genom att föra in en 20 G kanyl i öronvenen.
OBS: Se till att kanylen är i venen genom att injicera 5-10 ml saltlösning genom kanylen. Om venen har missats kommer detta att märkas av litet ödem i öronvävnaden. - Intubera grisen för att säkerställa att andningshastigheten kan regleras under hela operationen.
OBS: Säkerställ framgångsrik intubering genom att trycka på grisens bröstkorg och bekräfta att med tvång utgången luft kommer ut ur intuberingsröret. - Fäst intuberingsröret i en ventilator inställd på en andningshastighet på 14 andetag/min.
- Anslut en pulsoximeter och manschett till svansen för att övervaka hjärtfrekvensen (HR), blodtrycket (BP) och syremättnaden (sats). Sätt in en rektaltermometer för att övervaka kärntemperaturen.
- Förbered en IV-påse ketamin (5 mg/kg/min), midazolam (0,25 mg/kg/min) och fentanyl (2,5 μg/kg/min), i saltlösning och börja ingjuta genom öronven vid cirka 2 droppar/s.
OBS: Under hela operationen kan infusionshastigheten behöva ökas eller minskas baserat på djurets vitala värden. - Med grisen i benägen position palperar du djurets baksida och nacke för att lokalisera och markera den occipitala krönet och ryggraden på de första bröstkotorna och basen av varje öra.
- Rita en rak linje mellan krönet och ryggkotorna längs den längsgående axeln. Rita två linjer från krönet till basen av varje öra genom att följa skallens botten (figur 1A).
- Kontrollera att djuret är i djup sömn genom att försiktigt spänna svansen och titta på frånvaron av en svansreflex.
OBS: Om djuret fortfarande är reflexivt, bör anestesiinfusionshastigheten ökas stegvis tills djuret inte längre uppvisar en reflex.
2. Kirurgi
OBS: Under hela operationen är det nödvändigt att ha minst en assistent för att suga den lätta blödningen och kauterisera eventuella avhuggna kärl.
- Använd en skalpell med ett # 21-blad, gör ett dermalsnitt längs längsgående linje ner till muskeln.
- Förläng två vinkelräta dermal snitt längre längs axlarna, 10-15 cm långa.
- Från de occipitala crestsna, gör dermal snitt längs linjen ner till basen av varje öra.
- Greppa hudhörnen som bildas vid den occipitala vapen med anatomiska tångar, separera försiktigt huden från den underliggande muskeln genom att lätt köra skalpellbladet över fascian och flytta från rostral till kaudala. När huden har resected efter var och en av de fem snitten, delar av trapezius musklerna bör sedan vara synliga.
- Gör ett längsgående snitt med skalpellen, ca 1 cm djup, där trapezius kommer ihop vid mittlinjen.
OBS: När du skär genom musklerna finns det en ökad benägenhet för blödning, så cauterizern ska vara redo. Om ett större kärl är avskuret, bör en person snabbt komprimera den med gasväven, medan den andra personen använder cauterizern. - Använd en kombination av raka och böjda kirurgiska tångar, utför trubbig dissekering som arbetar längs det längsgående snittet i musklerna. Detta kommer att separera trapezius magar, liksom den underliggande semispinalis capitus biventermuskeln.
- Avskilj alla ihållande muskelfibrer med en skalpell och fortsätt trubbig dissekering tills semispinalis capitus complexus blir synlig.
- Avskilj ursprunget till trapezius och semispinalis capitus biventermuskler längs den bakre aspekten av skallen. Separera dem försiktigt längsgående med skalpellen som utför trubbig dissekering tills semispinalis capitus complexus är fullt synlig.
- Dra tillbaka trapezius- och semispinalis-kapitudmusklerna med självhållande upprullningsdon.
- Där magen i semispinalis capitus complexus kommer samman i mittlinjen, gör ett längsgående snitt med skalpellen ca 1 cm djup.
OBS: Var medveten om eventuella ytterligare blödningar här. Blödning kan hanteras med en kombination av bomullspinne och cauterization. - Använd kirurgiska tång, utför en trubbig dissekering som arbetar längs det längsgående snittet mellan muskelmagnaten tills den dorsala aspekten av atlasen (CI) är påtaglig.
- Avskilj ursprunget till semispinalis kapitus complexus muskler längs den bakre aspekten av skallen och separera den längsgående från de underliggande ryggkotorna genom skalpell och trubbig dissekering.
- Dra tillbaka semispinalis capitus complexus muskler med en annan uppsättning självbehållande upprullningsdon.
- Använd en skalpell och ta försiktigt bort eventuell återstående vävnad som överlyssnar regionen där atlasen möter skallbasen.
- Placera en arm under djurets hals och ett finger vid tidpunkten för atlasen och skallen, höj samtidigt huvudet och böj nacken medan du palperar med fingret för att avslöja cisterna magna med den andra handen.
OBS: Cisterna magna är igenkännlig när palperas som en stark elastisk struktur med en liten mängd rebound som tryck frigörs med fingret.
3. Kannulation och injektion
OBS: Detta steg kräver också minst två personer och utförs med djurets huvud förhöjt och nacken böjd.
- Se till att den ena personen höjer och böjer djurets huvud och hals medan den andra palperar för cisterna magna som noterar dess anatomiska plats.
- För långsamt och försiktigt en 22 G kanyl genom duran och in i cisterna magna i en sned vinkel mot den längsgående axeln.
OBS: Sätt inte in kanylen för djupt, eftersom detta kan orsaka skador på hjärnan. Att veta hur långt man sätter in kanylen kommer med erfarenhet av att förstå hur det känns för kanylen att genomborra. I huvudsak, precis som duran har genomborrats, är kanylen sedan tillräckligt djup för en framgångsrik spårinjektion. Detta djup är ca 3-5 mm men kommer att skilja sig beroende på djurets storlek eller ålder. Framgångsrik kanyl bör vara omedelbart uppenbart genom visualisering av tydliga, pulsatila CSF stigande kanylen. För bästa resultat rekommenderas att öva flera cannulations i förväg i avlivade djur för att få en förståelse för hamburg piercing. - Dra tillbaka nålen från kanylen och placera ett lock på låset.
- Applicera först superlim och en accelerator där kanylen kommer in i vävnaden, följt av applicering av tandcementet. Vänta i 5 minuter tills cementet härdar.
- Ta försiktigt bort locket från kanylen och fäst den manliga änden av den tidigare förberedda IV-linjekranen med 10 cm förlängning, med spåraren, på kanylen.
- Injicera långsamt spårämnet för hand eller använd en mikroinfusionspump med en hastighet av 100 μL/min. Ta bort 3-vägs IV-linjekranen med 10 cm förlängning och byt ut den mot locket. Spårämnet ska nu vara synligt pulserande vid kanylens botten (Kompletterande video 1).
OBS: Om du injicerar för hand, gör detta tills spåraren bara är fortfarande synlig i kanylaxeln, cirka 1-2 mm ovanför där tandcementet täcker axeln. - Efter injektionen, placera sandsäckar under nacken för att bibehålla viss flexion. Huvudet kan sedan släppas, och djuret lämnas i en vilande benägen position.
- Släpp de självhållande upprullningsdonen och placera musklerna när de låg tidigare. För ihop huden över musklerna med hjälp av kirurgiska handduksklämmor.
- Täck handduksklämmor och snitt med gasväv och sedan en filt för att begränsa värmeförlusten.
- Låt spåraren cirkulera under önskad tid innan djuret avlivas med i.v. Pentobarbital injektion (140 mg/kg). Bekräfta dödshjälp genom frånvaro av hjärtljud vid auskultation med ett stetoskop.
4. Hjärnutvinning och bearbetning
- Använd en skalpell med 20-blad, förläng det längsgående hudsnittet från den occipitala krönet till cirka 7 cm över näsan.
- Reflektera huden som överlyssnar den dorsala aspekten av skallen med hjälp av skalpellen.
OBS: Det finns flera sätt att skära och ta bort den dorsala aspekten av grisskalle på djur-för-djur-basis. Vad som följer är det förfarande som har fungerat oftast för detta experiment. - Använd en handhållen kompakt såg, gör ett koronalt snitt i skallen, cirka 3 cm ovanför de två stora venerna som ses lämna skallen. Utöka till ytterligare två vertikala snitt från koronalskärningarna och ytterligare två snitt för att få ihop de vertikala snitten i mittlinjen.
OBS: Håll ett fast grepp om sågen när du gör skallbenets skärsår eftersom det tenderar att dra bort vid den första kontakten med benet eller vävnaden, vilket kan leda till en allvarlig skada. - Se till att skallskärningarna är genom hela bentjockleken genom att följa upp med en hammare och smal mejsel (10 mm) till var och en av snitten.
- Använd hammaren och slå slutligen en bred mejsel (25-30 mm) i koronalskärningen. Med en person som stöder huvudet, se till att den andra personen tillämpar hävstång på mejseln för att blinka öppna dorsala skallen.
- När dorsala skalle fragment har tagits bort, dissekera ut den övergående dura mater med böjd kirurgisk sax.
- Använd en spatel för att bryta ryggmärgen från lillhjärnan vid rostralaspekten. Fortsätt sedan att styra spatel under hjärnan framifrån, skära luktlökarna, hypofysen och hjärnskålen nerver.
- Placera spateln bakom lillhjärnan och applicera en hel del tryck för att lossa hjärnan från hjärnskålen och lyft försiktigt ut den när den är lös.
- Fixa omedelbart hela hjärnan genom vävnadssänkning i 4% paraformaldehyd över natten.
OBS: Efter detta steg är det möjligt att utföra hela hjärnavbildningen med hjälp av ett stereoskop (figur 1E). - Nästa dag, gör koronalskivor av hjärnan med en laxkniv och fixa skivorna över natten genom vävnadssänkning i 4% paraformaldehyd.
- Placera slutligen skivorna i 0,01% azid i PBS för långtidsförvaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När grisen är medvetslös palperas den och dess ytanatomi är markerad, med början vid occipital crest (OC) och arbetar mot bröstkotorna (TV) och varje öronbas (EB). Det är i linje med dessa linjer som dermal snitt görs (figur 1A). De tre muskellagren inklusive trapezius, semispinalis capitus biventer och semispinalis capitus complexus återförsluts och hålls öppna av två uppsättningar självhållande upprullningsdon för att exponera cisterna magna (CM) (figur 1B). Huvudet böjs sedan för att öppna upp utrymmet mellan baksidan av skallen och atlasen och underlätta åtkomsten till CM (figur 1C). En 18 G kanyl sätts försiktigt in 3-5 mm i CM och fixeras på plats av både superlim och tandcement (DC). Tracer kan sedan injiceras till en fast kurs. När spåraren har injicerats ersätts IV-linjen och sprutan med ett kanyllock (figur 1C-D). Musklerna sätts sedan tillbaka på platsen och grisen är täckt och hålls varm under den tid som spåraren cirkuleras. Efter cirkulationen avlivas djuret, och hjärnan avlägsnas snabbt. Det är möjligt att generera sydda makroskopiska bilder av hjärnans dorsala yta, vilket underlättar för att ge detaljerade insikter om fördelningsmönstren för spårämne på den dorsala hjärnytan över sulci och sprickor (figur 1E). Liknande bilder kan genereras från hjärnans ventrala och laterala ytor där spårämnesfördelningen kan undersökas i temporalloben (TL) och lateral spricka (LF) (figur 1E). Ett stereoskop kan dessutom användas för att producera högre förstoringsbilder av hjärnytan där det är möjligt att se spårämnet i PVS längs artärer (figur 1F-G). Makroskopiska koronala hjärnsektioner, cirka 8 mm tjocka, skärs med hjälp av en laxkniv och ger ytterligare inblick i djupet av spårämnespenetration i den interhemispheric sprickan (IHS), liksom subkortikal spårämne distribution i strukturer som hippocampus (HPC) och striatum (STR), (figur 1H).
Immunohistochemical färgning för AQP4 uttryckt vid astrocytisk endfeet, glia-fibrillary surt protein (GFAP) uttryckt i hela astrocyter och släta muskel aktin (SMA) ligger runt arterioles visade att tracer lokaliserade både inom PVS och flyttar in i hjärnan parenkyma (figur 1I-M). AQP4- och GFAP-färgning används för att identifiera astrocyter och mer specifikt astrocytfotprocesserna som bildar PVS yttre yta medan lektin och GLUT-1 färgar de endotelceller som bildar PVS inre yta (figur 1I-L). Genom att utföra dessa fläckar för att definiera PVS-gränserna är det möjligt att sedan identifiera CSF-injicerad spårämne lokaliserad till PVS-utrymmet. Detta stöder uppfattningen att CSF får tillgång till den gyrencephalic hjärnan via omfattande PVS transport som sedan underlättar glymfatisk tillströmning i hjärnan parenkym. SMA färgning identifierar artärer och arterioles genom att binda till släta muskelceller som finns i kranskärlens väggar och kan användas för att visa att PVS tillströmning sker längs artärer i motsats till vener, vilket utgör den grundläggande fysiologin för normal glymfatisk funktion (figur 1M).
Figur 1. Cisterna magna cannulation hos grisar. (A) Gris som förbereds före operationens början och markeras där hudsnitt kommer att utföras med början från occipital crest (OC) och sedan bakre till bröstkotor (TV) och laterala till varje öronbas (EB). (B) Gå i avslappnad position med trapezius, semispinalis capitus biventer och semispinalis capitus complexus muskler indragna, vilket exponerar cisterna magna (CM). (C) Huvudet böjs manuellt för att öka tillgången till CM för kannulation och injektion. (D) Närbild av en kanyl som sätts in i CM efter injektion och fixeras på plats med tandcementet (DC). (E) Dorsala, ventrala respektive laterala hjärnytor efter fluorescerande avbildning med åtföljande strukturella vita ljusbilder. Områden av intresse som är synliga på dessa ytor inkluderar den interhemispheric sprickan (IHS), temporalloben (TL) och lateral spricka (LF). (F) Strukturell vit ljusbild av artären och venerna på hjärnytan. G) Fluorescerande bild av (F) som visar spårämnesfördelningen längs ytartären. (H) Makroskopiska skivor från de främre och bakre cerebrala regionerna visar tvådimensionell spårämnesspridning och fördelning i sprickor (LF, IHS) och subkortikala strukturer som striatum (STR) och hippocampus (HPC). (I-J). Konfokala bilder som visar spåraren i PVS, avgränsad av lektinfärgade endotelceller internt och AQP4 på astrocytfotsprocesser externt. (K-L). Konfokala bilder som visar spårämnet i PVS, avgränsade av endotelceller internt med astrocytfotprocesser färgade för gliafibrillary acidic protein (GFAP) synligt bildar en yttre gräns. (M) Konfokal bild som visar spårämnet i PVS runt en arteriole fläckad för glatt muskel aktin (SMA) med spårämne också synlig i och runt, omger hjärnan parenkym. CM, cisterna magna; DC, dentalcement; EB, öronbas; GFAP, gliaflimmersyrat protein; HPC, hippocampus; IHS, interhemispheric sprickor; LF, sidosklyvning; OLB, luktlampa; OC, occipital vapen; STR, striatum; TL, temporallob; TV, bröstkotor. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande video 1: CSF-pulsering efter spårinjektionen. Närbild video av cisterna magna efter tracer injektion. Blå spårämne är synlig i kanylhalsen pulserar i rytmen av CSF och är vägledande för en framgångsrik cannulation och injektion. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri beskrivs ett detaljerat protokoll för att utföra den direkta cannulation av cisterna magna hos grisar, inklusive nödvändig förberedelse, kirurgiskt ingrepp, tracer infusion och extraktion av hjärnan. Detta kräver någon med erfarenhet och certifiering för att arbeta med stora djur. Om det utförs korrekt möjliggör detta leverans av önskade molekyler med säkerhet direkt i GSF, varefter en serie olika avancerade ljusavbildningsmetoder kan användas för att utforska CSF-fördelning och glymfatisk funktion vid hög upplösning i ett stort däggdjur.
Det är viktigt att notera att även om detta är samma procedur som cisterna magna cannulation hos gnagare, är det något mer utmanande och kräver flera timmars träning. Sådan utbildning omfattar hantering av stora däggdjur under laboratorieförhållanden, förståelse för anatomin och muskuloskeletala systemet, särskilt hos grisar, och viss grad av färdigheter i att använda kirurgiska instrument. När dessa kriterier har uppfyllts är det möjligt att utföra denna teknik, som hittills har en 100% framgångsgrad jämfört med en 80-90% framgångsgrad hos möss. Den mest kritiska punkten för att utföra proceduren korrekt är att höja huvudet och böja nacken medan du sätter in kanylen och infunderar spåraren. Även om spårämnet injicerades här för hand, gjordes det på ett kontrollerat sätt på 100 μL per minut. Hos möss injiceras vanligtvis 10 μL spårämne och när man direkt jämför hjärnstorlekar skulle detta översättas till cirka 2 ml hos en 50 kg gris6,11,18. Injektionen av 500 μL spårämne var därför i själva verket en konservativ volym och borde inte ha gett upphov till förlängda störtben vid intrakraniellt tryck (ICP). Dessutom har det nyligen visats att perivascular glymfatisk funktion inte bara är en artefakt av transienta ökningar i ICP men kvarstår när ICP upprätthålls vid baslinjen med hjälp av en dubbel spruta metod ytterligare stärka uppfattningen att dessa resultat inte återspeglar artefakter av ändrade ICP19.
Detta är inte den enda tekniken som kan användas för att utföra CMc hos grisar, och även om det är betydligt mer invasivt verkar det ge en mer exakt spårinfusion. Ett annat sätt att utföra CMc hos grisar är genom att ligga dem på sidan i lateral recumbency position och gå i blind med en 150 mm spinal nål20. Även om detta var en attraktiv metod på grund av dess minimala invasivitet, uppfattades den potentiella framgångsgraden vara lägre. Eftersom baksidan av grishuvudet är platt och CM sitter mycket djupt (10-12 cm) från ytan, har ryggradsnålen ett långt avstånd att resa innan cm tränger in, vilket begränsar säkerheten för framgångsrik cannulation. Bortsett från det stora avståndet till CM är diametern på SJÄLVA CM bara ca 10 mm, vilket ytterligare minskar risken för framgångsrik kannulation. Däremot, genom att använda den direkta CMc-metoden, är det möjligt att direkt visualisera kannulationen och därmed med säkerhet veta att den har varit framgångsrik och att agenterna har levererats till GSR och inte läckt ut i omgivande mjukvävnad. Att säkerställa framgångsrik cannulation är viktigt för sådana experiment på grund av de höga kostnaderna för grisar, kirurgianläggning och fluorescerande spårämnen, samt för att minimera antalet grisar som används.
Begränsningarna i denna metod, bortsett från invasiviteten, är att kostnaden och tiden avskräcker många upprepningar jämfört med gnagare. Den första operationen som utfördes tog cirka 3 timmar, men den utförs för närvarande på cirka 45 minuter. Detta representerar en betydande tidsförbättring, men för att utföra en kannulation i en mus tar det mindre än 5 minuter för en skicklig forskare, vilket innebär att den faktiska operationstiden vid uppnåelighet fortfarande är 9 gånger längre än hos möss. Dessutom innebär den stora hjärnan att spårcirkulationstiderna i grisen är mer omfattande, till exempel 2-6 timmar, medan hos möss är en standardcirkulationstid 30 minuter. Bortsett från den höga kostnaden för spårämnet, som behövs i stora volymer för grisen, gör den faktiska kostnaden för grisen själv samt dess hölje, bedövningsmedel och kostnaden för att använda en full operationssalek slutkostnaden för denna procedur för en gris 15 gånger dyrare än i en enda mus. En ytterligare tidsrelaterad utmaning är den tid det tar för hjärnuttag efter spårcirkulationen. Tidigare rapporter har visat att vissa förflyttningar av spårämnet genom PVS kvarstår efter dödshjälp21. Detta gör det viktigt att extrahera hjärnor, så snabbt som möjligt, för att minimera eventuella förvirrande effekter från detta fenomen. Medan musen hjärnan extraktion bara uppgår till några minuter, gris hjärnan extraktioner tar ungefär 15-20 minuter tid. Hjärnan bör avlägsnas så snabbt som möjligt för att begränsa denna effekt men med grisskalets tjocklek och arkitektur är det svårt att minska de nuvarande extraktionstiderna.
Även om direkt cannulation gör förfarandet ganska invasivt, var den totala blodförlusten endast i genomsnitt 100 ml per operation, vilket utgör en förlust av mindre än 3% av den totala blodvolymen. Dessutom får djuret en kontinuerlig saltlösningsinfusion med bedövningsmedel och en extra IV-linje av Ringers laktat, vilket minskar risken för hypovolemi.
Framtida studier behövs för att undersöka översättningen av de glymfatiska fysiologiska drivkrafter som identifierats hos möss, liksom glymfatisk funktion hos vakna eller naturligt sovande svin för att avlägsna effekten av bedövningsmedel22,23. För att undersöka den naturliga sömnen eller vakna tillståndet kommer det att vara nödvändigt att anpassa det nuvarande protokollet så att spårämne kan levereras via mindre invasiva medel samtidigt som en hög framgångsgrad bibehålls. Detta skulle potentiellt kunna uppnås genom att utföra CM-injektioner under datortomografi fluoroskopi, som tidigare har använts för ländkotor punktering hos grisar24. Framöver skulle det vara av stort intresse att kombinera denna teknik med genetiska manipuleringar av AQP4-vattenkanalen för att förstå dess roll i glymfatisk funktion i ett stort däggdjur. Genom att utforska den fulla omfattningen av det glymfatiska systemet i ett stort däggdjur, rör sig fältet närmare att förstå glymfatisk funktion hos människor och hur det kan användas terapeutiskt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse, Hjärnfonden, Wenner Grens stiftelser och Crafoordstiftelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M.
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, Clifton, N.J. (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I.
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D'Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
