Summary
这里描述了详细的分步方案，用于使用多能O9-1神经嵴细胞和不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶 在体外 研究机械信号。
Abstract
神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物胚胎多能细胞，可以迁移和分化成各种细胞类型，从而产生各种器官和组织。组织刚度产生机械力，这是一种在NCC分化中起关键作用的物理线索;然而，机制仍不清楚。这里描述的方法为优化生成具有不同刚度的聚丙烯酰胺水凝胶，精确测量这种刚度以及评估O9-1细胞中机械信号的影响提供了详细信息，O9-1细胞是一种模拟 体内 NCC的NCC系。
使用原子力显微镜（AFM）测量水凝胶刚度，并相应地指示不同的刚度水平。在不同硬度的水凝胶上培养的O9-1 NCCs表现出不同的细胞形态和应激纤维的基因表达，这表明机械信号变化引起的生物学效应不同。此外，这确定了改变水凝胶刚度导致有效的 体外 系统，通过改变凝胶刚度和分析NCC中的分子和遗传调节来操纵机械信号传导.O9-1 NCCs可以在相应分化介质的影响下分化成广泛的细胞类型，并且便于 在体外操纵化学信号。因此，这种 体外 系统是研究机械信号传导在NCC中的作用及其与化学信号相互作用的有力工具，这将有助于研究人员更好地了解神经嵴发育和疾病的分子和遗传机制。
Introduction
神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物胚胎发生过程中的一组干细胞，具有显着的迁移能力，有助于各种器官和组织的发育。NCCs可以分化成不同的细胞类型，包括感觉神经元，软骨，骨骼，黑素细胞和平滑肌细胞，这取决于轴向起源的位置和NCC1，2的局部环境引导。由于能够分化成多种细胞类型，在神经嵴（NC）发育的任何阶段引起失调的遗传异常都可能导致许多先天性疾病2。例如，NCC形成，迁移和发展过程中的扰动导致发育障碍，统称为神经性心脏病1，3。这些疾病的范围从由于NCC形成失败而导致的颅面缺陷，例如Treacher Collins综合征，到由于NCC转移性迁移能力引起的各种癌症的发展，如黑色素瘤3，4，5，6所示。在过去的几十年里，研究人员对NCC在发育和疾病中的作用和机制有了非凡的发现，大多数发现都集中在化学信号7，8上。最近，机械信号已被证明在NCC开发9，10中发挥了关键但知之甚少的作用。
NCC的环境线索在其发育过程中起着至关重要的作用，包括调节NCC分化成各种细胞类型。环境线索，例如物理线索，影响关键行为和细胞反应，如功能多样化。机械转导允许细胞感知并响应这些线索，以维持各种生物过程2。NCCs被邻近细胞和不同的底物包围，例如细胞外基质（ECM），其可以产生机械刺激以维持体内平衡并通过命运决定，增殖和凋亡来适应变化11。机械转导从发生机械细胞外刺激的感觉成分的质膜开始，导致细胞12的细胞内调节。整合素、局灶粘附和质膜的连接将机械信号（如剪切力、应力和周围基质的刚度）传递到化学信号中，以产生细胞响应12。化学信号从质膜到最终细胞调节的传递是通过不同的信号通路进行的，以最终确定生物体的重要过程，例如分化。
一些研究表明，来自底物刚度的机械信号在细胞分化中起作用13，14。例如，先前的研究表明，在软底物上生长的间充质干细胞（MSCs）具有类似于脑组织的刚度（在0.1-1.0 kPa的范围内）导致神经元细胞分化15，16。然而，当在模仿肌肉硬度的8-17 kPa底物上生长时，更多的MSCs分化成肌细胞样细胞，而当MSCs在坚硬的底物（25-40 kPa）上培养时观察到成骨细胞样分化15，16。机械信号通路中的不规则和异常突出了机甲转导的重要性，这些异常和异常可能导致严重的发育缺陷和疾病，包括癌症，心血管疾病和骨质疏松症17，18，19。在癌症中，正常的乳房组织是柔软的，并且在僵硬和致密的乳房组织中患乳腺癌的风险增加，这种环境更类似于乳腺肿瘤15。有了这些知识，可以通过体外系统对底物刚度的简单操作来研究机械信号传导对NCC发展的影响，为理解NC相关疾病进展和病因的基本原理提供了进一步的优势和可能性。
为了研究机械信号对NCC的影响，我们基于先前发表的方法的优化和对NCC对不同机械信号的响应的评估，建立了一个有效的NCC体外系统20，21。为改变水凝胶刚度制备和评估机械信号传导在NCC中的影响提供了详细的方案。为了实现这一点，使用O9-1 NCCs作为NC模型来研究对刚性水凝胶与软水凝胶的反应和变化。O9-1 NCCs是在第8.5天从小鼠胚胎（E）中分离出来的稳定NC细胞系。O9-1 NCCs在体内模仿NCC，因为它们可以在定义的分化培养基22中分化成各种NC衍生的细胞类型。为了研究NCC的机械信号传导，从不同浓度的丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液中制备具有可调弹性的基质基质，以达到所需的刚度，与生物底物刚度20，21，23相关。为了优化NCC，特别是O9-1细胞的基质底物的条件，对先前发表的方案20进行了修改。该协议中的一项更改是在37°C下将水凝胶在胶原I中孵育，用0.2%乙酸稀释而不是50mM HEPES过夜。乙酸的低pH值导致均匀分布和更高的胶原I掺入，从而允许ECM蛋白24更均匀地附着。此外，在将水凝胶储存在培养箱中之前，分别在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中以10%和5%的浓度使用马血清和胎牛血清（FBS）的组合。马血清被用作FBS的额外补充，因为它能够在10%25的浓度下促进细胞增殖和分化。
使用这种方法，通过ECM蛋白质包衣（例如胶原蛋白I）模拟生物环境，为NCC的生长和存活创造准确的体外环境20，21。通过原子力显微镜（AFM）定量分析所制备的水凝胶的刚度，原子力显微镜是描述弹性模量26的众所周知的技术。为了研究不同硬度水平对NCC的影响，在水凝胶上培养和制备野生型O9-1细胞，用于免疫荧光（IF）染色，以对抗丝状肌动蛋白（F-actin），以显示细胞粘附和形态的差异响应底物刚度的变化。利用这种体外系统，研究人员将能够研究机械信号在NCC中的作用及其与其他化学信号的相互作用，以更深入地了解NCC与机械信号之间的关系。
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Protocol
1. 水凝胶制备
注意：所有步骤必须在细胞培养罩中执行，该培养罩在使用前已用乙醇和紫外线（UV）灭菌消毒，以保持无菌性。工具，如镊子和移液器，必须喷洒乙醇。缓冲液也必须经过无菌过滤。
- 氨基硅烷镀膜玻璃盖玻片的制备
- 将所需数量的玻璃盖玻片放在一块实验室擦拭布上。
注：准备额外的 3-4 个盖玻片，以确保有足够的备用电源，因为它们很容易断裂。不同材质的玻璃盖玻片会产生不同的细胞接种和附着相容性。在开始实验之前，最好确定哪种类型最适合实验（见 材料表）。 - 使用酒精燃烧器或本生燃烧器通过火焰来回传递每个盖玻片来灭菌（蛋白质测定实验为30秒）。将每个玻璃盖玻片放在实验室湿巾上以冷却。
- 一旦玻璃盖玻片冷却下来，将它们转移到衬有parafilm的培养皿上，以防止滑移。
注意：如果盖玻片不够冷，残余热量会将parafilm熔化到滑移上，使其无法使用。 - 用约200 μL和800 μL的0.1 M NaOH分别覆盖盖玻片，分别为12 mm和25 mm盖玻片，并让它们静置5分钟。然后，吸出0.1 M NaOH，让盖玻片再风干5分钟，形成均匀的薄膜。
- 盖玻片干燥后，分别移液约80μL和150μL3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS）12 mm和25 mm盖玻片。小心避免溶液溅到胶片上。让溶液静置5分钟。
- 尽可能多地吸出多余的APTS，并让残留的APTS干燥5分钟。通过将盖玻片浸没在无菌的去离子（DI）H2O中，每次冲洗3次，每次5分钟。
注意：如果玻璃盖玻片冲洗不当，残留的APTS会导致戊二醛发生不必要的反应，导致形成白色沉淀物并导致盖玻片无法使用。 - 将盖玻片移动到新的培养皿中，反应性面朝上。在培养皿中加入足够的0.5%戊二醛，以完全覆盖盖玻片，并让盖玻片静置30分钟。
- 抽吸0.5%戊二醛，并在DI H2O中再次冲洗盖玻片一次3分钟。使用前，将盖玻片反应面朝上放在实验室湿巾或干净的培养皿上，使其完全风干。
注意：协议可以在此处暂停;盖玻片必须置于无菌DI H2O中，直到使用。
- 将所需数量的玻璃盖玻片放在一块实验室擦拭布上。
- 硅化盖玻片的制备
- 将与氨基硅烷涂层盖玻片相同数量的盖玻片（步骤1.1.1）放入衬有副膜的培养皿中。
- 将40μL或150μL分别取12mm和25mm盖玻片二氯甲基硅烷（DCMS）移液到盖玻片的一侧，并让溶液静置5分钟。
- 从盖玻片中吸取任何剩余的溶液，在无菌的DI H2O中洗涤一次1分钟，然后将反应性盖玻片正面朝上放在实验室擦拭布上，以风干，然后再进行下一步。
- 制备水凝胶
- 将丙烯酰胺，双丙烯酰胺和DI H2O混合在1.5 mL离心管中，以制备具有不同刚度的500μL溶液（见 表1）。涡旋溶液30秒以使其彻底混合。
- 迅速工作，将10%过硫酸铵溶液（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）加入管中，并再次涡旋溶液以混合溶液。
注意：由于其敏感的冷冻/解冻循环，准备新鲜的10%APS并将其放在冰上或冷冻成一次性等分试样。 - 将约33μL或100μL溶液分别移液到干燥的12mm或25mm氨基硅烷包被的盖玻片上（第1.1节）。
- 使用弯曲的镊子，立即将DCMS处理的盖玻片放在凝胶溶液的顶部，处理后的一面接触凝胶溶液，从而将凝胶溶液夹在DCMS处理的盖玻片和氨基硅烷包被的盖玻片之间。
- 让凝胶溶液聚合5-15分钟，同时主动监测管中剩余溶液的凝胶聚合。
- 凝胶聚合后，用弯曲的镊子或剃须刀片分离DCMS处理的盖玻片，使凝胶附着在原始氨基硅烷包覆的盖玻片上。
- 立即将盖玻片与附着的水凝胶一起置于预定的4孔/ 24孔和6孔板中，分别覆盖有500μL和2 mL无菌PBS或DI H2O，分别用于12 mm和25 mm盖玻片，以防止凝胶变干。
- 对所有封面重复步骤 1.3.4-1.3.7。
- 将水凝胶浸没在无菌PBS或DI H2O中30分钟，以除去多余的丙烯酰胺溶液。将水凝胶储存在4°C的无菌PBS或DI H2O中，以便在此处进行程序停止。
- 在黑暗的房间里，通过将2.5 mL的50 mM 2-[4-（2-羟乙基）哌嗪-1-基]乙烷磺酸（HEPES）（pH = 8.5）与25μL的50μg/ mL磺酸混合，制备磺基琥珀酰亚胺基6-（4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基）己酸酯（磺基-SANPAH）混合物，用锥形管包裹在铝箔中以防光。使用前使用移液器将溶液混合均匀。
注意：2.5 mL磺基SANPAH溶液的体积足以容纳约25个12 mm水凝胶或5个25 mm水凝胶。 - 从孔板中抽吸PBS或DI H2O。分别加入约100 μL或500 μL磺基-SANPAH溶液（步骤1.3.10）以覆盖凝胶的12 mm和25 mm盖玻片。确保溶液完全覆盖凝胶。
注意：调整真空吸力，以防止强力撕裂或干扰水凝胶。 - 将含有溶液的凝胶置于15 W，365nm紫外光下10分钟，不加盖以尽量减少紫外光与磺基-SANPAH反应的任何干扰。
- 通过倾斜板来吸出多余的磺酸-SANPAH，以收集尽可能多的溶液。用50 mM HEPES洗涤凝胶两到三次。
- 将500μL和2mL分别用于12mm和25mm凝胶的50mg / mL胶原蛋白I稀释在0.2%乙酸中到每个含有水凝胶的孔中。让凝胶在37°C，5%CO2 培养箱中孵育过夜。
注意：将胶原蛋白I稀释在0.2%乙酸中，而不是50 mM HEPES中，以促进胶原蛋白I的均匀分布和附着。 - 吸出胶原蛋白I并用无菌PBS洗涤凝胶三次，以去除多余的胶原蛋白I，每次洗涤5分钟。将水凝胶在PBS中孵育10%马血清，5%FBS在37°C，5%CO2 培养箱中2小时。
注意：与仅使用FBS（如先前出版物中所做的那样）相比，添加10%的马血清可促进更高的增殖。 - 吸出培养基。向每个孔中加入500毫升无菌过滤的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM），其中含有10%FBS和1%青霉素 - 链霉素（P / S）。将凝胶储存在37°C，5%CO2 培养箱中，直到准备好进行细胞培养。
- 准备就绪后，在培养皿中的基底培养基中×约104 个O9-1细胞/ cm2。 将细胞在37°C，5%CO2的培养箱中孵育2天。检查细胞的汇合度，以确保细胞充分附着在凝胶上，并且在收集进行分析之前细胞数量足够。
注意：参见先前发布的方案，了解O9-1细胞的恢复，传代和收集的步骤20。 - 进入第2，3或4部分以进一步分析水凝胶。
2. 通过AFM进行刚度定量分析
- 启动AFM系统计算机，然后启动AFM控制器（请参见 材料表）。
- 将AFM悬臂安装在AFM探头支架上。使用球形悬臂，在悬臂末端安装有0.5μm硅微珠（带有球形珠的悬臂）。
注意：对于更硬的水凝胶，例如10 kPa，20 kPa和40 kPa，使用更坚硬的探头，弹簧常数为0.24 N / m。较软的探针用于较软的水凝胶，例如0.5 kPa和1 kPa，弹簧常数为0.059 N / m。 - 将AFM软件设置为 接触模式。
- 将硅晶圆安装到AFM样品台上，通过单击 悬 臂接触硅衬底来收集力曲线，从而产生力曲线。
- 使用上面的力曲线（2.4）进行校准，单击控制软件中的 校准 ，获得热调谐条件下悬臂的平均弹簧常数，并将校准值保存在控制软件中。
- 通过将盖玻片与附着的水凝胶一起放入60 mm培养皿中到AFM扫描台上来安装样品。在进行测量之前，将3 mL PBS加入培养皿中，以防止凝胶变干。
- 将AFM设置为在 接触模式 （流体）下工作以开始测量。啮合球形珠以连续触摸和提起凝胶样品。
- 设置悬臂，使其偏转阈值保持在 10 nm。将探头的斜坡尺寸保持在10μm。然后，记录力曲线，如步骤2.4所示。
- 从水凝胶表面的至少3到10个不同点获得至少20个力曲线。
- 使用AFM成像和分析软件计算每个点的平均杨氏模量约20条力曲线。使用延伸斜坡力曲线和线性化模型（球面）。计算每个样品的所有斑点的平均值，以产生最终的刚度。
注：杨氏模量和相关数据（即 标准偏差）会自动保存为电子表格。 - 对所有样本重复步骤 2.6-2.10。
3. 通过免疫荧光染色进行刚度的分子分析
- 使用镊子将盖玻片输送到新板上，以最大限度地减少直接生长到板上的细胞的错误信号。用500μL无菌PBS洗涤细胞三次，以除去死细胞和任何剩余的培养基。
- 使用500μL4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞10分钟，不受干扰。然后，使用500μLPBS /孔重新洗涤细胞三次，每次2分钟。
注意：储存在4°C下，以便程序停止。 - 在室温下用500μL0.1%Triton X-100处理细胞15分钟。然后，用500μLPBS /孔洗涤细胞三次。
- 在室温下用250μL10%驴血清（在PBS中稀释和0.1%吐温20）每孔阻断细胞30分钟。
- 用250μL一抗孵育细胞在室温下孵育2小时或在4°C下过夜。 然后，用500μLPBS /孔洗涤细胞三次，每次5分钟。
注意：本实验中使用了抗长春花素（Vcl）（1：250）和抗AP2α（1：250），并稀释在10%驴血清中。 - 用相应的二抗和/或用于F-肌动蛋白染色的细胞在室温下以1：400的稀释液在250μL10%驴血清中孵育30分钟。然后，用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。
注意：568 nm 的 Phalloidin 可与 488 nm 或 647 nm 的二抗共育或单独孵育。 - 用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，1：1000稀释）在250μLPBS中孵育细胞10分钟，然后最后一次洗涤PBS2分钟。
- 向每个孔中加入3-4滴安装介质。在成像之前，将样品在4°C下放置至少2小时，以确保安装介质已正确设置。
- 使用荧光显微镜捕获每个水凝胶样品至少3个随机帧的图像，产生单个和合并的通道。
4. 实时荧光定量 PCR （RT-qPCR）
- 将带有贴壁细胞的水凝胶转移到新板中以进行RNA收集，以最大限度地减少附着在细胞板上的细胞中不需要的RNA。用PBS洗涤细胞三次以除去死细胞和培养基。
- 使用RNA提取试剂盒提取总mRNA。按照制造商的说明，使用逆转录超混合体将RNA逆转录到cDNA。
- 使用 Vcl 引物作为首选刚度标志物进行RT-qPCR，并使用2-ΔΔCT 方法进行分析。
注：Vcl的引物序列：向前5'GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3';反向 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.
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Representative Results
通过AFM和赫兹模型进行水凝胶制备和刚度评估
在这里，提供了详细的方案，通过调节丙烯酰胺和双丙烯酰胺的比例来生成不同刚度的聚丙烯酰胺水凝胶。然而，由于缺乏ECM蛋白，聚丙烯酰胺水凝胶尚未准备好粘附细胞。因此，作为连接剂的磺胺-SANPAH与水凝胶共价结合并与ECM蛋白的伯胺反应，以允许ECM蛋白在UV活化后通过磺基-SANPAH中的 N-羟基琥珀酰亚胺酯粘附到水凝胶表面。I型胶原蛋白被用作首选的ECM蛋白，以有效促进O9-1细胞附着。为了确保不同水凝胶的刚度值准确，使用AFM进行了刚度评估，这是一种描述弹性模量的众所周知的技术。
在成功形成聚丙烯酰胺水凝胶并将其附着到玻璃盖玻片上后，凝胶仍然粘附在盖玻片上，表面均匀，撕裂最小。基于压痕技术原理的AFM测量刚度，其中将刚性压头施加到样品上，所需力以达到压痕深度26。通过这种测量，杨氏弹性模量是根据赫兹模型中深度和力的压痕计算的，弹性理论26。然而，由于AFM的结果差异很大，因此应用了一种额外的统计方法，以获得对凝胶溶液26的不平坦表面和不完全均匀性的影响最小的定量结果。为了使用AFM进行定量测量，从凝胶样品上的每个位置收集了至少50条力和距离曲线，以获得平均样品刚度。施加在高刚度凝胶上的力高于施加在较软凝胶上的力，表明较硬的底物在力与Z图中产生了更陡峭的斜率，其中力以nN为单位测量，Z表示压头和样品之间的压痕深度。
在软水凝胶上，产生的力曲线的斜率是温和的，因为来自AFM探针所需的力较小（图1A）。然而，在刚性水凝胶上，例如模量为40 kPa的水凝胶，由于施加的力高于较软的凝胶，因此产生的斜率要陡峭得多（图1B）。随着探针和水凝胶样品之间的距离减小，当探针尖端接触玻璃盖玻片时，曲线显着增加。然而，随着分离距离的增加，曲线仅接近0，因为不存在施加的力。
如图 1A所示，AFM探头上的悬臂接近凝胶，用蓝线表示，探头测量穿透凝胶样品并最终到达玻璃盖玻片所需的力，导致力突然增加。由于可能的程序和仪器错误，例如所需溶液的质量，水凝胶样品的真实刚度变化很大，并且与所需的刚度相差很大。因此，AFM是验证和确认方法的有用工具，同时防止在进一步的实验中出现错误的数据。
在AFM评估中，通过定量方法测量了五种制备的水凝胶样品。该协议侧重于0.5 kPa，1 kPa，10 kPa，20 kPa和40 kPa的水凝胶刚度水平，模拟了各种细胞类型分化的生物底物刚度水平的广度。利用从AFM测量中获得的力曲线，使用AFM分析算法软件生成以千帕斯卡为单位的杨氏弹性模量（图2）。
聚丙烯酰胺水凝胶体系和细胞类型的比较
Tse及其同事对原始方案的这种改编为使用O9-1细胞20研究NCC的机械敏感性方面提供了一种高效且有效的方法。对先前方案的修改包括修改ECM蛋白孵育：用0.2%乙酸代替50mM HEPES，并加入10%马血清和FBS用于细胞培养（步骤1.3.14-1.3.15）。通过比较该改性凝胶体系上O9-1 NCCs的生长和维持与原始（对照）方案中的O9-1 NCC来验证这些修饰。在这里，我们在基底培养基中每个系统的弹性模量为1 kPa和40 kPa的两个水凝胶体系上培养野生型O9-1细胞。使用明场光学显微镜可视化整体细胞生长状态和发育，以观察凋亡特征，胁迫形态和细胞附着在水凝胶上。在原始凝胶体系上生长的O9-1细胞导致死细胞数量增加，表明1 kPa和40 kPa水凝胶的圆形细胞过量（图3E，F）。
相比之下，在修饰的凝胶系统上生长的O9-1细胞表现出健康的细胞生长和对水凝胶底物的充分附着（图3G，H）。此外，通过对NCC标记物Tcfap2α（AP-2）进行IF染色来评估NCC与改性水凝胶体系的相容性。AP-2是NC谱系中表达的转录因子，用于调节小鼠胚胎的发育，因此适合于评估相容性27。尽管在对照和修饰的水凝胶体系上生长的O9-1细胞都表达AP-2，但接种在修饰水凝胶体系上的O9-1细胞中的AP-2表达显着增加，如更强的荧光信号和相应的定量所示（图4A，B）。
此外，P19细胞用于进一步验证修饰的水凝胶系统对细胞生长的益处。P19是一种胚胎癌细胞系，来源于小鼠28中的胚胎来源的畸胎癌。使用相应的培养方案，P19细胞在对照和修饰的水凝胶体系上生长，以监测存活和生长特性。明场成像显示，在两个水凝胶系统上接种的P19细胞显示出过量的圆形漂浮细胞和缺乏细胞 - 底物附着物（图3A-D）。该观察结果表明，改进后的方案更适合O9-1 NCCs研究NCC中的机械信号传导。
在刚性基板上显示高应力纤维表达
修饰的水凝胶允许定量和定性分析在不同刚度水平的凝胶和其他效应器上培养的细胞形态的差异。一旦水凝胶准备好进行细胞接种，野生型O9-1细胞被传代到不同硬度水平的水凝胶上。通过观察细胞的形状，空间扩散，甚至附着在具有最少死细胞的水凝胶上的细胞来监测细胞的健康和生长。一些研究表明，在高刚度基质上生长的MSCs的应力纤维和细胞附着力增加，这表明与在较软基质上生长的NCC相比，在较硬基质上生长的NCC也表现出类似的发现29，30。
F-肌动蛋白与肌球蛋白II，α肌动蛋白和其他细胞骨架蛋白统称为应激纤维31。先前的研究观察到应力纤维组件的增加响应于机械力的增加31。在应力纤维的一端或两端，与焦点粘附复合物的附着使细胞能够迁移并粘附在ECM31上。用于可视化NCC中F-肌动蛋白表达和组织的鬼臼染色显示出响应机械信号传导的健康细胞生长（图5）。此外，在低刚度或高刚度水凝胶上生长的O9-1细胞通过不同数量的应力纤维表现出不同的形态（图5）。与使用MSCs进行的报告研究的观察结果类似，观察到在更硬的底物（40 kPa）上生长的O9-1细胞表现出更多的应力纤维，并且与在较软的水凝胶上生长的细胞相比分布良好，由1 kPa硬度29，30表示。
细胞粘连评估
为了进一步证实底物刚度变化影响NCC粘附的假设，通过RT-qPCR定量测量了NCC中 Vcl 表达的变化，这些NCC响应不同的水凝胶刚度水平。Vcl是在细胞与底物建立接触并传感ECM特性的过程中存在于局灶性粘附复合物中的众多细胞骨架蛋白之一32。局灶性粘连是细胞通过整合素受体与ECM的接触点，其锚定在细胞质肌动蛋白细胞骨架，F-肌动蛋白33 Vcl 基因表达水平表明O9-1细胞的局灶性粘附和细胞粘附的变化响应底物刚度。
先前的研究表明，Vcl通过其表达的差异对胚胎干和成纤维细胞中的细胞粘附的影响。为了响应Vcl的高表达，局灶粘连的数量和大小也增加，但当Vcl被击倒时减少34。一致地，Vcl缺陷细胞也显示出细胞粘附和扩散的显着降低35。此外，Vcl通过稳定局灶性粘连在调节细胞粘附中起作用36。局灶性粘附的大小，成熟水平和组合物根据底物刚度而变化，从而允许在细胞内转导信号并且细胞响应其环境线索37。因此，Vcl被高度招募到生长在坚硬底物上的细胞中的局灶性粘附复合物中，正如RT-qPCR检测到的更高的mRNA水平所反映的那样（图6C）。
在较软的底物上生长的细胞形成最小的局灶性粘附复合物，如细胞中Vcl的较低mRNA水平所反映的那样15。在图6C中，O9-1细胞在刚性底物上的Vcl表达高于在软基质上。这些结果表明，与软质底物上的O9-1细胞相比，O9-1细胞在刚性底物上的细胞底物粘附水平更高。此外，通过抗Vcl抗体的IF染色，Vcl表达被定性地可视化，以进一步补充和支持RT-qPCR发现。一致地，在较硬底物上生长的O9-1细胞中的Vcl表达高于在较软底物上生长的细胞（图6A，B），这进一步支持了在40 kPa水凝胶上高细胞粘附和扩散的初始发现，与通过RT-qPCR观察到的F-肌动蛋白鬼臼素染色和Vcl表达水平相比，1 kPa水凝胶。
图1：AFM探头压痕产生的力曲线。 力（y 轴）表示在 nN 中施加的所需力，Z（x 轴）表示布鲁克 AFM 探头与样品的距离（以 μm 为单位）。对于1 kPa水凝胶（A），生成的斜率是温和的，而40 kPa水凝胶（B）观察到的斜率较陡。彩色曲线表示AFM探针上的悬臂在接近（蓝色）和从水凝胶样品中缩回（红色）时的运动。曲线的最高起点表示玻璃盖玻片的刚性接触。（B） 在40 kPa水凝胶中缩回曲线中的大倾角表明珠子与样品之间的粘附。缩写：AFM =原子力显微镜。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：根据杨氏弹性模量计算的水凝胶的平均刚度（以kPa为单位）。 杨氏模量是从 图1中的力曲线生成的。水凝胶的参考弹性模量为0.5 kPa、1 kPa、10 kPa、20 kPa和40 kPa。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：接种在1 kPa和40 kPa水凝胶上的P19和O9-1细胞的明场图像，以检测细胞生长特性。死细胞由红色箭头表示。比例尺 = 25 μm。请单击此处查看此图的放大版本。
图4：在O9-1 NCCs中对NCC标记AP-2进行免疫荧光染色，以可视化NCC相容性。 AP-2（绿色）;用DAPI（蓝色）染色细胞核。比例尺 = 25 μm.（C） 条形图提供 AP-2 表达式水平的量化，显示显著性 （p值 = 0.003） （n = 3）。数据显示具有提供的标准偏差误差线的相对表达式。缩写： NCC = 神经嵴细胞;DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：F-肌动蛋白的荧光鬼脸碱染色显示应力纤维在40 kPa水凝胶上的O9-1细胞中很好地分布。 O9-1细胞在1千帕（A）和40千帕水凝胶（B）上培养。使用Alexa Fluor 488 Phalloidin（绿色）染色O9-1细胞，并用DAPI（蓝色）染色细胞核。比例尺 = 25 μm。缩写：DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：O9-1细胞中长春花素的免疫荧光图像。 O9-1细胞接种在1千帕（A）和40千帕（B）水凝胶上。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 25 μm. （C） 实时定量荧光定量PCR分析在1 kPa和40 kPa水凝胶上培养的O9-1细胞中 Vcl 的总mRNA水平。1 kPa水凝胶上的Vcl表达水平显着低于40 kPa水凝胶上的Vcl表达水平（p值= 0.02）。数据显示提供的标准偏差误差线的平均值。缩写：DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 500 μL 总体积 | 0.5 千帕 | 1 千帕 | 10 千帕 | 20 千帕 | 40 千帕 | ||
| 40%丙烯酰胺（μL） | 37.5 | 62.5 | 125 | 100 | 100 | ||
| 20% 双丙烯酰胺（μL） | 15 | 7.5 | 25 | 66 | 120 | ||
| H2O （μL） | 447.5 | 430 | 350 | 334 | 280 | ||
| 10% APS （μL） | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | ||
| 透射电（μL） | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
表1：获得所需刚度水平的相应溶液体积。
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Discussion
本研究的目标是提供一种有效和高效的 体外 系统，以更好地了解机械信号对NCC的影响。除了遵循上述分步方案外，研究人员还需要记住，O9-1 NCC的细胞培养受到用于制备水凝胶的玻璃盖玻片类型的影响。例如，有人指出，接种在特定类型的玻璃盖玻片上的细胞（见 材料表）存活并增殖良好，而接种在其他类型的玻璃盖玻片上的培养细胞显示出更多的细胞死亡。此外，严格遵循O9-1 NCCs38的正确细胞培养条件也很重要。当尽快使用水凝胶或在无菌的37°C培养箱中储存长达两天时，细胞培养的质量是最佳的。
由于实验方案中每个组分的敏感性，弹性模量可能因实验而异。除了协议（步骤1.3.2）中提到的关于10%APS的要点外，要记住的其他关键因素也会影响变化。另一个被怀疑导致AFM测量发生巨大变化的因素是水凝胶的厚度。之前的一项研究调查了厚度对杨氏模量的影响，范围从15到1000μm，并发现厚度的差异并没有显着改变杨氏模量39。然而，底物的厚度也会影响细胞可以感知的机械性能，导致不同的形态40，41，42。各种研究表明，水凝胶厚度的显着增加导致水凝胶40，41，42的细胞面积，扩散和有效刚度的减少。然而，细胞的表型也响应于显着的薄水凝胶而变化，例如，即使在低硬度水凝胶40，41，42上也具有更高的扩散性。对于体积一致的聚丙烯酰胺凝胶，水凝胶的厚度应均匀，因此轻微的偏差不会显着影响AFM测量中的弹性模量。
最好使用酒精燃烧器在火焰中来回传递盖玻片，因为其他灭菌方法可能更复杂，并且对玻璃盖玻片造成潜在损坏。根据实验要求，可以使用不同尺寸的玻璃盖玻片。该方案分别使用12 mm和25 mm盖玻片进行免疫组化和RT-qPCR。使用适当大小的凝胶来适应实验，可以提高效率并最大限度地减少浪费。这些修饰经过定性和定量验证，以确保与原始（对照）水凝胶系统20相比，O9-1 NCCs的优化。在明场显微镜下评估O9-1 NCCs的整体健康和生长，以确定细胞和底物附着特征。
此外，比较了对照组和修饰的水凝胶系统之间O9-1细胞的相容性，以通过使用IF染色定性可视化AP-2表达来进一步验证该方案中的修饰。量化信号的强度以进一步支持对照组与修饰的水凝胶系统之间O9-1细胞中AP-2表达的代表性图像。虽然AP-2是一种常见的NCC标记，但必须考虑其他众所周知的标记进行验证，例如Sox10和Pax3，因为它们对NCC维持多能性和生存28具有重要意义。此外，通过将O9-1 NC细胞与另一种细胞系P19进行比较，进一步证实了该方案中的优化，以确保该水凝胶系统对于NC细胞是高效可靠的。尽管P19细胞具有不朽的特征并且易于培养，但它们在任何一种水凝胶系统上都不能很好地茁壮成长。
对基质或细胞附着的组织刚度产生的伸长力的抵抗力通常表示为杨氏弹性模量45。使用AFM，杨氏弹性模量是从施加的垂直力26产生的力曲线中获得的。在AFM测量过程中，测量之间可能会发生很大的变化，这可能导致更硬的水凝胶读数不准确。不一致可能是由于用于测量的探头不正确造成的。例如，测量 20 kPa 和 40 kPa 水凝胶需要使用具有更高弹簧常数 （k = 0.24 N/m） 的更硬探头。与较软的探头相比，更坚硬的探头允许较低的分辨率;但是，有理由赞成选择更硬的探头，因为太软的悬臂可能会粘附在样品46上。此外，过于柔软的探头具有高灵敏度，会导致来自不需要的颗粒的虚假信号，并导致人为地比真实刚度值低或更高刚度46。此外，必须注意泊松比的准确输入，具体取决于测量材料;这可以在标准化研究中找到，因为这会显着影响数据输出。
此外，AFM用于测量水凝胶的厚度，因为厚度是另一种影响细胞如何感知其环境的机械特性47，42。在各种报道的研究中，观察到在软水凝胶上生长的细胞在"临界厚度"和"临界厚度"下呈圆形，据报道为~2-5μm，具体取决于细胞类型47，42，48。然而，当细胞接种在相同刚度但厚度低于"临界厚度"的水凝胶上时，观察到更高的扩散42，48。对这一有趣发现的潜在解释是，水凝胶的亚临界厚度使细胞能够感知刚性下面的玻璃盖玻片，因为细胞对横向位移施加牵引力47。全刚度水凝胶的平均厚度为342μm，标准偏差为27μm。水凝胶的厚度高于建议的"临界厚度"，并且在400μm以下的测试范围内，这在研究和制造的预制水凝胶中有所报道，使得细胞可以感知水凝胶的不同刚度，而不是下面的刚性玻璃盖玻片42，48。
除AFM定量分析方法外，还通过免疫组织化学对水凝胶进行了定性分析，以研究受O9-1细胞中不同刚度影响的标记物的表达，并可视化细胞的健康生长。细胞质中的F-肌动蛋白通过一组细胞骨架蛋白（例如talin和Vcl）连接到膜结合的整合素，形成局灶性粘附复合物33。细胞中应激纤维的表达也可以通过测量细胞中其他细胞骨架基因的表达来分析，例如talin和integrin，它们可以使用局灶粘附染色试剂盒一起可视化。
不同程度的水凝胶刚度影响了NCC的形态和响应，如通过机械信号传导的细胞粘附和应力纤维的变化所示。该协议提供了通过在体外修改相应的培养条件来影响细胞分化成各种细胞类型的能力，从而提供了一种方便的操作NCC中机械信号和化学信号的方法。如前所述，NCC分化的命运在很大程度上取决于周围组织中存在的机械力，包括其刚度2，3。虽然本文的直接目标是开发一种分步方案来制备用于NCC培养的水凝胶，但该协议的潜在益处超出了方法范围，进一步了解了NCC中的机械信号传导。同样值得注意的是，这种体外系统有一些局限性。这种制造水凝胶的技术包括多个步骤，这些步骤可能会在此过程中引入技术变化，包括异质性，不均匀的表面和不准确的刚度。因此，用户必须仔细执行这些步骤，以尽量减少实验过程中的技术差异。此外，由于丙烯酰胺的毒性，该系统中的聚丙烯酰胺凝胶将研究限制在2D培养上，忽略了NCC所居住的精确的3D生物环境50。
尽管有这些限制，但这种体外系统允许一种廉价而简单的方法，使所有级别的研究受益，并使研究人员能够进行充分和功能性的下游测试。从最近的发现中可以看出，NC严重依赖颅面的机械信号传导（例如剪切力和底物刚度）和化学信号传导（例如Wnt和成纤维细胞生长因子信号传导）以及脊椎动物的心脏发育6，15。使用该协议，可以很容易地模拟用于体外实验的局部微环境，以便将来对NCC进行研究，包括分化，迁移，细胞反应以及有害疾病进展的可能性。因此，该体外系统将成为研究机械信号传导在NCC中的作用及其与其他信号通路相互作用的有力工具，这将加深对NCC发展和相关疾病的分子和遗传机制的理解。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢德克萨斯大学健康科学中心原子力显微镜-UT核心设施的操作员Ana-Maria Zaske博士在该项目中为AFM提供的专业知识。我们还感谢美国国立卫生研究院的资金来源（K01DE026561，R03DE025873，R01DE029014，R56HL142704和R01HL142704给J. Wang）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
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