Summary
تم تطوير نظام فحص عالي الإنتاجية في المختبر لتقييم الأدوية المضادة للسرطان باستخدام الأجهزة العضوية السرطانية المشتقة من المريض (PDOs) ، على غرار أنسجة السرطان ولكنها غير مناسبة لأنظمة المقايسة عالية الإنتاجية في المختبر مع لوحات 96-well و 384-well.
Abstract
من المتوقع أن تكون الأجهزة السرطانية المشتقة من المريض (PDOs) نموذجا للسرطان قبل السريري مع إمكانية إعادة إنتاج المرض بشكل أفضل من نماذج زراعة الخلايا التقليدية. وقد تم إنشاء PDOs بنجاح من مجموعة متنوعة من الأورام البشرية لتلخيص الهندسة المعمارية ووظيفة أنسجة الورم بدقة وكفاءة. ومع ذلك ، فإن PDOs غير مناسبة لنظام الفحص عالي الإنتاجية في المختبر (HTS) أو تحليل الخلايا باستخدام لوحات 96 جيدا أو 384 بئرا عند تقييم الأدوية المضادة للانسان لأنها غير متجانسة في الحجم وتشكل مجموعات كبيرة في الثقافة. تستخدم هذه الثقافات والمقايسات المصفوفات خارج الخلية، مثل ماتريغل، لإنشاء سقالات أنسجة الورم. لذلك ، فإن PDOs لديها إنتاجية منخفضة وتكلفة عالية ، وكان من الصعب تطوير نظام فحص مناسب. لمعالجة هذه المسألة، تم إنشاء HTS أبسط وأكثر دقة باستخدام PDOs لتقييم فعالية الأدوية المضادة للانسان والعلاج المناعي. تم إنشاء HTS في المختبر الذي يستخدم PDOs المنشأة من الأورام الصلبة المستزرعة في لوحات 384 بئرا. كما تم تطوير HTS لتقييم نشاط السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة لتمثيل الاستجابة المناعية باستخدام PDOs المستزرعة في لوحات 96 بئرا.
Introduction
خطوط الخلايا السرطانية البشرية مقبولة على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا السرطان وتقييم عوامل مضادة للسرطان. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا هذه لا تحافظ بالضرورة على الخصائص الأصلية للأنسجة المصدر لأن مورفولوجياها ، والطفرة الجينية ، وملف التعبير الجيني يمكن أن تتغير أثناء الثقافة على فترات طويلة. وعلاوة على ذلك، يتم استزراع معظم هذه الخطوط الخلية في طبقة واحدة أو تستخدم ك بوين xenografts، لا يمثل أي منها جسديا أنسجة الورم1،2. وبالتالي، فإن الفعالية السريرية لعوامل مضادة للسرطان قد لا تكون هي نفسها التي لوحظت في خطوط الخلايا السرطانية. لذلك ، تم تطوير أنظمة في المختبر ، مثل المقايسات الجسمية السابقة باستخدام مناظير الورم المشتقة من المريض أو الأجهزة السرطانية المشتقة من المريض (PDOs) ونماذج كروية الورم التي تستنسخ بدقة بنية ووظيفة أنسجة الورم. وتشير الأدلة المتزايدة إلى أن هذه النماذج تتنبأ باستجابة المرضى لعوامل مضادة للسرطان من خلال مقارنتها مباشرة بأنسجة السرطان المقابلة. وقد أنشئت هذه النظم في المختبر لأنواع مختلفة من أنسجة الورم، وما يرتبط بها من نظم المقايسة عالية الإنتاجية (HTS) لفحص المخدرات كما تم تطوير3،4،5،6،7. اكتسبت الثقافات العضوية غير المتجانسة ex vivo من الأورام الأولية التي تم الحصول عليها من المرضى أو xenografts الورم المشتقة من المريض الجر كبيرة في السنوات الأخيرة بسبب سهولة الثقافة والقدرة على الحفاظ على تعقيد الخلايا في الأنسجة السترومية8،9،10. ومن المتوقع أن تعزز هذه النماذج فهم بيولوجيا السرطان وتسهيل تقييم فعالية الدواء في المختبر.
تم إنشاء سلسلة من PDOs رواية مؤخرا من أنواع مختلفة من أنسجة الورم، المعينة باسم F-PDO، في إطار مشروع البحوث الترجمية فوكوشيما. وPDOs تشكل مجموعات خلايا كبيرة مع مورفولوجيا مماثلة لتلك التي من الورم المصدر ويمكن استزراعها لأكثر من ستة أشهر11. أظهرت التحليلات المقارنة للأنسجة والتعبير الجيني الشامل أن ملامح PDOs قريبة من ميزات أنسجة الورم المصدر ، حتى بعد النمو المطول في ظل ظروف الثقافة. وعلاوة على ذلك، تم إنشاء HTS مناسبة لكل نوع من PDO في 96-جيدا و 384-لوحات الآبار. وقد استخدمت هذه المقايسات لتقييم العديد من العوامل المستهدفة الجزيئية والأجسام المضادة. هنا، تم تقييم العلاج الكيميائي القياسي (باكليتاكسيل وكاربوبلاتين) المستخدم لسرطان بطانة الرحم باستخدام F-PDOs المستمدة من مريض لم يستجب للباكليتاكسيل وكاربوبلاتين. وبناء على ذلك، كان النشاط المثبط لنمو الخلية من باكليتاكسيل وكاربوبلاتين ضد هذا PDO ضعيفة (IC50: >10 ميكرومتر). بالإضافة إلى ذلك، ذكرت الأبحاث السابقة أن حساسية بعض F-PDOs للعوامل الكيميائية والعوامل الجزيئية المستهدفة تتفق مع الفعالية السريرية11و12و13. وأخيرا، تم تحليل التغيرات في بنية أعلى ترتيبا من PDOs الناجمة عن عوامل مضادة للانسان باستخدام نظام تحليل الخلايا ثلاثي الأبعاد12،13. نتائج تقييم عوامل مضادة للانسان باستخدام HTS المستندة إلى PDO قابلة للمقارنة مع النتائج السريرية التي تم الحصول عليها لهذه العوامل. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لHTS أبسط وأكثر دقة التي يمكن استخدامها لتقييم فعالية عوامل مضادة للانسان والعلاج المناعي باستخدام نماذج PDO.
Protocol
أجريت جميع التجارب التي شملت مواد مشتقة من الإنسان بموجب إعلان هلسنكي ووافقت عليها مسبقا لجنة الأخلاقيات في جامعة فوكوشيما الطبية (رقم الموافقة 1953 و2192؛ وتاريخ الموافقة 18 مارس 2020 و26 مايو 2016 على التوالي). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى الذين قدموا العينات السريرية المستخدمة في هذه الدراسة.
1. ثقافة منظمات المجتمع المدني
ملاحظة: تشكل F-PDOs مجموعات خلايا تعرض مجموعة متنوعة من الأشكال المورفولوجية غير المتجانسة وتنمو في ثقافة التعليق(الشكل 1). وعلاوة على ذلك، يمكن استزراع F-PDOs لأكثر من 6 أشهر ويمكن تقديمها كالتبريد للاستخدام في المستقبل.
- إذابة ملفات PDF المخزنة (اليوم 0)
- ذوبان وبذور PDOs (على سبيل المثال، RLUN007، الورم الغدي الرئة) في اليوم 0(الشكل 1). أولا، إضافة 15 مل من المتوسطة ل PDOs (انظر جدول المواد)تحتوي على 1٪ من الملحق B-27 و 30 نانوغرام / مل من عامل نمو البشرة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل معقمة.
- بعد إزالة القارورة المجمدة من تخزين النيتروجين السائل، قم بإثارة PDOs برفق في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بعد ذلك، قم بإزالة القارورة من حمام الماء، ومسح القارورة بالإيثانول بنسبة 70٪، ثم نقل القارورة إلى خزانة السلامة البيولوجية.
- نقل محتويات القارورة إلى الأنبوب الذي يحتوي على 15 مل من المتوسطة لشرطة المحيطات الرقمية. مزيج من PDOs والمتوسطة عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا خمس مرات مع ماصة نقل 3 مل. الطرد المركزي الأنبوب في 200 × ز لمدة 3 دقائق في ~ 25 درجة مئوية والتخلص من supernatant. Resuspend بيليه PDO في 5 مل من المتوسط الطازج ونقلها إلىقارورة 25 سم 2 (انظر جدول المواد)مع pipetting لطيف. وأخيرا، ثقافة PDOs في حاضنة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
- تغيير المتوسط مرتين في الأسبوع (أيام 3-7). طرد مركزي تعليق PDO لتسريع مجموعات الخلية، واستبدال 4 مل من المتوسط (حجم 80٪). إعادة إنفاق الخلايا في الوسط الطازج.
ملاحظة: تظهر معظم RLUN007 كتجمعات خلايا قطرها 100-500 ميكرومتر. عندما يتغير لون الفينول الأحمر في المتوسط إلى الأصفر كما هو موضح في الشكل 1A، استبدل الوسط بشكل أكثر تكرارا. إذا تحول الوسط إلى اللون الأصفر في اليوم التالي للاستبدال، وتم دمج كل كتلة خلايا لتشكيل مجموعات أكبر قطرها >500 ميكرومتر، يتم تمريرها بنسبة انقسام 1:2. - الثقافة الفرعية (أيام 8-28) من منظمات المجتمع المدني
ملاحظة: نظرا لصعوبة قياس عدد الخلايا المفردة فعليا، يتم تحديد توقيت المرور استنادا إلى كثافة مجموعة الخلايا المناسبة وحجم بيليه PDO بعد الطرد المركزي(الشكل 1B). في حالة RLUN007 ، يصل حجم بيليه PDO إلى 30 ميكرولتر (كثافة مشبعة فيقارورتين 2 سم 2) بعد أسبوعين تقريبا من ذوبان الجليد.- لنقل من قارورة واحدة25 سم 2 إلى اثنين25 سم 2 قوارير (P1)، نقل تعليق PDO إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 2 دقيقة في حوالي 25 درجة مئوية. تقدير حجم بيليه PDO، والتخلص من supernatant. Resuspend بيليه PDO باستخدام ماصة 5 مل في 5 مل من المتوسط الطازج. ماصة بلطف صعودا وهبوطا خمس مرات بسرعة منخفضة. ثم، نقل نصف حجم تعليق PDO (2.5 مل) إلى قارورتين، وإضافة 2.5 مل من المتوسط الطازج إلى كل قارورة. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
- لنقل من قارورتين2 2 سم إلى قارورة واحدة 75 سم2 (P2)، نقل تعليق PDO من قارورتين إلى اثنين من أنابيب الطرد المركزي والطرد المركزي PDO في 200 × ز لمدة 2 دقيقة في حوالي 25 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بتقدير حجم بيليه PDO وإعادة إنفاق بيليه في 2.5 مل من المتوسط الطازج (لكل أنبوب). بعد ذلك، الجمع بين تعليق PDO في أنبوب واحد مع أن في الآخر ونقله إلى قارورة2 75 سم تحتوي على 10 مل من المتوسط الطازج. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2. نقل PDOs sub المستزرعة من قارورتين2 2 سم إلى قارورة2 75 سم تقريبا 1 أسبوع بعد مرور الأول (الشكل 1C).
2. HTS تثبيط النمو
ملاحظة: يتم تقييم النشاط المثبط للنمو من عوامل مضادة للانسان ضد PDOs عن طريق قياس محتوى ATP داخل الخلايا، كما هو موضح في الشكل 2. يتم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجموعة أدوات اختبار صلاحية الخلية المتوفرة تجاريا (راجع جدول المواد).
- في اليوم 0، ثقافة PDOs (على سبيل المثال، RLUN007) في قوارير حتى تتوفر أعداد كافية من مجموعات الخلايا للمقايسة. قبل يوم واحد من البذر، نقل تعليق PDO من قارورة2 75 سم إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 2 دقيقة لقياس حجم بيليه PDO. ثم، resuspend بيليه PDO في 15 مل من المتوسط الطازج ونقله مرة أخرى إلى قارورة75 سم 2. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
ملاحظة: يعتمد حجم بيليه PDO المطلوب على معدل تخفيف كل PDO وعدد لوحات الآبار 384 المستخدمة في الفحص. بالنسبة ل RLUN007 ، من الضروري وجود 200 ميكرولتر من حجم بيليه الخلية للبذر في عشرة لوحات 384 بئرا. - في اليوم 1 (24 ساعة بعد تغيير الوسط)، فرم PDOs باستخدام معدات تشظي الخلايا والتشتت (انظر جدول المواد)مع حامل مرشح يحتوي على مرشح شبكة 70 ميكرومتر. ثم، تمييع 15 مل من تعليق PDO بنسبة 10x. البذور 40 ميكرولتر من تعليق PDO إلى 384 جيدا فائقة منخفضة المرفق كروية (الجولة القاع) لوحات صغيرة (انظر جدول المواد)باستخدام موزع تعليق الخلية (انظر جدول المواد).
ملاحظة: بالنسبة لمجموعات الخلايا المنمقة، يوصى باستخدام معدات تجزئة الخلايا وتشتتها المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). - عند 24 ساعة بعد البذر (اليوم الثاني)، تعامل مع ال PDOs باستخدام 0.04 ميكرولتر من حلول عوامل الاختبار في نطاقات التركيز النهائية من 20 ميكرومتر إلى 1.0 مليون متر (10 مخففات متسلسلة) باستخدام معالج سائل (انظر جدول المواد).
- في اليوم 8 (144 ساعة بعد اختبار علاج المادة)، إضافة كاشف قياس ATP داخل الخلايا إلى آبار الاختبار. اخلطي الأطباق باستخدام الخلاط واحتضنيها لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. قياس محتوى ATP داخل الخلية كما التلألؤ باستخدام قارئ لوحة (انظر جدول المواد).
- لحساب صلاحية الخلية، قم بتقسيم كمية ATP في آبار الاختبار على تلك الموجودة في آبار التحكم التي تحتوي على السيارة، مع طرح الخلفية. لحساب معدل النمو على مدى 6 أيام، تقسيم كمية ATP في آبار التحكم في السيارة من قبل أن في الآبار مراقبة السيارة 24 ساعة بعد البذر.
- حساب تركيز مثبط 50٪ (IC50)والمنطقة تحت منحنى (AUC) القيم من منحنيات الجرعة استجابة باستخدام برامج تحليل البيانات البيولوجية(انظر جدول المواد ). عامل Z هو معلمة بلا أبعاد تتراوح من 1 (فصل لا نهائي) إلى <0، تعرف بأنها Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|، حيث تكون الانحرافات المعيارية (σ) والمتوسطات (μ) للتحكمين العالي (c+) والمنخفض (c−)14على التوالي.
3. HTS مع خلية التقاط ونظام التصوير لتثبيط النمو
ملاحظة: إذا كان هناك انحراف كبير (عندما يكون معامل الاختلاف [CV] في المقايسة أكثر من 20٪) في البيانات باستخدام البروتوكول 2، يمكن زرع PDOs من حجم محدد في لوحات 96-well أو 384-well باستخدام نظام التقاط الخلايا والتصوير(الشكل 2). البروتوكول هو نفس الذي هو موضح في الخطوتين 2.1 و 2.2 في المقطع السابق. يتم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام نظام التقاط وتصوير الخلايا المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
- في اليوم الأول، قم بتعيين لوحة صغيرة فائقة الانخفاض للمرفقات ذات 384 بئرا مع 40 ميكرولتر من المتوسطة /بالإضافة إلى لوحة الوجهة على نظام التقاط الخلايا والتصوير.
- املأ غرفة الانتقاء (انظر جدول المواد)مع 6 مل من الأجهزة الوسيطة والطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة دقيقتين لإزالة فقاعات الهواء. إضافة PDOs معلقة في المتوسط (PDO بيليه حجم، 4 ميكرولتر) إلى غرفة الانتقاء وتعيين على النظام.
- الوقوف في الغرفة لمدة دقيقة واحدة على الأقل، تليها التشتت، بحيث يستقر في مجموعات الخلية في الجزء السفلي من الغرفة. ثم، إجراء المسح الضوئي للغرفة.
- تعيين حجم الانتقاء إلى 140-160 ميكرومتر (منطقة 15,386-20,000 ميكرومتر2)على نظام الاختيار التلقائي لمجموعات الخلايا. بعد ذلك، تحقق من جودة مجموعات الخلايا المحددة على الصور الممسوحة ضوئيا ونقل عشر مجموعات خلايا لكل بئر باستخدام نصائح الانتقاء (انظر جدول المواد)إلى لوحة الوجهة.
- تنفيذ الخطوات البروتوكول من الخطوة 2.3 فصاعدا.
4. HTS للسمية الخلوية تعتمد على الأجسام المضادة
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام نظام متوفر تجاريا (انظر جدول المواد)،وهو أداة لقياس المعاوقة الكهربائية. يتم استخدامه لتقييم تحليل الخلايا من PDOs بواسطة السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة والخلايا القاتلة الطبيعية (NK) (الشكل 3). يتم إنتاج خلايا NK من خلايا الدم المحيطية أحادية النووية باستخدام مجموعة إنتاج خلايا NK (انظر جدول المواد)،وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- قياس نشاط مركز مكافحة التصحر
- في اليوم 0، معطف لوحة 96 جيدا (انظر جدول المواد)مع 50 ميكروغرام من محلول فيبروكتين 10 ميكروغرام / مل (0.5 ميكروغرام / جيد) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم الأول، بعد إزالة محلول فيبروكتين، أضف 50 ميكرولتر من وسيط الثقافة إلى كل بئر لقياس مقاومة الخلفية.
- قبل البذر، أضف 5 مل من كاشف تفكك زراعة الخلايا (انظر جدول المواد)إلى PDOs (RLUN007: 100 ميكرولتر من بيليه PDO في قارورة2 75 سم) واحتضانها في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتفريق PDOs. لإيقاف المحاولة، أضف 5 مل من أجهزة الطرد المركزي المتوسطة وأزل كاشف التفكك. شطف PDOs مع المتوسطة الطازجة ومرشح من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
- عد عدد الخلايا باستخدام محلل صلاحية الخلية (انظر جدول المواد).
- نقل تعليق PDO إلى خزان وخلط باستخدام ماسورة متعددة القنوات. إضافة تعليق PDO في الآبار في 5 × 104 خلايا / جيدا في لوحة 96 جيدا. ويحتوي كل بئر على حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر. ثم ضع اللوحة في خزانة السلامة البيولوجية عند حوالي 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- نقل اللوحة إلى الجهاز في حاضنةCO2 عند 37 درجة مئوية. تسجيل التغيرات في إشارات المعاوقة كل 15 دقيقة كمؤشر الخلية.
- إذابة خلايا NK في حمام مائي 37 درجة مئوية في نفس اليوم الذي البذر PDO. نقل الخلايا من القارورة إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 10 مل من المتوسط لخلايا NK (انظر جدول المواد)والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في حوالي 25 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 10 مل من المتوسطة الطازجة. بعد عد الخلايا، قم بضبط كثافة الخلية إلى 1 × 106 خلايا/مل ونقلها إلى قارورة2 75 سم. زراعة خلايا NK في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ عند 37 درجة مئوية.
- في اليوم الثاني، قم بإعداد المحاليل المضادة (المالحة العازلة بالفوسفات) عند 10 أضعاف التركيز النهائي في لوحات V-bottom المعقمة ذات 96 بئرا.
- إزالة 60 ميكرولتر من المتوسط من كل بئر، وإضافة 10 ميكرولتر من trastuzumab أو محلول cetuximab (10 ميكروغرام / مل، 1 ميكروغرام / مل، و 0.1 ميكروغرام / مل) إلى PDOs. نقل لوحات العودة إلى الصك في حاضنة وتسجيل مؤشر الخلية ل1 ساعة.
- نقل تعليق الخلية NK إلى أنبوب 50 مل والعد رقم الخلية. طرد مركزي الخلايا في 300 س ز لمدة 5 دقائق وضبط كثافة الخلية NK إلى 1 × 106 خلايا / مل و 2 × 106 خلايا / مل مع المتوسطة لPDOs.
- إضافة 50 ميكرولتر من تعليق الخلية NK إلى الخلايا التأثير (NK) في هدف (RLUN007) نسبة الخلية من 1:1 أو 2:1. التركيزات النهائية للأجسام المضادة هي 1 ميكروغرام / مل ، 0.1 ميكروغرام / مل ، و 0.01 ميكروغرام / مل. احتفظ باللوحة عند حوالي 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم أعد اللوحات إلى الجهاز.
- جمع وتحليل البيانات
- تحويل فهرس الخلية إلى قيم تحليل الخلايا في المائة باستخدام برنامج التحليل (انظر جدول المواد).
- يشير تحليل الخلايا في المئة إلى النسبة المئوية للخلايا المستهدفة التي تقتلها خلايا NK مقابل الخلايا المستهدفة (PDOs) وحدها كعنصر تحكم. طرح مؤشرات الخلية من الآبار التي تحتوي على خلايا NK فقط من فهرس الآبار عينة في كل نقطة زمنية. تطبيع كل قيمة إلى فهرس الخلية مباشرة قبل إضافة الأجسام المضادة. تحويل مؤشر الخلية تطبيع إلى تحليل الخلايا في المئة باستخدام المعادلة التالية: ٪ تحليل الخلايا = (1 - مؤشر الخلية تطبيع [عينة الآبار]) / مؤشر الخلية تطبيع (الآبار الهدف وحدها) × 100.
Representative Results
تم تطوير HTS دقيقة للغاية باستخدام PDOs و 384-well microplates لتقييم عوامل مضادة للانسان، وكان قد تم الإبلاغ سابقا عن تطوير HTS لكل PDO10و11و12و13. تم تقييم أداء HTS عن طريق حساب السير الذاتية وعامل Z'factor. وZ'factor هو أسلوب مقبول على نطاق واسع للتحقق من جودة الفحص والأداء، والمقاسة مناسبة لHTS إذا كانت هذه القيمة >0.514. وأظهرت نقاط datum السيطرة في المقايسة لوحة 384 جيدا باستخدام RLUN007 تباين قليلا، مع قيم السيرة الذاتية من 5.8٪ وتحسب Z'-العوامل من 0.83، كما هو مبين في الشكل 4. تشير هذه النتائج إلى أن هذا المقايسة له أداء عالي ل HTS. للتحقيق في حساسية PDOs لعوامل مضادة للسرطان باستخدام HTS ، تم تقييم تثبيط النمو باستخدام RLUN007 تعامل مع ثمانية عوامل مضادة للسرطان، على وجه التحديد، مثبطات عامل نمو البشرة (EGFR) (أفاتينيب، إرلوتينيب، جيفيتينيب، lapatinib، osimertinib، وrosiletinib) وpaclitaxel، والتي هي العلاجات السريرية القياسية لسرطان الرئة الخلايا غير الصغيرة، وال mitomycin C كسيطرة إيجابية. يتم عرض قيم IC50 و AUC لعوامل مضادة للانسان لكل PDO في الشكل 4. وأظهرت RLUN007 حساسية عالية (IC50 < 2 ميكرومتر، AUC < 282) لجميع مثبطات EGFR وغيرها من وكلاء مضادة للانسان. أشارت منحنيات Sigmoid المحسوبة لجميع البيانات إلى أن النشاط المثبط للنمو لعوامل مضادة للانسان يمكن قياسه بدقة.
يستخدم نظام انتقاء الخلايا والتصوير عندما تختلف البيانات بشكل كبير باستخدام المنهجية المذكورة أعلاه. يسمح نظام التقاط الخلايا والتصوير، الذي يختار مجموعات الخلايا بدقة دون إتلافها، بإجراء فحوصات دقيقة ل HTS عن طريق محاذاة حجم كتلة الخلية لاستبعاد حطام الخلية من نظام الفحص. عندما لم يتم استخدام النظام، كانت قيمة السيرة الذاتية 26.0٪ وكانت قيمة Z'factor 0.23 (البيانات غير مبينة). ومع ذلك، تم تحسين قيم CV و Z'factor بنسبة 6.4٪ و 0.81، على التوالي، باستخدام النظام.
للتحقيق في التحليل الخلوي ل PDOs مع نشاط ADCC باستخدام أداة قياس المعاوقة الكهربائية ، والتي تراقب عدد الخلايا ومورفولوجيا ومرفقها لفترة طويلة ، تم تقييم التغيرات في إشارات المعاوقة باستخدام RLUN007 المعالجة بالأجسام المضادة (trastuzumab و cetuximab) وخلايا NK كخلايا تأثيرية في لوحة من 96 بئرا. بالمقارنة مع التحكم الذي يتكون من الخلايا المستهدفة فقط ، زاد التحلل الخلوي في المئة مع مرور الوقت. وصلت إلى 45٪ أو 75٪ بعد 6 ساعة بنسبة E:T من 1:1 (الشكل 5A، C) أو 2:1 ( الشكل5B، D) بدون الأجسام المضادة. NK الخلية بوساطة تحليل الخلايا باستخدام trastuzumab كان ما يقرب من 60٪ و 90٪ بنسبة 1:1(الشكل 5A،1 ميكروغرام / مل) و 2:1 (الشكل 5B، 1 ميكروغرام / مل)، على التوالي، في 6 ساعة. في المقابل, وكان cetuximab تأثير الجرعة تعتمد على NK الخلايا بوساطة تحليل الخلايا (الشكل 5C,D). في أعلى تركيز من cetuximab, تم تدمير RLUN007 في 90٪ و 100٪ بنسبة 1:1 و 2:1, على التوالي (الشكل 5C, D). كان تأثير trastuzumab أضعف من تأثير cetuximab ، مع سمية سيتوتوكسيسيتية 60٪ فقط. تشير هذه النتائج إلى أن نظام تقييم PDO يمكنه تقييم نشاط ADCC باستخدام تقنية تعتمد على المعاوقة في الوقت الفعلي.
الشكل 1: النقاط الحرجة لثقافة PDO. (أ) تغيير اللون في الوسط. (ب)قياس كمية PDOs من حجم بيليه عن طريق بطانة أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على PDOs مع أنابيب ملحوظ عند مستويات ل50-200 ميكرولتر. (C) كثافة PDO. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:ملخص البروتوكول المستخدم لإنشاء نظام فحص عالي الإنتاجية باستخدام لوحات صغيرة ذات 384 بئرا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:ملخص البروتوكول الخاص بال المقايسة عالية الإنتاجية لنشاط ADCC. ADCC, السمية الخلوية تعتمد على الأجسام المضادة; NK، القاتل الطبيعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نظام فحص الإنتاجية العالية لتثبيط النمو مع عوامل مضادة للانسان. منحنى الجرعة استجابة RLUN007 لعوامل مضادة للانسان. تم بذر PDOs المفروم في لوحات 384 بئرا. وقد عولجت هذه لمدة 6 أيام مع عشرة تركيزات مختلفة من عوامل مضادة للانسان (بين 10 ميكرومتر و 1.5 مليون متر). تمثل البيانات متوسط الانحراف المعياري ± لتجارب ثلاثية الطبيعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:المقايسة عالية الإنتاجية لنشاط ADCC. (أ, ب) (تراستوزوماب) (C,D) (سيتوكسيماب) (أ,ج) نسبة 1:1 من RLUN007 إلى الخلايا التأثيرية. (ب,د) تحليل الخلايا بنسبة RLUN007: الخلايا التأثيرية من 1:2. تم قياس النشاط 12 ساعة بعد إضافة الخلايا التأثيرية. وتقدم البيانات على أنها متوسط الانحراف المعياري ± ثلاث عينات متماثلة. ADCC، السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
والسمة الفريدة ل PDOs هي أنها لا تنفصل بشكل أنزيمي إلى خلايا واحدة أثناء الثقافة أو الفحص وتحافظ على مجموعات الخلايا في الثقافة. لذلك، لا يمكن حساب عدد الخلايا بدقة تحت المجهر. لحل هذه المشكلة، يتم تحديد عدد الخلايا بصريا عن طريق بطانة أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على الخلايا مع أنابيب ملحوظ مع مستويات ل50-200 ميكرولتر (الشكل 1B). وعلاوة على ذلك، لأنه من الصعب قياس حجم بيليه من مجموعات الخلية المستزرعة في قارورة 2 سم2 بصريا، تم تحديد وقت المرور باستخدام تغيير اللون المتوسط من الأحمر إلى الأصفر والزيادة الملحوظة في خلايا واحدة أو debriscompared مع وقت التمرير كمؤشرات(الشكل 1A،C). هذا هو الهدف من passaging لPDOs. يتم قياس كمية الكريات PDO بصريا بعد الطرد المركزي في كل تغيير متوسط. عندما يتوقف حجم بيليه زيادة، والمتوسط يتحول الأصفر في اليوم التالي لاستبدال المتوسطة، ويعتبر المتوسطة لتكون مشبعة مع الكثافة، ويتم تنفيذ passaging. يتم تعريف حجم بيليه لكل PDO. إذا لم تتكاثر PDOs ، يتم تغيير كمية الوسيطة من 80٪ إلى 50٪ في وقت التبادل المتوسط ، ويتم زيادة كثافة PDOs في الثقافة.
تم تطوير HTS مناسبة لPDOs. الإنتاجية لها ما لا يقل عن عشرة إلى عشرين لوحات 384 جيدا تنفيذها باستخدام قارورة واحدة 75 سم2 من PDO، وعدد لوحات معالجتها يوميا هو ما لا يقل عن 50. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ بالفعل عن نتائج تقييم مختلف الأدوية المضادة للانسان من قبل HTS باستخدام PDOs.
عند تنفيذ HTS ، يتم تناول انسداد مرشح الشبكة الناجم عن زراعة الألغام من F-PDOs باستخدام معدات تفتيت الخلايا وتشتتها في البداية عن طريق تغيير حجم الشبكة للمرشح إلى 100 ميكرومتر. الخطوة التالية هي تقليل حجم تعليق PDO المطبق على السفينة الزجاجية. عند إعداد حلول المواد الاختبارية لHTS ، عادة ما يتم إذابة المركبات منخفضة الوزن الجزيئي في كبريت أكسيد ثنائي ميثيل ، ويتم إذابة الأجسام المضادة في المالحة العازلة بالفوسفات. يستخدم المذيب المناسب كمادة اختبار، ويتم الحصول على بيانات التحكم من المذيب المستخدم.
فيما يلي وصف كيفية التعامل مع التباين في بيانات المقايسة. إذا كان هناك تباين كبير في البيانات في الاختبار باستخدام لوحات 384 بئرا ، فيجب تغيير لوحة الفحص إلى تنسيق لوحة 96 جيدا. عامل تخفيف PDO (عدد مجموعات الخلايا المصنفة) يتم فحصه أيضا بعد بذر اللوحة. وأخيرا، يمكن استخدام نظام التقاط الخلايا والتصوير لتحديد حجم وحدات حفظ البيانات الرقمية للمقايرة. قبل إضافة PDOs إلى الغرفة ، يجب إزالة الخلايا المفردة ومجموعات الخلايا الصغيرة عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة لتكون قادرة على التعرف بشكل صحيح على PDOs. إذا كانت الخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا الصغيرة مرئية بعد إضافة PDOs إلى الغرفة ، يمكن إجراء عمليات تفريق متعددة لإزالة الخلايا المفردة. بعد ذلك ، على الرغم من أن نظام التقاط الخلايا والتصوير له وظيفة تسمح بإبقاء اللوحة دافئة ، إلا أن هذه الوظيفة لا تستخدم بسبب تبخر وسيط الثقافة عندما يعمل النظام لفترة طويلة من الزمن. وأخيرا، حجم مجموعات الخلايا غير معروف لأنه يتم التعرف عليه بواسطة صورة مخطط. علاوة على ذلك، إذا تداخل PDOs اثنين أو أكثر لا يمكن التعرف على PDO واحد بشكل صحيح. ومع ذلك، فمن الممكن لإزالة PDOs غير المرغوب فيها باستخدام وظيفة إزالة عن طريق التحقق منها على الصورة الممسوحة ضوئيا بعد هذه الخطوة.
تستخدم أداة قياس المعاوقة الكهربائية بشكل عام للخلايا السرطانية المستهدفة الملتزمة لرصد التغيرات في المقاومة أثناء انتشار الخلايا. لذلك، لا يتم الكشف عن تغيير في فهرس الخلية من PDOs غير المنضمة. في محاولة لحل هذه المشكلة، فمن الضروري التحقيق في ظروف البذر مثل كثافة PDO والعلاج الأنزيمي (إنزيم تفكك الخلايا ووقت العلاج) اعتمادا على نوع PDO. يجب أيضا أن تكون مغلفة الآبار في لوحة مع مصفوفة خارج الخلية المناسبة للبذر PDOs. يتم بذر PDOs دون علاج أنزيمي ، اعتمادا على نوع PDO. تم استخدام RLUN007 لقياس المعاوقة عن طريق بذر PDOs على لوحة من 96 بئرا بعد تفريقها عن طريق العلاج الأنزيمي. تم علاج RLUN007 مع كاشف تفكك زراعة الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتفريق الخلايا وإرفاقها بالآبار من لوحة 96 بئرا. وبالنظر إلى أن الخلايا RLUN007 فصل تشكل على الفور المجاميع، فمن المستحسن أن البذور على لوحات فقط بعد الترشيح باستخدام مصفاة. بعد نقل تعليق الخلية من الأنبوب إلى الخزان ، تم نقل الخزان بلطف من اليمين إلى اليسار مرتين إلى ثلاث مرات وتم غليه صعودا وهبوطا خمس مرات قبل البذر على اللوحة. كما اختلط التعليق مع كل إضافة إلى البئر. ثم وضعت لوحة في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة (لPDOs) أو 15 دقيقة (لخلايا NK) للسماح للخلايا لتوزيع بالتساوي في البئر. النقطة الثانية الهامة هي أن العلاج بالأجسام المضادة وخلايا NK يجب أن يكون في الوقت المناسب لتحدث قبل أن يصل مؤشر الخلية إلى هضبة والقيمة لا تقل عن 0.5. في حالة RLUN007 ، فإن الوقت الأمثل لبدء الفحص هو 20-22 ساعة بعد الطلاء ، ورقم الخلية للبذر هو 5 × 104 خلايا / جيدا.
بشكل عام، والثقافة والمقايسات لالأورام organoids استخدام المصفوفات خارج الخلية مثل Matrigel لإنشاء سقالات الأنسجة السرطانية أو الإنزيمات مثل التريبسين والكولاجيناز لتعطيل organoids3،4،5،6،7. ميزة هذه الطريقة هي أنه لا يلزم أي مصفوفة خارج الخلية أو علاج أنزيمي أثناء الثقافة والتقييس (باستثناء المقايسات باستخدام أداة قياس المعاوقة الكهربائية) ، مما يقلل بشكل كبير من متطلبات العمالة والتكاليف. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة سهلة نسبيا للتكيف مع أنظمة فحص HTS وأنظمة القياس المختلفة. ومع ذلك ، فإن استخدام مصفوفة خارج الخلية أمر مرغوب فيه لبعض الأغراض البحثية لأنه يمكن أن يكون بمثابة سقالة للخلايا ويؤثر على مورفوجينيسيس ، والتمايز ، و التوازن في الأنسجة.
في هذه الدراسة، تم استخدام PDOs (RLUN007) مع طفرة EGFR (L858R) التي هي حساسة سريريا لمثبطات EGFR والتعبير العالي عن جين EGFR (البيانات غير المعروضة) لتقييم مثبطات EGFR. وقد ثبت أن حساسية RLUN007 لمثبطات EGFR كانت أعلى من تلك الأخرى المشتقة من سرطان الرئة F-PDOs13 (الشكل 4). وهكذا، فإن HTS باستخدام PDOs، التي تحتفظ بخصائص أنسجة الورم، متفوقة لتقييم العوامل المضادة المحتملة للانسان ويعرض فرصا لتقييم الأدوية والتقدم في الطب الشخصي. على الرغم من أن HTS مناسبة للفحص الأولي للعوامل ، إلا أنها لا تستنسخ البيئة الدقيقة للورم وبالتالي لا يمكنها تقييم فعالية الأدوية في الجسم الحي. لذلك ، يجري الآن تطوير نظام في المختبر يمكنه محاكاة أنسجة الورم البشري في الجسم الحي من خلال الثقافة المشتركة مع الخلايا البطانية الوعائية وغيرها من الخلايا النجمية أو تقنية الجهاز على رقاقة في غياب نماذج حيوانية.
Disclosures
فوجي فيلم واكو شركة حلول بيولوجية هي شركة تابعة لشركة فوجي فيلم واكو بيور للمواد الكيميائية، المالك التجاري لوسائل الإعلام F-PDO و F-PDO عن طريق نقل الترخيص.
Acknowledgments
نود أن نشكر المرضى الذين قدموا العينات السريرية المستخدمة في هذا البحث. ويدعم هذا البحث منح من برنامج البحوث الترجمية في محافظة فوكوشيما.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
| 40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
| Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
| ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
| CELL HANDLER | Yamaha Motor | - | Cell picking and imaging system |
| CellPet FT | JTEC | - | Cell fragmentation and dispersion equipment |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
| Echo 555 | Labcyte | - | Liquid handler |
| EnSpire | PerkinElmer | - | Plate reader |
| E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System |
| Fibronectin Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | Plate coating for xCELLigence RTCA System |
| F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | - | The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International |
| Morphit software, version 6.0 | The Edge Software Consultancy | Biological data analysis software | |
| Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Cell suspension dispenser |
| Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | Lung tumor derived F-PDO | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
| Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
| Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System | Beckman coulter | - | Cell viability analyzer |
| xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 | ACEA Bioscience | - | Analysis software for xCELLigence RTCA System |
| xCELLigence RTCA System | ACEA Bioscience | - | Electrical impedance measuring instrument for cytolysis |
References
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 241-253 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Palechor-Ceron, N., et al. Conditional reprogramming for patient-derived cancer models and next-generation living biobanks. Cells. 8 (11), 1327 (2019).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 630-643 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Inoue, A., et al. Current and future horizons of patient-derived xenograft models in colorectal cancer translational research. Cancers (Basel). 11 (9), 1321 (2019).
- Hum, N. R., et al. Comparative molecular analysis of cancer behavior cultured in vitro, in vivo, and ex vivo. Cancers (Basel). 12 (3), 690 (2020).
- Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncology Reports. 40 (2), 635-646 (2018).
- Takahashi, N., et al. An in vitro system for evaluating molecular targeted drugs using lung patient-derived tumor organoids. Cells. 8 (5), 481 (2019).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
