Summary
Этот протокол описывает, как генерировать полисомный профиль без использования автоматизированных градиентных изготовителей или систем фракционирования градиентов.
Abstract
Фракционирование полисом путем центрифугирования градиента плотности сахарозы является мощным инструментом, который можно использовать для создания профилей рибосом, идентификации конкретных мРНК, транслируемых рибосомами, и анализа факторов, связанных с полисомами. В то время как автоматизированные производители градиентов и системы фракционирования градиентов обычно используются с этим методом, эти системы, как правило, дороги и могут быть непомерно дорогими для лабораторий, которые имеют ограниченные ресурсы или не могут оправдать расходы из-за их нечастой или случайной необходимости выполнять этот метод для своих исследований. Здесь представлен протокол для воспроизводимого создания полисомных профилей с использованием стандартного оборудования, доступного в большинстве лабораторий молекулярной биологии без специализированных инструментов фракционирования. Кроме того, приведено сравнение полисомных профилей, полученных с градиентной системой фракционирования и без нее. Обсуждаются стратегии оптимизации и получения воспроизводимых полисомных профилей. Saccharomyces cerevisiae используется в качестве модельного организма в этом протоколе. Однако этот протокол может быть легко модифицирован и адаптирован для создания профилей рибосом для многих различных организмов и типов клеток.
Introduction
Рибосомы представляют собой мега-Дальтонные рибонуклеопротеиновые комплексы, которые выполняют фундаментальный процесс трансляции мРНК в белки. Рибосомы отвечают за осуществление синтеза всех белков внутри клетки. Эукариотические рибосомы состоят из двух субъединиц, обозначенных как малая рибосомная субъединица (40S) и большая рибосомная субъединица (60S) в соответствии с их коэффициентами седиментации. Полностью собранная рибосома обозначается как моносома 80S. Полисомы представляют собой группы рибосом, занимающихся трансляцией одной молекулы мРНК. Фракционирование полисом путем центрифугирования градиента плотности сахарозы является мощным методом, используемым для создания профилей рибосом, идентификации специфических мРНК, связанных с трансляцией рибосом, и анализа полисомных ассоциированных факторов 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Этот метод часто используется для отделения полисом от одиночных рибосом, рибосомных субъединиц и частиц рибонуклеопротеинов. Профили, полученные в результате фракционирования, могут дать ценную информацию относительно трансляционной активности полисом14 и состояния сборки рибосом 15,16,17.
Сборка рибосом представляет собой очень сложный процесс, облегчаемый группой белков, известных как коэффициенты сборки рибосом 18,19,20,21. Эти факторы выполняют широкий спектр функций во время биогенеза рибосом посредством взаимодействия со многими другими белками, включая АТФазы, эндо- и экзонуклеазы, ГТФазы, РНК-геликазы и РНК-связывающие белки22. Фракционирование полисом было мощным инструментом, используемым для исследования роли этих факторов в сборке рибосом. Например, этот метод был использован для демонстрации того, как мутации в полинуклеотид-киназе Grc3, факторе обработки пре-рРНК, могут негативно повлиять на процесс сборки рибосом17,23. Полисомное профилирование также выявило и показало, как сохраненные мотивы в АТФазе Rix7 имеют важное значение для производства рибосом16.
Процедура фракционирования полисом начинается с получения растворимых клеточных лизатов из интересующих клеток. Лизат содержит РНК, рибосомные субъединицы и полисомы, а также другие растворимые клеточные компоненты. Непрерывный линейный градиент сахарозы создается в ультрацентрифужной трубке. Растворимая фракция лизата клеток осторожно загружается на верхнюю часть трубки градиента сахарозы. Затем нагруженная градиентная трубка подвергается центрифугированию, которое разделяет клеточные компоненты по размеру в пределах градиента сахарозы силой тяжести. Более крупные компоненты перемещаются дальше в градиент, чем меньшие компоненты. В верхней части градиента находятся меньшие, более медленные движущиеся клеточные компоненты, тогда как более крупные и быстро движущиеся клеточные компоненты находятся внизу. После центрифугирования содержимое трубки собирают в виде фракций. Этот метод эффективно разделяет рибосомные субъединицы, моносомы и полисомы. Затем оптическая плотность каждой фракции определяется путем измерения спектрального поглощения на длине волны 254 нм. Построение поглощающей способности по отношению к числу фракций дает полисомный профиль.
Линейные градиенты плотности сахарозы могут быть сгенерированы с использованием создателя градиентов. После центрифугирования градиенты часто фракционируются, а поглощения измеряются с помощью автоматизированной системы фракционирования плотности 3,7,13,24,25. Хотя эти системы очень хорошо работают для производства полисомных профилей, они дороги и могут быть непомерно дорогими для некоторых лабораторий. Здесь представлен протокол генерации полисомных профилей без использования этих инструментов. Вместо этого этот протокол использует оборудование, обычно доступное в большинстве лабораторий молекулярной биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Препарат 7% - 47% градиентов сахарозы
ПРИМЕЧАНИЕ: Линейный диапазон градиента сахарозы может быть модифицирован для достижения лучшего разделения в зависимости от типа используемой клетки. Этот протокол оптимизирован для полисомных профилей для S. cerevisiae.
- Готовят стоковые растворы 7% и 47% сахарозы в буфере градиента сахарозы (20 мМ Tris-HCl pH 7,4, 60 мМ KCl, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT). Фильтр стерилизует растворы сахарозы через фильтр 0,22 мкм и хранит при 4 °C.
- Готовят 14 мл 17%, 27% и 37% растворов сахарозы путем дозирования и смешивания 7% и 47% растворов сахарозы способом, описанным в таблице 1.
- Поместите шесть полипропиленовых центрифужных трубок (14 x 89 мм) в стойку для пробирок с полным обзором. Обеспечьте достаточное пространство между трубками, чтобы действия с одной трубкой не мешали другим.
- Прикрепите длинную иглу к шприцу объемом 3 мл. Для этого протокола используйте иглу 9 дюймов, 22 г с тупым наконечником (рисунок 1), но достаточно любой иглы, достаточно длинной, чтобы достичь дна трубки центрифуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните тестовое заполнение и дозирование, чтобы убедиться, что шприц может удерживать раствор сахарозы без каких-либо капель перед установкой градиентов. - Добавьте 2 мл 7% сахарозы на дно каждой трубки центрифуги.
- Добавьте 2 мл 17% сахарозы под 7% раствор, расположив кончик иглы в непосредственной близости от дна трубки и дозируя раствор медленно и осторожно.
- Повторить с 2 мл каждого из 27%, 37% и 47% растворов сахарозы. Убедитесь, что каждый слой отличается друг от друга линией, обозначающей разделение плотностей (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если градиенты не будут использоваться в течение 48 часов, то на этом этапе, до их осаждения в непрерывный градиент, во вспышке замораживают трубки со слоистыми растворами сахарозы в жидком азоте и хранят в морозильной камере -80 °C для длительного хранения. - Храните градиенты при 4 °C в течение ночи, чтобы позволить градиентам оседать в непрерывный, увеличивающийся процент сахарозы. Требуется 8-12 ч, чтобы слоистые растворы сахарозы осели в линейный градиент сахарозы. Линейные градиенты стабильны до 48 ч. Ночное хранение при 4 °C обеспечивает достаточное время для размораживания и осаждения в линейный градиент для использования замороженных, слоистых растворов сахарозы. Используйте денситометр для оценки качества градиента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно хранить градиенты в стабильном месте, где они не будут нарушены, так как любые движения или вибрации нарушат градиент.
2. Приготовление экстрактов дрожжевых клеток
- Инокулируют интересующий штамм дрожжей в 50 мл среды дрожжевого экстракта пептона декстрозы (YPD) и растут в течение ночи при 30 °C в встряхивающем инкубаторе до стационарной фазы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура может варьироваться в зависимости от требований к штамму дрожжей. - Переведите 10 мл стационарной фазовой культуры в 1 л свежей среды СЛД. Инкубируют клетки с сильным встряхиванием при 30 °C (или другой подходящей температуре) до тех пор, пока культура не достигнет среднеэкспоненциальной фазы роста (OD600 = 0,4-0,6).
- В середине экспоненциальной фазы роста добавляют циклогексимид в культуру в конечной концентрации 0,1 мг/мл. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
- Собирайте клетки путем центрифугирования при 3000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки могут быть заморожены и сохранены при -80 °C. - Повторно суспендируют клетки в охлажденном 700 мкл буфера экстракции полисом (20 мМ Tris-HCl pH 7,4, 60 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 1% Тритон X-100, 0,1 мг/мл циклогексимида, 0,2 мг/мл гепарина). Добавьте 100 единиц ингибитора РНКАЗЫ и переложите его в центрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Добавьте в трубку центрифуги ~400 мкл предварительно охлажденных стеклянных шариков с диапазоном размеров 425-600 мкм. Разрушают дрожжевые клетки путем энергичного перемешивания в бусине-битере в течение 5 мин.
- Осветляют лизат центрифугированием при 8 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Определить концентрацию РНК в осветленном лизате путем измерения абсорбции при 260 нм с помощью спектрофотометра или с помощью системы обнаружения РНК на основе флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для очень точных измерений концентрации РНК используйте наборы для обнаружения РНК на основе флуоресценции. - Убедитесь, что концентрация РНК составляет 0,5-1 мкг/мкл. Если концентрация РНК слишком низкая, уменьшите объем буфера экстракции полисом, используемого для повторного суспендирования клеток в будущих экспериментах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите лизат на градиенты сразу после лизиса и количественного определения РНК. При необходимости во вспышке заморозьте лизаты в жидком азоте и храните при -80 °C в течение нескольких дней.
3. Центрифугирование градиентов
- Осторожно загрузите лизат на верхнюю часть градиентов. Поместите наконечник пипетки к внутренней стенке, в верхней части полипропиленовой трубки. Осторожно наклоните трубку и медленно распределите лизат на верхнюю часть градиента, прижимаясь к стене. Будьте очень осторожны, чтобы не нарушить или не нарушить градиент при загрузке лизата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество загруженного лизата будет варьироваться в зависимости от типа ячейки. Содержание РНК также будет варьироваться. Может потребоваться провести ряд экспериментов для определения количества лизата, необходимого для создания оптимального полисомного профиля. Для дрожжей 300 мкг РНК является хорошей отправной точкой для оптимизации. - Осторожно поместите трубки в предварительно охлажденные ведра качающегося ротора ковша.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая полипропиленовая центрифужная трубка должна иметь равные объемы градиента и количество загруженного лизата. Это может варьироваться от трубки к трубке. Убедитесь, что изменение не вызывает ошибку дисбаланса во время ультрацентрифугирования. - Центрифугирование градиентов при 260,110 x g в течение 150 мин при 4 °C.
4. Сбор фракций и данных
- Осторожно извлеките трубки центрифуги из качающегося ротора ковша и поместите их в держатель трубки.
- Нанесите маркировку на 96-луночных пластинах для хранения фракций и предварительного охлаждения на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 96-луночную пластину, подходящую для спектрофотометра, который имеет оптическое окно до 230 нм для определения нуклеиновых кислот при 260 нм / 280 нм. - Соберите фракции объемом 100 мкл или 200 мкл, начиная с верхней части градиента, осторожно вставив наконечник пипетки в верхнюю часть градиента. Собирайте дроби до тех пор, пока весь градиент не будет аликвотирован. Количество фракций будет зависеть от общего объема градиента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте дроби таким образом, чтобы не нарушать остальную часть градиента. Убедитесь, что все фракции имеют равный объем. В дополнение к ручному фракционированию, еще одним недорогим методом фракционирования является использование небольшого перистальтического насоса. - Переложите каждую фракцию на 96-луночную пластину, чтобы добраться до дна трубы центрифуги. Держите собранные фракции на льду все время.
- Измерьте поглощение каждой фракции при 254 нм с помощью спектрофотометра. Используйте 7% и 47% растворы сахарозы в качестве заготовок.
ПРИМЕЧАНИЕ: При измерении поглощения фракций имейте в виду, что для большинства спектрометров и колориметров наиболее эффективный диапазон поглощения составляет 0,1-1. Если измерения поглощения выходят за пределы диапазона (≥1,0), фракции имеют слишком много материала. Разбавьте образец, вспомните данные, а затем учитывайте коэффициент разбавления при построении профиля. - Создайте полисомный профиль, построив число фракций в сравнении с поглощением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Три репрезентативных полисомных профиля показаны на рисунке 3. Все профили из одного и того же штамма дрожжей. Типичный полисомный профиль будет иметь хорошо разрешенные пики для рибосомных субъединиц 40S, 60S и 80S, а также полисом. Гребень каждой рибосомной субъединицы и полисомный пик будут видны на каждом профиле (рисунок 3). Репрезентативный профиль из автоматизированной системы фракционирования плотности показан на рисунке 3А. Градиенты сахарозы, используемые для генерации этого профиля, были подготовлены вручную, как описано в этом протоколе. Этот профиль, показанный на фиг.3А , был получен из непрерывного профиля поглощения, поскольку градиент сахарозы смещался снизу вверх раствором погони через ячейку потока детектора и собирался в фракции. Поскольку эти системы непрерывно измеряют поглощение, они могут записывать более 1 500 точек данных. Вручную генерировать одинаковое количество точек данных нецелесообразно. Объем фракции, обычно используемой для ручных профилей, составляет 100-200 мкл. Объем фракции в этом диапазоне дает профиль с достаточной детализацией для большинства сравнительных анализов. Репрезентативные результаты, полученные от фракций 100 мкл и 200 мкл, показаны на рисунках 3B и 3C. Во всех трех представленных профилях использовались градиенты сахарозы, подготовленные, как описано в этом протоколе, для сравнения полученных данных. Для примера полисомного профиля, который использует градиентный производитель для подготовки градиентов сахарозы в отличие от ручной подготовки, описанной в этом протоколе, недавняя рукопись Chikashige et al. содержит несколько примеров профилей градиентов, сгенерированных с использованием автоматизированного градиентного мейкера и системыфракционирования 13.
| Конечная концентрация | мл 7% Акция | мл 47% акций |
| 7% | 14 | 0 |
| 17% | 10.5 | 3.5 |
| 27% | 7 | 7 |
| 37% | 3.5 | 10.5 |
| 47% | 0 | 14 |
Таблица 1: Приготовление растворов сахарозы. Готовят 14 мл 17%, 27% и 37% растворов сахарозы путем дозирования и смешивания 7% и 47% растворов сахарозы в указанных объемах.
Рисунок 1: Собранная игла и шприц. Игла 9 дюймов, 22 г с наконечником Гамильтона, прикрепленная к шприцу 3 мл с помощью механизма блокировки Luer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Окончательное появление 7%-47% градиентных слоев сахарозы. 7%, 17%, 27%, 37% и 47% растворы сахарозы наслаивают поверх другого, как описано в протоколе. Слои 17% и 37% имели добавленную синюю окраску, чтобы помочь различить слои для фотографии; при выполнении реального эксперимента не следует добавлять окраску. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Полисомные профили. Все градиенты сахарозы, используемые для генерации этих профилей, были подготовлены с использованием метода, описанного в этом протоколе. (A) Полисомный профиль, генерируемый автоматизированной системой фракционирования (фракционатор Бранделя). (B) Полисомный профиль, полученный путем ручного фракционирования образцов 200 мкл, описанных в текущем протоколе. (C) Полисомный профиль, полученный путем ручного фракционирования образцов 100 мкл, описанных в текущем протоколе. Полисомы, пики 40S, 60S и 80S указаны для каждого профиля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь описан способ создания полисомных профилей без использования дорогостоящих автоматизированных систем фракционирования. Преимущество этого метода заключается в том, что он делает полисомное профилирование доступным для лабораторий, которые не имеют автоматизированных систем фракционирования. Основными недостатками этого протокола являются утомительное ручное фракционирование и пониженная чувствительность по сравнению со специальной системой фракционирования плотности.
Этот протокол влечет за собой тщательную подготовку градиентов сахарозы с разрешением, достаточным для разделения рибосомных субъединиц, моносом и полисом. При подготовке градиентов сахарозы важно не вводить пузырьки воздуха при загрузке градиентных слоев. Пузырьки воздуха поднимаются наверх снизу и могут нарушить линейность градиента. Кроме того, внешняя сторона иглы должна быть протерта перед каждым использованием, а избыток раствора сахарозы должен быть удален из просвета, чтобы обеспечить целостность каждого градиентного слоя. Ночное хранение градиентов при 4 °C должно производиться в холодном помещении. Вибрации, вызванные включением и выключением компрессора в холодильнике, могут нарушить градиент.
Другой важной частью этого анализа является объем градиента и концентрация РНК. Центрифужные трубки размером 14 мм x 89 мм могут вмещать объем 12 мл, но это максимальный объем, который может быть размещен этими трубками, и этот объем обычно рассматривается как переполнение этих трубок. Хороший максимальный рабочий объем, который не переполняет эти трубки, составляет 11,5 мл. Сам градиент сахарозы имеет объем 10 мл; поэтому объем буфера экстракции полисом, используемого для повторного суспендирования клеток, не должен превышать 1,5 мл. Количество РНК, необходимое для создания хорошего профиля, будет варьироваться в зависимости от типа клетки. Следует выполнить ряд начальных прогонов, чтобы определить, какое количество РНК генерирует хороший полисомный профиль. Как только это количество определено, его всегда следует использовать с этим конкретным типом клеток, чтобы поддерживать воспроизводимость и иметь возможность проводить сравнительный анализ. Кроме того, чтобы гарантировать, что одно и то же количество РНК загружается каждый раз, метод, используемый для количественного определения РНК, всегда должен быть одинаковым. Если спектрофотометр используется для количественного определения РНК, то он должен использоваться в любое время. Если используется флуорометр, то его следует использовать постоянно. Приборы и методы количественного определения широко различаются как по точности, так и по чувствительности. Использование различных инструментов или методов для количественного определения эксперимента с РНК не даст воспроизводимых результатов.
Этот метод может быть адаптирован для получения важной информации о состоянии трансляции белка в клетке. Как уже упоминалось выше, можно определить состояние самих рибосомных субъединиц в процессе сборки. Проведение экспериментов в отсутствие циклогексимида, который ингибирует удлинение, позволяет проводить анализ скорости стока, который показывает, изменяется ли удлинение или нет26. Отдельные фракции являются ценным источником материала для дальнейших экспериментов и анализа. Например, фракции могут быть использованы в северных или западных протоколах блоттинга для идентификации конкретной РНК или белка, связанного с рибосомными субпопуляциями. Наконец, РНК может быть извлечена из фракций и использована для идентификации мРНК, связанных с активными рибосомами, путем анализа микрочипов13,27 или путем глубокого анализа секвенирования на библиотеке ДНК, сгенерированной из общей мРНК28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят доктора Перси Тумбале и доктора Мелиссу Уэллс за их критическое прочтение этой рукописи. Эта работа была поддержана Программой внутренних исследований Национального института здравоохранения США; Национальный институт наук о гигиене окружающей среды США (NIEHS; ZIA ES103247 к R.E.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- Liang, S., et al.
- Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
- Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
- Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
- Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
- Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
- Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
- Bassler, J., Hurt, E.
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
- Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).
- Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
- He, S. L., Green, R.
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).
