Нацеливание на кортикоспинальный тракт у неонатальных крыс с двойным вирусным вектором с использованием комбинированной хирургии головного мозга и позвоночника

Summary

Этот протокол демонстрирует новый метод применения генной терапии к субпопуляциям клеток у неонатальных крыс в постнатальном возрасте 5-10 дней путем введения антероградного хемогенетического модификатора в соматодвигательную кору и ретроградно транспортируемой рекомбиназы Cre в шейный спинной мозг.

Abstract

Успешное устранение препятствий, которые сдерживают исследования на неонатальных крысах, важно для изучения различий в результатах, наблюдаемых при детских травмах спинного мозга (SCIs) по сравнению со взрослыми SCIs. Кроме того, надежное введение терапии в клетки-мишени центральной нервной системы (ЦНС) может быть сложной задачей, а неточности могут поставить под угрозу эффективность исследования или терапии. Этот протокол сочетает в себе вирусную векторную технологию с новым хирургическим методом для точного введения генной терапии у неонатальных крыс на послеродовом дне 5. Здесь вирус, спроектированный для ретроградного транспорта (retroAAV2) Cre, вводится в аксонные терминали кортикоспинальных нейронов в спинном мозге, где он впоследствии транспортируется в клеточные тела. Затем в соматодвигательную кору головного мозга вводится дизайнерский рецептор с двойной инвертированной ориентацией (DIO), активируемый исключительно вирусом дизайнерских лекарств (ов) (DREADD). Этот метод двойной инфекции способствует экспрессии DREADD только в коинфицированных нейронах кортикоспинального тракта (CST). Таким образом, одновременная совместная инъекция соматомоторной коры и шейных терминалей CST является допустимым методом изучения хемогенетической модуляции восстановления по моделям цервикальной ТСМ у новорожденных крыс.

Introduction

Хотя ТСМ является относительно редким явлением в педиатрической популяции, она особенно травматична и вызывает постоянную инвалидность, требующую огромного логистического предвидения. Кроме того, более высокая доля детских ВЦИ классифицируется как цервикальная и полная по сравнению со взрослым населением ^1,2. Отличительной чертой всех видов млекопитающих является то, что новорожденные значительно лучше восстанавливаются после ТСМ, чем взрослые, и это дает возможность оценить движущие механизмы восстановления в более молодых популяциях ^3,4,5<....

Protocol

Все следующие хирургические процедуры и процедуры по уходу за животными были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Темпл. Описанный протокол представляет собой операцию по выживанию, и животные были в конечном итоге усыплены путем внутрибрюшинной инъекции 100 мг / кг пентобарбитала натрия по завершении их временных точек.

1. Предоперационная подготовка

1. Подготовьте по крайней мере две вытянутые стеклянные иглы для вирусной инъекции с использованием стеклянных капиллярных пипеток 3,5 нЛ; одна игла для DREADD и одна игла для rCre. В качестве меры предосторожности приготовьте 4-5 игл на случай, если они сло....

Results

Успешная инъекция и транспортировка вирусного вектора должны привести к трансдукции односторонних нейронов в спинном мозге и моторной коре. Рисунок 4 демонстрирует маркировку нейронов слоя V CST в моторной коре коронального отдела мозга, экспрессирующих Cre-dependent-DREADDs-mCherry, совместно вводимых с контралатеральной инъекцией позвоночника rCre. Срезы окрашивали антителом dsRed.

Discussion

Индуцируемая генетическая модуляция мозговой активности инъекционными хемогенетическими модификаторами является мощным инструментом в изучении различных механизмов, лежащих в основе восстановления после ТСМ. Точность нацеливания на индуцируемые рецепторы, связанные с G-белком (DREADD), еще больше повышается, если учесть, что флуоресцентная трассировка подтверждает анатомическую точность в гистологии. В этой статье обсуждается надежный метод изучения того, приводит ли ингибирование или стимуляция выбранных нейронных путей.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 лезвия скальпеля	Roboz	RS-9801-11	Для использования со скальпелем.
#10 Лезвия для скальпеля	Roboz	RS-9801-10	Для использования со скальпелем.
1 мл шприцев	Becton, Dickinson and Company	309659	Для обезболивания SC инъекции и жидкости болюс
4.0 шелковый шов	Ethicon	771-683G	Для закрытия кожи
4.0 Хромовый кетгутовый шов	DemeTECH	NN374-16	Для повторного связывания мышц во время закрытия.
48000 Устройство для снятия фаски с микропипетками	World Precision Instruments	32416	Используется для снятия фаски с кончиков натянутых стеклянных капиллярных трубок с образованием функциональных стеклянных игл.
5% раствор йода	Purdue Products L.P.	L01020-08	Для использования при стерилизации операционного поля.
70% Этанол	Н/Д Н	/Д	Для стерилизации вновь подготовленных стеклянных игл, животных моделей во время хирургической подготовки
Кетамин (Кетасет)	Zoetis	240048	Для удержания животного в правильной плоскости сознания во время операции.
Стерилизатор шариков	CellPoint	5-1450	Для термической стерилизации хирургических инструментов.
Цифровые весы	Okaus	REV.005	Для взвешивания животного во время хирургической подготовки.
Гибкая насадка для игл	World Precision Instruments	MF34G-5	Для очистки стеклянных игл и загрузки красного масла в стеклянные иглы.
Стеклянные капиллярные трубки	World Precision Instruments	4878	Для тянутых стеклянных игл - должны быть рассчитаны на нанолитровые инжекторы.
Гемостаты	Roboz	RS-7231	Для общего применения в хирургии.
Изогнутые щипцы со средней точкой	Roboz	RS-5136	Для общего использования в хирургии.
Микроманипулятор с нониусной шкалой	Kanetec	N/A	Для точного наведения во время операции.
Микроножницы	Roboz	RS-5621	Для резки стекла отсчитываются от только что выдернутых стеклянных капиллярных трубок.
Лабораторный стандартный стереотаксический инструмент	Toelting	51600	Для удержания неонатального стеротаксического держателя на месте
Лабораторный стандарт с мышью и Neonates Adaptor	51615	Для неонатальной фиксации черепа во время черепно-мозговой хирургии и спинальных инъекций
Микроскоп со световой и нониусной шкалой Глазной	Leitz Wetzlar	N/A	Используется для визуализации и измерения скоса вытянутых стеклянных капиллярных трубок в функциональные стеклянные иглы.
Контроллер насоса MicroSyringe	Precision Instruments	62403	Для контроля скорости впрыска.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	Для загрузки и впрыска вирусов контролируемым образом.
Съемник игл	Narishige	PC-100	Для нагрева и раздвигания стеклянных капиллярных трубок с образованием стеклянных игл.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Кре плазмида
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (плазмида #44361)	Брайан Рот В лаборатории с помощью плазмидной парапленки Addgene		DREADD
Bemis		PM-996	Для помощи в загрузке вируса в наноинъектор.
Иглы PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Для использования со шприцами объемом 1 мл и 10 мл для введения в животную модель.
Щипцы для зубов крысы	Roboz	RS-5152	Для захвата остистых отростков.
Красное масло	Н/Д Н	/Д	Для обеспечения фронта для визуализации вируса, проникающего в ткани во время инъекции.
Втягивающие устройства	Roboz	RS-6510	Для удержания открытой операционной раны.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Для удаления мышц позвоночного столба во время операции.
Рукоятка лезвия скальпеля	Roboz	RS-9843	Для разрезания кожи и жировой подушки животной модели во время операции.
Ножницы	Roboz	RS-5980	Для общего использования в хирургии.
Щипцы для снятия скоб	Kent Scientific	INS750347	Для удаления скоб, если они были наложены неправильно.
Стерильная салфетка	Phenix Research Products	BP-989	Для обеспечения стерильной поверхности для проведения операции.
Стерильные аппликаторы с ватным наконечником	Puritan	806-WC	Для впитывания крови в операционной ране при сохранении стерильности.
Стерильная марля	Covidien	2146	Для очистки хирургической области и хирургических инструментов с сохранением стерильности.
Стерильный физиологический раствор	Baxter Healthcare Corporation	281324	Для использования при очистке крови и для замены жидкостей после операции.
Хирургические перчатки	Н/Д	Н/Д	Для использования хирургом для поддержания стерильного поля во время операции.
Хирургическая грелка	Н/Д	/Д	Для поддержания температуры тела животного модели во время операции.
Хирургический микроскоп	Н/Д Н	/Д	Для улучшенной визуализации операционной раны.
Хирургический степлер	Kent Scientific	INS750546	Для наложения скоб.
Прокладка для согревания воды с конвекцией	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Для использования в послеоперационной зоне восстановления для поддержания температуры тела животного, находящегося в бессознательном состоянии.
Утяжеленные крючки	Н/Д	Н/Д	Для удержания открытой операционной раны.
Жидкая повязка	NewSkin	985838	Для наложения на швы после операции и стимулирования заживления ран
Лампа в клетке	ZooMed	LF10EC	Для помощи животным в восстановлении после анестезии и естественном сохранении теплой температуры тела