Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

2D og 3D humant inducerede pluripotente stamcellebaserede modeller til at dissekere primær ciliuminddragelse under neokortikal udvikling

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer detaljerede protokoller til generering og karakterisering af 2D og 3D humant induceret pluripotent stamcelle (hIPSC) -baserede modeller for neokortikal udvikling samt komplementære metoder, der muliggør kvalitativ og kvantitativ analyse af primær cilium (PC) biogenese og funktion.

Abstract

Primære cilier (PC) er ikke-bevægelige dynamiske mikrotubulibaserede organeller, der stikker ud fra overfladen af de fleste pattedyrceller. De kommer ud af den ældre centriole under G1 / G0-fasen af cellecyklussen, mens de adskilles, når cellerne igen kommer ind i cellecyklussen ved G2 / M-fasegrænsen. De fungerer som signalhubs ved at detektere og transducere ekstracellulære signaler, der er afgørende for mange celleprocesser. I lighed med de fleste celletyper har alle neokortikale neurale stamceller og stamceller (NSPC'er) vist sig at have en pc, der giver dem mulighed for at fornemme og transducere specifikke signaler, der kræves til den normale cerebrale kortikale udvikling. Her leverer vi detaljerede protokoller til at generere og karakterisere todimensionelle (2D) og tredimensionelle (3D) cellebaserede modeller fra humane inducerede pluripotente stamceller (hIPSC'er) for yderligere at dissekere inddragelsen af pc under neokortikal udvikling. Især præsenterer vi protokoller til at studere pc-biogenesen og funktionen i 2D-neurale rosetafledte NSPC'er, herunder transduktion af Sonic Hedgehog (SHH) -vejen. For at drage fordel af den tredimensionelle (3D) organisation af cerebrale organoider beskriver vi en simpel metode til 3D-billeddannelse af in toto immunplettede cerebrale organoider. Efter optisk clearing muliggør hurtig erhvervelse af hele organoider påvisning af både centrosomer og pc på neokortikale forfædre og neuroner af hele organoidet. Endelig beskriver vi proceduren for immunsåbning og rydning af tykke fritsvævende organoidsektioner, der bevarer en betydelig grad af 3D-rumlig information og muliggør den højopløsningsopsamling, der kræves til detaljeret kvalitativ og kvantitativ analyse af pc-biogenese og funktion.

Introduction

Primære cilier (PC) er mikrotubuli-baserede organeller, der sanser og transducer en overflod af kemiske og mekaniske signaler fra det ekstracellulære miljø. PC er især den centrale organel til transduktion af pindsvinesignalvejen hos hvirveldyr1,2. Mens de fleste neurale celler længe har vist sig at have en pc, har denne organels bidrag til at forme centralnervesystemet længe været undervurderet. Undersøgelser af neokortikal udvikling har ført til opdagelsen af flere neurale stam- og stamceller (NSPC'er), der alle har en pc, hvis placering er blevet foreslået at være afgørende for bestemmelse af stamfaderskæbne3,4,5,6,7. PC har vist sig afgørende for cellemekanismer, der er nødvendige for normal cerebral kortikal udvikling, herunder NSPC-ekspansion og engagement8,9,10,11,12 samt apicobasal polaritet af radialt glialstillads, der understøtter neuronal migration13. Derudover kræves pc under interneuroner tangentiel migration til den kortikale plade14,15. Endelig er der foreslået en rolle for pc'en i etableringen af synaptiske forbindelser af neuroner i hjernebarken16,17. Alt i alt argumenterer disse resultater for en afgørende rolle for PC på store trin i cerebral kortikal udvikling18,19 og rejser behovet for at undersøge deres involvering i de patologiske mekanismer, der ligger til grund for anomalier i cerebral kortikal udvikling.

Nylige undersøgelser har i vid udstrækning forbedret vores forståelse af vigtige cellulære og molekylære forskelle mellem kortikal udvikling i humane og dyremodeller, hvilket understreger behovet for at udvikle menneskelige modelsystemer. Efter denne opfattelse repræsenterer humane inducerede pluripotente stamceller (hIPSC'er) en lovende tilgang til at studere sygdomspatogenese i en relevant genetisk og cellulær sammenhæng. Vedhæftende todimensionelle (2D) cellebaserede modeller eller neurale rosetter indeholder NSPC'er svarende til dem, der ses i den udviklende hjernebark, som bliver organiseret i rosetformede strukturer, der viser korrekt apicobasal polaritet20,21,22. Desuden tillader det tredimensionelle (3D) kultursystem generering af dorsale forhjerneorganoider, der rekapitulerer mange træk ved menneskelig cerebral kortikal udvikling23,24,25,26. Disse to komplementære cellebaserede modelleringsmetoder tilbyder spændende perspektiver til at dissekere inddragelsen af pc under normal og patologisk udvikling af hjernebarken.

Her giver vi detaljerede protokoller til generering og karakterisering af neurale rosetter og afledte NSPC'er samt dorsale forhjerneorganoider. Vi leverer også detaljerede protokoller til analyse af biogenese og funktion af pc, der er til stede på NSPC'er, ved at teste transduktionen af Sonic Hedgehog-vejen og analysere dynamikken i afgørende molekyler involveret i denne vej. For at drage fordel af 3D-organiseringen af cerebrale organoider oprettede vi også en enkel og omkostningseffektiv metode til 3D-billeddannelse af in toto immunplettede cerebrale organoider, der muliggør hurtig erhvervelse takket være et lysarkmikroskop af hele organoidet med høj opløsning, der gør det muligt at visualisere pc på alle typer neokortikale forfædre og neuroner i hele organoiden. Endelig tilpassede vi immunhistokemi på 150 μm fritsvævende sektioner med efterfølgende clearing og erhvervelse ved hjælp af resonansscanningskonfokalmikroskop, der muliggør billedoptagelse i høj opløsning, hvilket er nødvendigt for den detaljerede analyse af pc-biogenese og funktion. Specifikt tillader 3D-billeddannelsessoftware 3D-rekonstruktion af pc med efterfølgende analyse af morfologiske parametre, herunder længde, antal og orientering af pc samt signalintensitetsmåling af ciliære komponenter langs axonem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generering af 2D hIPS cellebaserede modeller af neokortikal udvikling

  1. Neural roset dannelse
    1. Start med hIPSC-kulturer, der huser store regelmæssige kolonier, der udviser mindre end 10% differentiering og ikke mere end 80% sammenløb.
    2. Skyl hIPSC'erne med 2 ml PBS.
    3. Tilsæt 2 ml NSPC-induktionsmedium suppleret med Rock-hæmmeren (NIM + 10 μM Y-27632).
    4. Dissekerer manuelt hver hIPSC-koloni fra en 35 mm skål ved hjælp af en nål til at skære hver koloni præcist i vandrette og lodrette retninger for at skabe et skakbrætmønster, der deler hver koloni i lige store klynger.
    5. Fjern kolonien ved hjælp af en celleskraber og overfør dem til en ultra-lav-fastgørelse 35 mm skål.
    6. Lad dem flyde natten over (ON) i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2, så de kan danne embryoide legemer (UB'er).
      BEMÆRK: Embryoide legemer (EB'er) defineres som flydende sfæroidklynger eller aggregater af hIPSC'er.
    7. EB'erne overføres til poly-L-ornithin/laminin (PO/lam)-belagte 35 mm fade i 2 ml NIM + 10 μM Y-27632.
    8. Daglig opdatering NSPC induktionsmedium (NIM uden Y-27632) indtil dannelsen af neurale rosetter, der tager cirka 12 til 14 dage. Tjek under mikroskopet.
      BEMÆRK: Efter dette trin kan neurale rosetter udvides, differentieres og behandles til immunfarvningsanalyse eller dissocieres for at få isolerede neurale stamceller og stamceller (NSPC'er).
  2. Neural rosetudvidelse og tidlig differentiering
    1. Skær neurale rosetter i et gitterlignende mønster med en nål og løsrive klyngerne ved hjælp af en celleskraber.
    2. Overfør rosetterne til en 4-brønds plade indeholdende PO/lambelagt glasdæksler (4-5 rosetter/brønd) i 0,5 ml NSPC-vedligeholdelsesmedium (NMM).
    3. Inkuber pladen i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
    4. Opdater NMM hver anden dag indtil dag 20.
    5. Fra dag 20 udtømte kulturneurale rosetter i 0,5 ml cytokin NMM for at muliggøre differentiering. Opdater mediet hver 2-3 dage.
    6. På dag 30 og dag 40 (10 eller 20 dages differentiering) skal du rette rosetterne med 0,5 ml 4% PFA, 20 min, RT.
  3. PC-biogenese og funktionsanalyse på isolerede NSPC'er
    1. NSPC dissociation
      1. Skær neurale rosetter fra trin 1.1.8 i et gitterlignende mønster med en nål og løsrive klyngerne ved hjælp af en celleskraber. Overfør cellerne til PO/lam-coatede 35 mm fade i 2 ml NMM og inkuber i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
      2. Opdater NMM hver anden dag indtil sammenløb (ca. 5-7 dage).
      3. Efter at have skrabet de store, klare celler, der omgiver neurale rosetter, skal du plukke dem manuelt og overføre dem til friske PO / lam-coatede 35 mm fade for at berige til NSPC'er og nedbryde ikke-neurale celletyper.
      4. Efter en eller to manuelle passager (gentag trin 1.3.1.3, hvis det er nødvendigt), der kræves for at fjerne alle forurenende celletyper, skal du fjerne mediet og skylle med PBS.
      5. Tilsæt 300 μL 0,05% trypsin og inkuber i 5 minutter ved 37 °C, indtil de fleste celler løsnes.
      6. Tilsæt 2 ml af mediet indeholdende 10% FBS (DMEM + 10% FBS) for at inaktivere trypsin. Saml cellesuspensionen i et 15 ml konisk rør. Pipetter forsigtigt cellesuspensionen op og ned tre gange for at bryde celleklumperne op.
      7. Centrifuge ved 300 x g i 5 min.
      8. Aspirer forsigtigt supernatanten og resuspend cellerne i NMN.
      9. Frø de dissocierede NSPC'er som enkeltceller (1 x 105 celler/cm2) i NMM på PO/lambelagte fade og inkuber dem i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
      10. Udvid NSPC'er i NMM ved at ændre mediet hver anden dag.
        BEMÆRK: NSPC'er sås ved høj densitet for at undgå differentiering.
    2. PC biogenese analyse
      1. Frø dissocierede NSPC'er ved 100.000 celler / cm2 og inkuberer dem i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i NMM i 2 dage.
      2. Aspirere mediet og sulte NSPC'er i cytokin udtømt medium (NSPC sultemedium, supplerende tabel 1) i 48 timer.
      3. Fix NSPC'er med 4% PFA i 20 min ved RT.
      4. Vask to gange med PBS i 5 minutter ved RT før immunfarvning.
    3. PC-funktionsanalyse: SHH-signalvej
      1. Frø dissocierede NSPC'er ved 100.000 celler / cm2 på PO / lambelagte 8-brønds kammerglider (300 μL) eller T25 skåle (5 ml) og inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i NMM i 2 dage.
      2. Sultede NSPC'er i NSPC-sultemedium (300 μL pr. brønd med 8-brønds kammerglider og 5 ml i T25-kolbe) i 48 timer.
      3. For at fremkalde SHH-vejen skal du inkubere NSPC'erne med sultemediet suppleret med rekombinant SHH (100 ng/ml) eller SAG (500 nM); (150 μL pr. brønd i et 8-brønds kammerglas og 2 ml i T25-kolbe) i 24 timer.
      4. Fix NSPC'er dyrket på 8-brønds kammerglider i 250 μL 4% PFA pr. brønd i 20 minutter ved RT og vask dem to gange med 250 μL PBS i 5 minutter ved RT før immunfarvningsanalyse.
      5. Fjern mediet og vask NSPC'er dyrket i T25-retter med PBS.
      6. Tilsæt 500 μL 0,05% trypsin og inkuber i 5 minutter ved 37 °C, indtil cellerne løsner sig.
      7. Tilsæt 2 ml medium indeholdende 10% FBS (DMEM + 10% FBS) for at inaktivere trypsin og opsamle cellesuspensionen i et 15 ml konisk rør.
      8. Centrifuge ved 300 x g i 5 minutter og forsigtigt aspirere supernatanten for at opnå NSPC-pellets, der kan kryokonserveres ved -80 ° C før RNA-ekstraktion og RT-PCR-analyse.

2. Generation af dorsale forhjerneorganoider

  1. Enkeltcellekultur af hIPSC'er
    1. Start med hIPSC-kulturer, der huser store regelmæssige kolonier, der udviser mindre end 10% differentiering, og som er blevet passeret næsten én gang. Sørg for, at cellerne ikke er mere end 80% sammenflydende.
    2. Vask kolonierne med 2 ml PBS.
    3. Tilsæt 500 μL Gentle Cell Dissociation Reagens (GCDR) og inkuber i 5 til 7 minutter ved 37 °C.
    4. Aspirer GCDR og tilsæt 2 ml mTeRS1 medium suppleret med 5 μM Y-27632.
    5. Pipetter cellerne forsigtigt op og ned 10 gange for at adskille alle kolonier i enkeltceller.
    6. Overfør cellerne på vitronectinbelagte fade og inkuber i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
      BEMÆRK: Udfør mindst 1 passage af hIPSC'erne ved hjælp af GCDR før differentieringseksperimentet for at tilpasse hIPSC'erne til enkeltcellekulturbetingelser.
  2. På dag 0 skal hIPSC'er tillades at danne embryonale kroppe i EB-medium, der indeholder en lav koncentration af FGF2 og en høj koncentration af stenhæmmer, der kræves for hIPSC-overlevelse. For at gøre det skal du følge nedenstående trin.
    1. Vask kolonierne med 2 ml PBS.
    2. Tilsæt 500 μL Gentle Cell Dissociation Reagens (GCDR) og inkuber i 5 til 7 minutter ved 37 °C.
    3. Aspirer GCDR og tilsæt 1 ml EB-medium suppleret med 50 μM Y-27632; Brug en 1 ml pipette til forsigtigt at løsne cellerne og overføre dem til et 15 ml konisk rør.
    4. Skyl igen med 2 ml EB-medium suppleret med 50 μM Y-27632, overfør de resterende celler til det 15 ml koniske rør. Tilsæt straks 3 ml EB-medium suppleret med 50 μM Y-27632 til det koniske rør og homogeniser forsigtigt opløsningen ved hjælp af en 5 ml pipette.
    5. Centrifugering af de dissocierede celler ved 100 x g i 5 minutter.
    6. Aspirer forsigtigt supernatanten og resuspend cellerne i 6 ml EB-medium suppleret med 50 μM Y-27632.
    7. Centrifugering af cellerne ved 100 x g i 5 min.
    8. Aspirer supernatanten og resuspend cellerne i 1 ml EB-medium suppleret med 50 μM Y-27632. Brug en 1 ml pipette til forsigtigt at adskille cellerne i en enkeltcellesuspension.
    9. Umiddelbart efter genoplivning af cellerne fortyndes og tælles dem.
    10. Fortynd det korrekte volumen cellesuspension (indeholdende 900.000 celler) i 30 ml EB-medium suppleret med 50 μM Y-27632 og 4 ng/ml bFGF og bland forsigtigt opløsningen.
    11. Plade 9.000 celler/brønd ind i en ultralav fastgørelse 96U plade (300 μL/brønd). For at undgå at forstyrre EB-dannelsen skal pladen inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 indtil dag 3 uden medium forandring.
  3. Neural induktion (Dual SMAD-hæmning)
    1. På dag 3 skal du sikre, at EB'er måler 300-400 μm og viser regelmæssige grænser. Hvis begge kriterier er nået, skal halvdelen af mediet (150 μL) udskiftes med induktionsmedium-1 indeholdende Dual SMAD-hæmmere, hvilket fører til lysning af EB'ernes kontur inden dag 6 til dag 7, hvilket indikerer neuroektodermal differentiering (supplerende tabel 2).
    2. På dag 4 skal du udskifte 3/4 af mediet (225 μL) med induktionsmedium-1.
    3. På dag 6 og dag 8: Opdater halvdelen af induktionsmediet-1 (150 μL).
  4. Organoid indlejring i kældermembranmatrix (dag 10)
    1. På dag 10 skal du integrere EB'er i vækstfaktorreduceret kældermembranmatrix (BMM).
      BEMÆRK: Fra dette trin skal du altid bruge steril saks til at skære åbningen af pipettespidserne for at undgå at beskadige organoiderne ved gentagen pipettering.
    2. Overfør først omkring 15-17 organoider i koniske rør. Lad EB'erne slå sig ned og fjern mediet. Der tilsættes 50 μL induktionsmedium-2, og de overføres til et mikrocentrifugerør indeholdende 100 μL BMM.
    3. Spred matrix-EB-blandingen på midten af en brønd i en ultra-lav fastgørelsesplade og adskil EB'erne for at forhindre dem i at smelte sammen.
    4. Lad BMM størkne i inkubatoren ved 37 °C i 45 minutter.
    5. Tilsæt 3 ml induktionsmedium-2 i hver brønd og læg pladen i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
      BEMÆRK: Sørg for, at denne procedure udføres så hurtigt som muligt, da BMM størkner ved stuetemperatur.
  5. Stationær kultur af organoider indlejret i kældermembranmatrix
    1. Dag 12, 14: Opdater induktionsmedium-2.
    2. Dag 16: Opdater induktionsmedium-2 og kontroller under et mikroskop udvidelsen af neuroepitelsløjfer.
  6. Kældermembranmatrix dissociation og kultur på en orbital shaker
    1. På dag 17 dissocieres organoider fra BMM ved at pibere op og ned 10 gange med en 5 ml pipette og overføre dem til differentieringsmedium-1 (uden vitamin A). Inkuber på en orbital shaker ved 80 o / min i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 for at forbedre ernæringsabsorptionen.
      BEMÆRK: Brug en anden inkubator til stationær kultur og kultur på en orbital shaker for at undgå vibrationer, der er skadelige for klæbende hIPS-cellevækst.
    2. Dag 19: Opdater differentieringsmedium-1.
    3. Dag 21: Skift differentieringsmedium-1 til differentieringsmedium-2 (med vitamin A).
    4. Fra dag 23 til dag 35: Opdater medium med differentieringsmedium-2 hver 2-3 dage.
    5. Fra dag 35 til dag 70: Opdater differentieringsmedium-2 med 1% BMM og opdater hver 2-3 dage.
    6. Saml organoiderne efter 28, 42 og 70 +/- 2 dages differentiering og fastgør dem natten over ved 4 ° C, i 5 ml 4% PFA på et 15 ml konisk rør.
    7. For yderligere i toto eller fritsvævende immunstaininganalyse skylles organoider derefter to gange i PBS og konserveres ved 4 ° C i PBS + 0,05% natriumazid.
    8. Til immunstaininganalyse på frosne sektioner nedsænkes 4% PFA faste organoider i 10 ml 30% saccharose ved +4 ° C ON (eller indtil organoider synker). Integrer dem i en frossen indlejringsmatrix, og opbevar dem ved -80 °C, indtil kryoskning.

3. I toto immunolabeling, clearing og lightsheet erhvervelse af dorsale forhjerneorganoider

  1. Fiksation
    1. Saml organoiderne i 6-brønds plader, fjern mediet, og fastgør dem med 2 ml 4% PFA ved 4 ° C natten over.
    2. Udfør tre vaske i 2 ml PBS ved stuetemperatur.
    3. Overfør organoiderne til 2 ml rør og opbevar ved 4 °C i 2 ml PBS + 0,05 % natriumazid.
  2. Permeabilisering
    1. Inkubere organoider i 1 ml PBS indeholdende 0,2% Triton X100 ved RT i 1 time. Gør dette to gange.
    2. Inkuber i 1 ml PBS indeholdende 0,2% Triton X100 og 20% DMSO ved 37 °C natten over.
    3. Inkuber i 1 ml PBS indeholdende 0,1% Tween20, 0,1% Triton X100, 0,1% Deoxycholat, 0,1% NP40 og 20% DMSO, ved 37 °C, natten over.
    4. Inkuber i 1 ml PBS indeholdende 0,2% Triton-X100 ved RT i 1 time. Gør dette to gange.
  3. Blokering og immunmærkning
    1. Bloker i 1 ml blokerende opløsning (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Donkey Serum,10% DMSO), ved 37 °C, ON.
    2. Inkuber med primære antistoffer fortyndet i 250 μL PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/ml Heparin, 5% DMSO og 3% Donkey Serum ved 37 °C i 2 dage.
    3. I 1 ml PBS med indhold af 0,2 % Tween20 og 0,1 μg/ml Heparin vaskes i 1 time ved 37 °C. Gør dette fire gange.
    4. Der vaskes i 1 ml PBS indeholdende 0,2 % Tween20 og 0,1 μg/ml Heparin natten over ved 37 °C.
    5. Inkuber med sekundære antistoffer fortyndet i 250 μL PBS indeholdende 0,2 % Tween 20, 0,1 μg/ml Heparin og 3 % æselserum ved 37 °C i 2 dage.
    6. I 1 ml PBS indeholdende 0,2 % Tween 20 og 0,1 μg/ml Heparin i 1 time vaskes på et hjul ved RT. Gør dette fire gange.
    7. Vask i 1 ml PBS indeholdende 0,2 % Tween 20 og 0,1 μg/ml Heparin natten over på et hjul ved RT.
    8. Vask i 1 ml PBS i 24 timer ved RT.
    9. Lager ved +4 °C i 1 ml PBS og 0,05 % natriumazid indtil clearing.
  4. Rydning i TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Inkuber organoiderne i 1 ml 30% TDE (3 ml TDE + 7 ml PBS) i 24 timer ved RT.
    2. Inkuber i 1 ml 60% TDE (6 ml TDE + 4 ml PBS) i 24 timer ved RT.
    3. Inkuber i 1 ml 80% TDE (8 ml TDE + 2 ml PBS) i 24 timer ved RT.
  5. Organoid indlejring før erhvervelse af lysark
    BEMÆRK: Brug et skræddersyet system; lavet med en 1 ml sprøjte med spidsen skåret med en skalpel.
    1. Forbered 100 ml 4% lavsmeltende agarose i 60% TDE-opløsning og alikvot i 2 ml rør. Spar ved +4 °C.
    2. Før organoidindlejringen forvarmes et rør indeholdende 1,5 ml 4% lavsmeltende agarose i 60% TDE i et vandbad ved 37 °C, indtil det flyder.
    3. I mellemtiden skal du forberede et specialfremstillet støbesystem lavet af en 1 ml sprøjte, hvis spids er afskåret ved hjælp af en skalpel.
    4. Pump i sprøjten 600 μL af gelopløsningen ved hjælp af stemplet.
    5. Prøven anbringes ved hjælp af en forstørret pipettespids, hvis åbning er skåret ved hjælp af en steril saks.
    6. Sprøjten fyldes med 400 μL gelopløsning, således at prøven placeres i den nederste tredjedel af sprøjten.
    7. Lad gelen polymerisere og opbevares i 80 % TDE-opløsning ved 4 °C beskyttet mod lys, indtil den erhverves.
    8. Til erhvervelse af lysark skal du bruge et 20x mål nedsænket i 80% TDE-opløsning tilsat i prøvekammeret for at gøre det muligt nøjagtigt at justere til brydningsindekset for clearingmetoden.
    9. Indsæt sprøjten, der indeholder den agaroseindlejrede organoid, i den største prøveholder, der er beregnet til at rumme en 1 ml sprøjte, hvis stempel kan betjenes til at placere organoidet foran målet.
      BEMÆRK: Erhvervelse af lysark af en hel organoid tager cirka 5 til 10 minutter.

4. Immunfarvning og rydning af fritsvævende sektioner af dorsale forhjerneorganoider

  1. Fiksering, indlejring af agarose og sektionering af organoiderne
    1. Saml organoider efter 28, 42 og 70 +/- 2 dages differentiering i en 6-brønds plade og fastgør natten over ved 4 ° C i 2 ml 4% PFA.
    2. Skyl to gange i 2 ml PBS og spar ved 4 °C i 2 ml PBS + 0,05 % natriumazid.
    3. Integrer de faste organoider i 4% lavsmeltende agarose i en plastindlejringsform (7 x 7 mm). Fjern forsigtigt agaroseblokken fra plastformen og lim den på vibratomtrinnet.
    4. Sektion de indlejrede organoider ved hjælp af et vibratom for at opnå 150 μm fritsvævende sektioner overført i en brønd i en 24-brønds plade indeholdende 500 μL PBS ved hjælp af en pensel for at undgå at beskadige sektionerne.
      BEMÆRK: Lavsmeltende agarose anbefales, da smeltetemperaturen kun er ca. 60 °C. Forbered 4% lavsmeltende agarose i PBS-opløsning og lad den afkøle lige over 37 °C i et vandbad inden indlejring af organoider.
  2. Permeabilisering, blokering og immunsådning
    1. Inkuber sektionerne i 500 μL PBS indeholdende 0,3% Triton X100, ved RT, under omrøring, i 20 minutter. Gør dette tre gange.
    2. Inkuber sektionerne i 500 μL PBS indeholdende 0,3% Triton X100 og 5% fedtfri mælk, ved RT, under omrøring, i 2 timer.
    3. Inkuber sektionerne i 250 μL primær antistofopløsning (PBS + 0,3 % Triton X100 + 1 % fedtfri mælk) under omrøring ved +4 °C natten over.
    4. Sektionerne vaskes i 500 μL PBS ved RT under omrøring i 20 minutter. Gør dette fire gange.
    5. Inkuber sektionerne i 250 μL sekundær antistofopløsning (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% fedtfri mælk) ved RT, under omrøring, i 2 timer.
    6. Sektionerne vaskes i 500 μL PBS ved RT under omrøring i 20 minutter. Gør dette fire gange.
    7. Sektionerne opbevares i 500 μL PBS ved +4 °C, indtil de ryddes.
  3. Rydning i TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Inkuber sektionerne i 500 μL på 30% og 60% TDE i 1 time hver ved RT og derefter i 500 μL 80% TDE natten over ved RT.
    2. De ryddede sektioner opbevares i 500 μL 80 % TDE indtil erhvervelsen ved +4 °C.
  4. Montering af fritsvævende sektioner inden anskaffelse med resonansscanning konfokal
    1. Monter en fritsvævende sektion i et forseglet kammer, der gør det muligt at vedligeholde prøven i 80% TDE-opløsning og designet til at tilpasse sig på et motoriseret XY-trin af konfokale mikroskoper.
    2. Sæt et rundt dækslip i kammersystemet.
    3. Overfør forsigtigt den ryddede immunplettede sektion ved hjælp af en pensel.
    4. Fyld kammeret med 80% TDE-opløsning.
    5. Tilføj to standard coverlips plus en anden rund dækseddel og en silikoneforsegling.
    6. Skru på kammerets skruering for at forsegle systemet perfekt.

5. Lysark og resonansscanning konfokal analyse

  1. Behandle lysark og resonansscanningsanskaffelser ved hjælp af software, der muliggør 3D-visualisering og analyse af hele den immunplettede prøve.
    BEMÆRK: Sådan software gør det muligt hurtigt at åbne enorme data for nemt at lave snapshots og animationer. Det giver mulighed for at flytte prøven i forskellige retninger og generere 2D-visninger takket være et 2D-udsnitsværktøj i forskellige retninger, f.eks. XY og YZ.
  2. Til automatisk påvisning af både centrosomer og primære cilier skal du bruge en spotguide, der gør det muligt at kvantificere deres antal under patologiske versus kontrolforhold.
  3. Til 3D-rekonstruktion af pc'en, der muliggør præcis måling af deres længde, skal du bruge en filamentguide til manuelt at rette pc'ens startpunkt, og softwaren bruger fluorescenssignalet til at rekonstruere pc'en præcist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

2D hIPS cellebaserede modeller til undersøgelse af primær ciliumbiogenese og funktion
Den protokol, der er beskrevet her, er blevet tilpasset fra tidligere offentliggjorte undersøgelser20,21,22. Denne protokol tillader generering af neurale rosetstrukturer, der indeholder neokortikale forfædre og neuroner svarende til dem, der ses i den udviklende neocortex. Detaljeret validering kan udføres ved konventionel immunstaininganalyse ved hjælp af specifikke beslutningstagere3. For eksempel bør apikale forfædre (AP) dobbeltfarves med SOX2 og PAX6, mellemliggende forfædre (IP) afsløres ved TBR2 / EOMES-farvning, og tidligt fødte neokortikale neuroner afsløres ved CTIP2-farvning (figur 1A-C). Sådanne neurale rosetlignende strukturer modellerer interkinetisk nuklear migration (INM) af AP, der kan visualiseres ved immunfarvning med antistoffer hævet mod phospho-vimentin, som pletter mitotiske kerner og TPX2, der pletter den mitotiske spindel. Disse markører gør det derfor muligt at analysere flere karakteristika ved AP, herunder INM med celledeling, at finde sted apikalt omkring det centrale lumen (figur 1D,D') samt opdelingstilstanden bestemt ved at måle vinklen mellem delingsplanet og den apikale overflade. Endelig kan ciliogenese analyseres ved immunfarvning med antistoffer hævet mod PCNT, som pletter PC's basale krop, og ARL13B, der pletter axonem. På sådanne rosetstrukturer strækker PC sig fra AP'ernes apikale pol ind i det centrale lumen i hver ventrikellignende region (figur 1E,E'), mens de også stikker ud fra CTIP2+ neuroner (figur 1E'').

Dissociation af disse rosetstrukturer gør det muligt at opnå isolerede NSPC'er dyrket på poly-L-ornithin/lamininbelagte dyrkningsplader i NMM med høj densitet for at muliggøre opretholdelse af en stabil og udvidelig population af NSPC'er i mindst 15 passager uden at akkumulere karyotypeabnormiteter21,27. For at analysere pc-biogenese dyrkes dissocierede NSPC'er til sammenløb og sultes i 48 timer. Immunstainingsanalyser ved hjælp af antistoffer hævet mod pc-markører viser, at disse NSPC'er har PC (figur 2A). Ved at kombinere to komplementære open source-værktøjer, Ilastik, et maskinlæringsbaseret billedanalyseværktøj, der er nyttigt til pc-segmentering28 og CiliaQ, en Fiji/ImageJ-plugin-pakke29, der muliggør 3D-rekonstruktion af pc fra 3D-konfokale billedstakke, kan flere strukturelle parametre let evalueres, herunder antallet af pc'er og deres længde.

PC-funktionen af NSPC'er kan også evalueres ved at teste transduktionen af Pindsvinets signalvej. For at vurdere transduktionen af SHH-signalvejen sultes NSPC'er i 48 timer og behandles med rekombinant SHH (rSHH) eller en udjævnet agonist (SAG) i 24 timer. Ved hjælp af antistoffer rejst mod GPR161, SMO og GLI2 tillader immunofluorescerende (IF) analyse at teste handel med disse vigtige SHH-signalaktører langs pc'en, hvor GPR161 normalt forlader pc'en, mens GLI2 og SMO akkumuleres i pc'en som reaktion på SHH-vejaktivering (figur 2C-D). Analyse af 3D-konfokale billedstakke ved hjælp af CiliaQ-værktøjer gør det muligt at kvantificere GPR161-udgang fra pc'en samt GLI2- og SMO-akkumulering i pc'en efter SHH-vejaktivering (figur 2F-G). Derudover viser semi-kvantitativ RT-PCR-analyse på mRNA ekstraheret fra rSHH- eller SAG-behandlede NSPC'er induktion af to SHH-målgener, GLI1 og PTCH1, der attesterer for normal SHH-signaltransduktion i NSPC'er afledt af kontrol-hIPSC'er (figur 2B).

Samlet set reproducerer 2D-cellebaserede modeller til udvikling af dorsal forhjerne klart flere aspekter af normal hjernebarkudvikling og repræsenterer lovende værktøjer til at dissekere PC-associerede mekanismer, der ligger til grund for anomalier i neokortikal udvikling ved hjælp af kontrol versus patient hIPSC'er, der huser mutationer i gener, der er ansvarlige for menneskelige udviklingsmæssige anomalier i hjernebarken.

3D hIPS cellebaserede modeller til undersøgelse af primær ciliuminddragelse under neokortikal udvikling
Den protokol, der er beskrevet her (figur 3A), er blevet tilpasset fra tidligere offentliggjorte protokoller23,24,25,26,30 og testet med succes på fem forskellige kontrol-hIPSC-linjer. Det tillader generering af hIPSC-afledte dorsale forhjerneorganoider, der stiger i størrelse over tid, mens de danner store neuroepitelsløjfer (figur 3B). Immunolabelingsanalyse enten på organoidkrøosektioner (kryostat, 20 μm), fritsvævende sektioner (vibratom, 150 μm) eller in toto kan udføres til kvalitetskontrol. På dag 28 ± 2 består organoider af stratificerede neuroepitelsløjfer, der co-udtrykker den neurale stamfadermarkør SOX2 og den dorsale forhjernemarkør PAX6, der attesterer for dorsal forhjerneidentitet. På dag 42 ± 2 (6 ugers differentiering) skal disse sløjfer vise en mere kompleks stratificeret organisation. Fra den apikale til den basale overflade af disse sløjfestrukturer kan en ventrikulær zone (VZ)-lignende region med SOX2/PAX6-positive apikale radiale glialstamceller (aRG) afgrænses såvel som en subventrikulær zone (SVZ)-lignende region med TBR2-positive mellemliggende forfædre (IP'er) og en kortikal plade (CP)-lignende region indeholdende CTIP2-positive tidligt fødte neokortikale neuroner (figur 3C, E). Den apikale molekylære polaritet af aRG kan evalueres ved den apikale berigelse på den ventrikulære overflade af ZO-1 og N-CADH (figur 4A, video 1). ARG-stamcelledivisionsegenskaberne kan evalueres ved hjælp af TP2X- og P-VIM-markører til analyse af INM, der normalt fører til justering af aRG-mitotiske kerner på den ventrikulære overflade af de kortikale sløjfer (figur 4B, video 2). En sådan immunmærkning tillader også måling af divisionsvinklen for at evaluere symmetrisk versus asymmetrisk opdelingstilstand for aRG. P-Vim-positive forfædre kan også observeres i den SVZ-lignende region, der huser en unik basal proces, der strækker sig til den basale overflade, der minder om ydre radial glia (oRG eller basal radial glia, figur 4C, video 2). Mens de er fraværende fra dag 42 organoider, bør SATB2 positive senfødte neuroner detekteres fra dag 70 (10 ugers differentiering) (figur 3D, F), der attesterer in vivo-lignende timing af neokortikal neuronal differentiering.

Immunolabeling eksperimenter ved hjælp af basallegemet (gamma Tubulin) og axonem (ARL13B) markører tillader visualisering af pc på 20 μm kryosektioner (figur 3G,H). For at drage fordel af 3D-organisationen af dorsale forhjerneorganoider kan helmonteret immunfarvning udføres. Let ark erhvervelse af sådanne in toto immunplettede og ryddede organoider muliggør påvisning af både centrosomer og PC på alle NSPC-typer såvel som på neokortikale neuroner (Video 3). For at udføre mere nøjagtige analyser af PC-biogenese kan der desuden udføres immunohistokemianalyse på fritsvævende tykke sektioner (150 μm) af dorsale forhjerneorganoider. Efter rydning kan sådanne sektioner erhverves ved hjælp af et 40x (NA 1.3) eller 63x (NA 1.4) oliemål for et omvendt resonans hvidt lys konfokal lasermikroskop, hvilket gør det muligt at forbedre opløsningen, samtidig med at 3D-rumlig information om organoider bevares. Et sådant laserscanningskonfokalmikroskop muliggør hurtig erhvervelse af tykke sektioner med en præcis og fleksibel excitation og detektion uden interferens (Video 4). Flere strukturelle parametre for pc kan evalueres, herunder pc-nummer, længde og orientering, ved hjælp af 3D-billedbehandlingssoftware. Dedikerede open source, frit tilgængelige værktøjer som Ilastik28, et maskinlæringsbaseret billedanalyseværktøj samt CiliaQ-plugin-pakken på Fiji / ImageJ29 er yderst nyttige til automatisk pc-segmentering, der muliggør efterfølgende kvalitativ og kvantitativ analyse af pc-biogenese og funktion i kontrol versus patologiske tilstande.

Figure 1
Figur 1: Generering og karakterisering af 2D neurale rosetter. Immunohistokemisk karakterisering af neurale rosetstrukturer ved hjælp af (A) SOX2- og PAX6-antistoffer til påvisning af AP, (B) TBR2 / EOMES til at afsløre IP og (C) CTIP2 til at plette tidligt fødte neokortikale neuroner. Prolifererende AP påvises med phospho-vimentin- og TPX2-antistoffer og er placeret på den apikale overflade (D,D'). PC afsløres ved dobbelt immunstaining med PCNT- og ARL13B-antistoffer. PC strækker sig fra hver AP ind i det centrale lumen i hver roset, mens de også detekteres på IP og tidligt fødte neuroner (E, E ', E ''). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Isolerede NSPC'er afledt af 2D neurale rosetter har funktionel pc. Dissociation af 2D-neurale rosetter giver anledning til isolerede NSPC'er, der huser PC efter sult i 48 timer som afsløret af ARL13B og PCNT immunostaining (A). NSPC'er har funktionel pc som afsløret ved RT-PCR-kvantificering af to SHH-målgener GLI1 og PTCH1 efter sult i 48 timer og efterfølgende aktivering af vejen ved behandling med rekombinant SHH (rSHH) i 24 timer. GLI1- og PTCH1-ekspressionsdata blev udført i tre eksemplarer og normaliseret til ACTB-ekspressionsdata. Data blev analyseret med 2-ΔΔCt-metoden og præsenteret som relativ ekspression ± SEM (Mann Whitney-test) (B). IF-analyse på udsultede NSPC'er med (D) eller uden (C) rSHH-behandling for at teste dynamikken hos to afgørende aktører i SHH-signalvejen, GLI2 og GPR161, som henholdsvis akkumulerer eller forlader pc'en efter SHH-vejaktivering. Ved at kombinere Ilastik- og CiliaQ-værktøjer til analyse af konfokale billeder blev GPR161 (F) og GLI2 (G) signalintensitet inden for pc sammenlignet i +/- rSHH-behandlede NSPC'er. ARL13B-farvning blev anvendt til pc-segmentering, og som forventet var pc-længden uændret i +/- rSHH-behandlede NSPC'er (E). Data opsummeres i boks- og whisker-plots (middelværdier ± SEM). p < 0,0001 (Mann Whitney test). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Generering og karakterisering af dorsale forhjerneorganoider. A) Skematisk oversigt over protokollen til generering af dorsale forhjerneorganoider. (B) Repræsentative lysfeltbilleder af organoider på dag 1, 3, 7, 24 og 42 af differentiering. Konfokale billeder af 20 μm kryosektioner af organoider på dag 42 (C) og 70 (D) efter immunfarvning med SOX2-, TBR2- og CTIP2-antistoffer, der afgrænser henholdsvis den ventrikulære zone (VZ), den subventrikulære zone (SVZ), der indeholder TBR2-positiv IP, og den præpladelignende region (CP), der indeholder CTIP2-positive tidligfødte neokortikale neuroner. Konfokale billeder af 20 μm kryosektioner af organoider på dag 42 (E) og 70 (F) efter immunfarvning med PAX6-, CTIP2- og SATB2-antistoffer, der viser udseendet af SATB2-positive senfødte neuroner på dag 70. Konfokale billeder af 20 μm kryosektioner af en organoid på dag 42 efter immunfarvning med ARL13B- og PCNT-antistoffer, der afslører PC ved den apikale pol af radiale glial-forfædre (G), mens de også er til stede på CTIP2-positive neuroner (H). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: 3D-billeddannelse af dorsale forhjerneorganoider. (A) Let arkopkøb af en hel dorsal forhjerneorganoid (dag 42) farvet med PAX6-, N-CADH- og CTIP2-antistoffer, der viser de flere neuroepitelsløjfer med PAX6-positive radiale glial-forfædre, der udviser korrekt apicobasal polaritet som afsløret ved akkumulering af N-Cadherin på deres apikale side og CTIP2-positive tidligfødte neokortikale neuroner, der afgrænser en præpladelignende region. (B) Erhvervelse af lysark af en hel dorsal forhjerneorganoid (dag 42) farvet med TPX2-, P-Vim- og CTIP2-antistoffer, der illustrerer interkinetisk nuklear migration af ventrikulære radiale glialforfænomer. (C) Zoom på lysarkanskaffelsen af en hel dorsal forhjerneorganoid (dag 42) farvet med TPX2- og P-Vim-antistoffer, der viser en stamfader, der udvider en unik basal proces og lokaliseres i den subventrikulære zone, der minder om en ydre radial glialstamfader. (D) Resonansscanner erhvervelse af en 150 μm sektion af en dorsal forhjerneorganoid (dag 42) farvet med PCNT- og ARL13B-antistoffer, der viser PC i NSPC'er og neokortikale neuroner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Generering og karakterisering af 2D og 3D hIPS cellebaserede modeller af dorsal forhjerneudvikling for at dissekere pc-involvering i patofysiologien af cerebrale kortikale anomalier. hIPS-celler får lov til at danne embryoide kroppe (EB'er) i plader med lav vedhæftningskultur og inkuberes derefter til et induktionsmedium indeholdende dobbelte SMAD-hæmmere for at inducere neuroektodermal differentiering. Vedhæftning af EB'er i PO / lam-coatede retter tillader generering af 2D neurale rosetstrukturer, mens den fritsvævende kultur af EB'er med efterfølgende indlejring i BMM tillader generering af dorsale forhjerneorganoider. Tilbagetrækning af mitogene faktorer fra klæbende neuralt rosetmedium fremmer begyndelsen af neurogenese, der kan testes ved IF-analyse. Dissociation af klæbende neurale rosetter tillader generering af isolerede NSPC-kulturer, der er nyttige til pc-biogenese og funktionsanalyse. Dorsale forhjerneorganoider opsamles efter 4, 6 eller 10 ugers differentiering og fastgøres til efterfølgende immunfarvningsanalyse enten i toto, på 150 μm tykke sektioner eller 20 μm kryosektioner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: Let ark erhvervelse af en hel dorsal forhjerne organoid (dag 42) immunfarvet med PAX6, CTIP2 og NCADH antistoffer. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: Let ark erhvervelse af en hel dorsal forhjerne organoid (dag 42) immunfarvet med TPX2, P-VIM og CTIP2 antistoffer. Klik her for at downloade denne video.

Video 3: Let ark erhvervelse af en hel dorsal forhjerne organoid (dag 42) immunfarvet med PCNT og ARL13B antistoffer. Klik her for at downloade denne video.

Video 4: Resonansscanning konfokal erhvervelse af en 150 μm sektion af en dorsal forhjerneorganoid (dag 42) immunfarvet med ARL13B og PCNT antistoffer. Klik her for at downloade denne video.

SUPPLERENDE FILER: Klik her for at downloade tabellerne.

Supplerende tabel 1: Opskrift på de medier, der anvendes til generering af 2D-neurale rosetter og NSPC'er.

Supplerende tabel 2: Opskrift af de medier, der anvendes til generering af dorsale forhjerneorganoider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PC betragtes nu som nøgleorganeller, der regulerer afgørende trin under normal cerebral kortikal udvikling18,19,31, herunder NSPC-udvidelse og engagement8,9,10,11,12 samt neuronal migration13,14 og synaptogenese16,17 . Ud over analyse i dyremodeller eller humant føtalt hjernevæv er generering af meget innovative og relevante patientafledte hIPSC-baserede modeller for neokortikal udvikling afgørende for at dissekere pc'ens rolle under både normal og patologisk cerebral kortikal udvikling.

Den 2D hIPSC-baserede modelleringsprotokol, der er beskrevet her, blev tilpasset fra tre store publikationer20,21,22. Neuroepiteldifferentiering induceres ved dobbelt SMAD-hæmning ved anvendelse af små molekylehæmmere af activin/nodal (SB-431542) og BMP (LDN-193189) veje22. Celler er organiseret i rosetformede strukturer, der indeholder NSPC'er såvel som neokortikale dybe lagneuroner efter 20 dages differentiering. Derudover viser disse rosetlignende strukturer korrekt apicobasal polaritet, interkinetisk nuklear migration af apikale forfædre samt pc, der strækker sig fra alle NSPC'er og neuroner. Efter dissociation af disse rosetstrukturer opnås en homogen og stabil population af kortikale forfædre21. Når de dyrkes til sammenløb og sultes i 48 timer, har de kortikale forfædre pc, for hvilken morfologien, antallet og længden let kan analyseres ved at kombinere Ilastik28 og CiliaQ28,29 plugin-pakke på Fiji / ImageJ. Ved at bruge cytokiner til at inducere SHH-signalvejen kan PC-funktionen desuden også bruges af IF til at teste dynamikken i afgørende signalvejsaktører langs pc'en, såsom GLI2, SMO og GPR161. Derudover muliggør semi-kvantitative RT-PCR-assays test af induktion af SHH-målgenekspression, herunder GLI1 og PTCH1, som reaktion på SHH-vejaktivering. Andre signalveje, der er afhængige af pc-funktionen, bør også testes, herunder WNT- og IGF-veje2,32,33. For at konkludere om denne 2D-modelleringsmetode, som klart gengiver flere aspekter af normal hjernebarkudvikling, repræsenterer den et nyttigt og relevant værktøj til test af pc-biogenese og funktion under normale versus patologiske tilstande og bør bidrage til at få yderligere indsigt i inddragelsen af pc under neokortikal udvikling.

Som supplement til 2D hIPSC-baserede modelleringsmetoder tilbyder dorsale forhjerneorganoider hidtil usete muligheder for at undersøge normal og patologisk cerebral udvikling in vitro, da de rekapitulerer mange funktioner og egenskaber ved den tidligt udviklende humane hjernebark. To hovedtyper af protokoller anvendes i øjeblikket: de iboende og de guidede metoder. Den iboende protokol, der er udviklet af Lancaster og kolleger23, er afhængig af IPSC'ernes iboende evne til at organisere sig selv med minimale eksterne faktorer og giver anledning til cerebrale organoider, der indeholder rudimenter i forskellige hjerneområder, hvilket giver en unik mulighed for at modellere interaktionerne mellem forskellige hjerneområder. Den høje variabilitet og heterogenitet, der er forbundet med en sådan modelleringsstrategi, udgør imidlertid betydelige udfordringer med hensyn til reproducerbarhed. Guidede organoiddifferentieringsprotokoller tillader generering af hjerneområdespecifikke organoider med minimal heterogenitet24,25,26. Denne tilgang gjorde det muligt for os med succes at generere dorsale forhjerneorganoider med ventrikellignende strukturer, der rekapitulerer store processer i tidlig human cerebral kortikal udvikling. Det første kritiske spørgsmål er at starte med hIPSC-kulturer af høj kvalitet, der huser store regelmæssige kolonier, der udviser mindre end 10% differentiering, og som er blevet passeret næsten en gang som et monolag for at tilpasse hIPC'erne til enkeltcellekulturforhold. For at begrænse organoid heterogenitet, en af de største udfordringer på området, er dannelsen af EB'er med en homogen størrelse faktisk en forudsætning, der indebærer behovet for dissociation af hIPSC-kolonier i enkeltcellesuspension, der muliggør såning ved den definerede celletæthed. Et andet kritisk skridt er BMM-inklusion af EB'er, der er nødvendige for at understøtte 3D-struktur og neuroepiteludvidelse. Vi foretrak gruppeinklusion af omkring femten organoider frem for individuel inklusion, selvom det involverer et yderligere trin, BMM-dissociationen. BMM-dissociation før rystekultur har vist sig at reducere variabiliteten inden for og mellem organoidpartier, hvilket resulterer i højere reproducerbarhed34. Derudover giver det mulighed for at slippe af med celleprocesser, der strækker sig ind i BMM, som ikke er skadelige for følgende differentieringstrin, men som gør det vanskeligt at observere organoider til kvalitetskontrol under efterfølgende trin i proceduren. For at forbedre ernæringsabsorptionen og iltudvekslingen sammenlignede vi organoidmodning på orbitalrystere og spindende bioreaktorer, der førte til lignende resultater. Vi valgte derfor orbital shaker-indstillingen, da det giver mulighed for betydeligt at reducere mediumvolumenerne og dermed de samlede omkostninger ved eksperimenterne. Det er vigtigt, at du bruger en anden inkubator til stationær og rystende kultur på en orbital shaker for at undgå vibrationer, der er skadelige for klæbende hIPSC-vækst. Vi anvendte denne protokol med succes på fem forskellige HIPSC-kontrollinjer35, der giver anledning til homogene resultater, der sikrer robustheden af denne procedure.

Karakterisering af sådanne organoider kan opnås ved hjælp af flere metoder. For at bevare den 3D-rumlige information inden for organoider oprettede vi en protokol, der tillader helmonteret immunsåning og rydning af hele organoider med efterfølgende erhvervelse af lysark. Forskellige rydningsmetoder er opstået med effektivitet afhængigt af prøvens oprindelse og tykkelse36,37. Her opretter vi en enkel, hurtig og omkostningseffektiv clearingmetode, der er afhængig af TDE (2,2'-thiodiethanol), et glycolederivat, der tidligere blev brugt til at rydde musehjerne og tarmorganoider38,39. Erhvervelse af immunfarvede og ryddede organoider blev udført på et lysarkmikroskop ved hjælp af et 20x mål nedsænket i 80% TDE. I sammenligning med andre 3D-billeddannelsesmetoder er lysarkmikroskopi af interesse af flere grunde: hurtig erhvervelse, god penetration og reduceret fotoblegning. Optimering af permeabiliseringstrinnet gør det muligt at nå effektiv og homogen antistofindtrængning, der gør det muligt at visualisere basale legemer og axonæer af pc, der strækker sig fra alle stamfader og neuronale celletyper af hele organoidet. Desuden gør erhvervelse af fritsvævende 150 μm tykke sektioner ved hjælp af et omvendt resonansscanningskonfokalmikroskop med 40x (NA 1.3) eller 63x (NA 1.4) oliemål det muligt at vinde yderligere i opløsning, samtidig med at en betydelig grad af 3D-rumlig information bevares, og kvalitativ og kvantitativ analyse af pc-biogenese og -funktion muliggøres.

Kombinationen af sådanne 2D- og 3D-cellebaserede modeller og 3D-billeddannelsesanalyse (figur 5) på hIPSC'er, der genereres enten ved omprogrammering af ciliopati-patientceller eller ved anvendelse af CRISPR/CAS9-teknologi til specifikt at redigere centrosomale eller ciliære gener, bør muliggøre betydelige fremskridt i forståelsen af pc'ens bidrag under normal og patologisk udvikling af hjernebarken. Det er vigtigt, at genomredigeringsteknologi også giver mulighed for specifikt at redde patientmutationer for at opnå isogene kontrol-hIPSC'er for at overvinde genetisk heterogenitet, der udfordrer påvisningen af sygdomsmekanismer. Derudover anvendes encellede genomiske tilgange nu i vid udstrækning i hele feltet og repræsenterer relevante og komplementære tilgange til immunstaininganalyse. På trods af nogle begrænsninger og vanskeligheder, der er forbundet med alle nye teknologier, og som i vid udstrækning behandles, tilbyder sådanne 2D- og 3D hIPSC-baserede modeller og de karakteriseringsmetoder, vi præsenterede her, kraftfulde og relevante værktøjer til at dissekere pc-involvering i de patologiske mekanismer, der ligger til grund for menneskelige udviklingsmæssige neokortikale anomalier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Agence Nationale de la Recherche (ANR) til S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) og N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 og ANR-19-CE16-0002-01). LB støttes af ANR under Investissements d'avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01) og Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-programmet). Imagine Institute støttes af statsfinansiering fra ANR under Investissements d'avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-projekter) og som en del af det andet Investissements d'Avenir-program (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 181 primær cilium humane inducerede pluripotente stamceller hIPSC'er neurale stam- og stamceller human cerebral kortikal udvikling neurale rosetter dorsale forhjerneorganoider 2D- og 3D hIPSC-baserede modeller for neokortikal udvikling cerebrale organoider sonisk pindsvin helmonteret immunfarvning optisk clearing lysarkmikroskop
2D og 3D humant inducerede pluripotente stamcellebaserede modeller til at dissekere primær ciliuminddragelse under neokortikal udvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., … More

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., Calderon, D., Farcy, S., Pernelle, J., Goudin, N., Maillard, C., Dimartino, C., Deleschaux, C., Dupichaud, S., Lebreton, C., Saunier, S., Attié-Bitach, T., Bahi-Buisson, N., Lefort, N., Thomas, S. 2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development. J. Vis. Exp. (181), e62667, doi:10.3791/62667 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter